免疫学实验：多克隆抗体制备-免疫小鼠

多克隆抗体的制备方法

多克隆抗体的制备方法多克隆抗体是由多个不同的免疫细胞（多克隆）产生的抗体混合物，可以识别并结合到目标生物标志物上。

多克隆抗体在科学研究、临床诊断和治疗中具有重要的应用价值。

制备多克隆抗体需要经过一系列复杂的实验流程，下面将详细介绍多克隆抗体的制备方法。

一、抗原的选择在制备多克隆抗体时，首先需要选择一个合适的抗原。

抗原通常是目标生物标志物的蛋白质或多肽片段。

选择抗原的关键因素包括其表达水平、稳定性和纯度。

抗原的选择直接影响到最终多克隆抗体的亲和力和特异性。

二、免疫小动物免疫小动物通常是用于制备多克隆抗体的主要实验动物，例如小鼠、兔子、大鼠等。

在免疫前需要确保小动物健康，并对其进行相应的预处理，如注射驱虫药物、进行适当的接种。

还需要根据具体实验要求决定预免疫、免疫计划以及免疫方案的制定。

三、免疫过程免疫过程是制备多克隆抗体的核心环节。

首先需将抗原与适当的佐剂混合，增强免疫原性，然后用于免疫小动物。

在免疫过程中需要控制免疫剂量和免疫间隔时间，以及监测动物的免疫应答情况。

免疫后还需要定期采集血清样本，监测抗体滴度的动态变化。

四、细胞融合与筛选经过一段时间的免疫后，需要从免疫动物的脾脏或骨髓中收集免疫细胞，然后与肿瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。

随后采用限稀稀释法将杂交瘤细胞进行单克隆化分，筛选出高亲和力的多克隆抗体细胞株。

五、生产与纯化经过筛选的多克隆抗体细胞株需要进行扩大培养，生产足够数量的多克隆抗体。

之后通过蛋白质纯化技术，如亲和层析、离子交换层析等手段，从细胞培养上清液中纯化出多克隆抗体。

六、性质鉴定与应用纯化后的多克隆抗体需进行性质鉴定，包括亲和力、特异性、稳定性等方面的测试。

最后经过滤菌毒处理后，多克隆抗体可应用于科学研究、临床诊断、生物药物研发等领域。

多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，需要科学合理地选择抗原、合理设计免疫方案、熟练掌握细胞融合和筛选技术，以及对多克隆抗体进行严格的生产和性质鉴定。

多克隆抗体制备的基本过程

多克隆抗体制备的基本过程
多克隆抗体制备的基本过程包括以下步骤：
1. 免疫原的选择：选择合适的免疫原，可以是蛋白质、多肽、细胞表面抗原等。

2. 免疫动物的选择：选择适合的免疫动物，常见的包括小鼠、兔子等。

3. 免疫动物的免疫：将免疫原注射到免疫动物体内，刺激其免疫系统产生特异性抗体。

4. 收集免疫动物的血清：在免疫动物免疫一段时间后，收集其血清，其中含有特异性抗体。

5. 分离特异性抗体：通过多种方法如沉淀、层析等技术，将特异性抗体从血清中分离出来。

6. 筛选特异性抗体：对分离出的抗体进行筛选，通常采用ELISA、免疫组化等方法，筛选出特异性较好的抗体。

7. 克隆特异性抗体：将特异性较好的抗体细胞与骨髓瘤细胞（如SP2/0）融合，形成杂交瘤细胞。

8. 杂交瘤细胞的筛选：通过培养基中添加抗代谢毒物质如氨甲酰青霉素（HAT），筛选出只含杂交瘤细胞的细胞。

9. 单克隆抗体的扩增：将筛选出的单克隆细胞进行培养和扩增，得到大量的单克隆抗体。

10. 纯化和鉴定：对单克隆抗体进行纯化和鉴定，确保其纯度和特异性。

11. 应用：获得的多克隆抗体可以应用于免疫组化、免疫沉淀、免疫印迹、免疫荧光等实验和应用中。

需要注意的是，多克隆抗体制备的过程可能因具体实验目的、免疫动物的选择等因素而有所差异。

以上是一般的基本步骤，具体实验过程中还需根据实际情况进行调整和优化。

多克隆抗体制备免疫小鼠 (2)

多克隆抗体制备免疫小鼠简介多克隆抗体制备是一种常用的实验技术，用于获得特定蛋白质及其表位的抗体。

免疫小鼠是多克隆抗体制备的常见动物模型之一。

本文将介绍多克隆抗体制备免疫小鼠的一般流程和关键步骤。

流程多克隆抗体制备免疫小鼠的流程主要包括以下几个步骤：1.抗原制备：准备目标蛋白质作为免疫小鼠的抗原，可以是纯化的蛋白质、重组蛋白质或合成的多肽。

2.免疫小鼠：将抗原与适当的佐剂混合，注射到小鼠体内，观察免疫反应情况。

3.收集抗体：采集小鼠的血液样本，离心分离血清，获得抗体。

4.抗体筛选：使用各种筛选方法（如酶联免疫吸附试验、免疫组织化学染色等）筛选出特异性较好的抗体。

5.抗体纯化：通过亲和层析、离子交换层析等技术，对抗体进行纯化，得到高纯度的抗体。

关键步骤抗原制备抗原制备是多克隆抗体制备的关键步骤之一。

抗原质量的好坏直接影响免疫小鼠及最终制备的抗体的质量。

以下是一些常见的抗原制备方法：•纯化蛋白质：通过基于亲和层析、离子交换层析等技术，从含有目标蛋白质的来源中纯化目标蛋白质。

•重组蛋白质：利用基因工程技术在大肠杆菌或其他表达系统中表达目标蛋白质，然后通过亲和层析或其他纯化方法纯化目标蛋白质。

•合成多肽：合成目标蛋白质的特定片段或多肽，用于免疫小鼠。

适当的佐剂适当的佐剂对于免疫小鼠产生良好的免疫响应非常重要。

佐剂的作用是增强抗原的免疫原性和稳定性，促进免疫细胞的活化。

常用的佐剂包括完全佐剂（如完全弗氏佐剂）和不完全佐剂（如不完全弗氏佐剂）。

免疫小鼠免疫将抗原与适当的佐剂混合后，通过皮下注射、腹腔注射等方式将抗原注射到小鼠体内。

注射后，可以观察小鼠的免疫反应情况，如产生抗原特异性抗体。

血液采集和抗体收集一段时间后，如一般在免疫小鼠体内产生可检测到的抗体，可以采用静脉采血的方式采集小鼠的血液。

血液离心后，就可以获得含有抗体的血清。

抗体筛选和纯化获得含有抗体的血清后，可以使用各种筛选方法对抗体进行筛选，如酶联免疫吸附试验（ELISA），免疫组织化学染色等。

多克隆抗体的制备过程及原理

多克隆抗体的制备过程及原理
多克隆抗体是一种由多个不同的B细胞克隆所产生的抗体，能够识别并结合多个抗原表位。

其制备过程主要包括以下几个步骤：
1. 免疫原的选择：选择目标抗原，可以是蛋白质、多肽、细胞表面蛋白等。

2. 免疫动物的选择：根据抗原的物种来源，选择合适的免疫动物，如小鼠、兔子、山羊等。

3. 免疫动物的免疫：将免疫原注射到免疫动物体内，激发免疫反应。

通常采用多次免疫，间隔一定时间进行。

4. 细胞融合：从免疫动物体内提取免疫细胞，通常采用脾细胞或骨髓细胞。

与骨髓或脾细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。

5. 杂交瘤细胞筛选：采用筛选培养基，筛选出杂交瘤细胞，一般是通过对杂交瘤细胞进行限稀稀释培养，进行单克隆细胞的筛选。

6. 克隆抗体的生产：将单克隆细胞进行扩增，并进行细胞培养，使其产生大量的抗体。

多克隆抗体制备的原理是利用免疫动物的免疫系统产生多个克隆的抗体。

当免疫
原进入免疫动物体内时，会激发免疫细胞产生对应的免疫反应，形成多个不同的克隆细胞。

这些克隆细胞会产生具有不同的抗体结构的抗体分子。

通过细胞融合和杂交瘤筛选的步骤，可以筛选出产生目标抗原特异性抗体的单克隆细胞，并进行大规模生产。

这样就获得了能够结合多个抗原表位的多克隆抗体。

制备多克隆抗体的流程

制备多克隆抗体的流程英文回答：The process of generating monoclonal antibodies involves several steps. Here is a general outline of the procedure:1. Immunization: The first step is to immunize an animal, typically a mouse or a rat, with the specific antigen of interest. The antigen can be a protein, peptide, or even a whole cell. The animal's immune system recognizes the antigen as foreign and mounts an immune response, producing a diverse population of antibodies.2. Cell Fusion: After a sufficient immune response is generated, the next step is to harvest immune cells, usually from the spleen, of the immunized animal. These cells, called B cells, are responsible for producing antibodies. B cells are fused with myeloma cells, a type of cancerous cell line that can divide indefinitely. Thisfusion creates hybridoma cells, which have the ability to produce antibodies and divide indefinitely.3. Selection: The fused cells are then cultured in a selective medium that allows only the hybridoma cells to survive. This medium usually contains a substance that prevents the growth of unfused cells and myeloma cells. The surviving hybridoma cells are then screened for antibody production.4. Screening: Screening involves testing the culture supernatants of the hybridoma cells for the presence of specific antibodies against the antigen of interest. Various techniques can be used for screening, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or immunofluorescence. Positive clones that produce the desired antibodies are selected for further analysis.5. Cloning: To ensure monoclonality, the selected hybridoma cells are subjected to limiting dilution, where single cells are distributed into individual wells of a culture plate. This process allows for the isolation ofindividual clones derived from a single cell. Each clone is expanded and tested for antibody production.6. Antibody Production: The selected monoclonal antibody-producing clones are grown in culture to produce a large quantity of antibodies. The antibodies can be harvested from the culture supernatant or purified using various techniques, such as protein A/G affinity chromatography.7. Characterization: The generated monoclonal antibodies are characterized for their specificity, affinity, and functionality. This involves further testing, such as Western blotting, immunohistochemistry, or flow cytometry, to determine the antibody's ability to recognize the target antigen.8. Scale-up and Production: Once the monoclonal antibodies are characterized, they can be scaled up for production. This involves large-scale culture of the selected hybridoma cells to generate a substantial amount of antibodies for research or therapeutic applications.中文回答：制备多克隆抗体的流程涉及几个步骤。

基因免疫法制备小鼠抗人肝素酶多克隆抗体

பைடு நூலகம்
第 5期李素波 ,等 1基因免疫法制备小鼠抗人肝素酶多克隆抗体
425
pcDNA3. 1 ( + ) 2HPA 为本室构建 [7 ] ;检测用蛋白为本室原核表达的肝素酶 (文章待发表 ) ,肝素酶标准品由李晋萍博士 (瑞典 Upp sala大学 )惠赠 ; 7721、HepG2 细胞均为本研究室保存。 1. 1. 3 主要仪器及试剂仪器有 B io2Rad公司的 550型酶联仪 ;天津理工大学研制生产的 LN 2301型基因脉冲导入仪 ; LB细菌培养基、EL ISA 检测试剂均为本实验室自行配制 ;质粒提取试剂盒购自威格拉斯 (V igorous)生物技术有限公司 ; PVDF膜为 GE公司产品 ; 肝素酶单抗购自 Acris Antibodies GmbH ( PM1319XL ) ; EasySee W estern 标志物为全式金公司产品 ; ECL显色试剂为威格拉斯生物技术有限公司产品 ;蛋白提取试剂盒购自碧云天生物公司。 1. 2 方法 1. 2. 1 免疫 BALB / c小鼠选择 10只 6～8周龄健康雄性 BALB / c小鼠 ,用 75%的乙醇消毒小鼠双侧后肢肌肉 ,注射 50μg pcDNA3. 1 ( + ) 2HPA 质粒溶液 ,将电极针插入小鼠注射部位肌肉 ,给予 6 次单脉冲电刺激 (电压 250 V ,电容 10 μF) ,将小鼠置于冰上 1 ～2 m in,消除电击产热对小鼠的伤害 ,每只小鼠每次免疫的 DNA 剂量均为 50μg。隔 2周免疫 1 次。每次免疫后第 7天采血检测抗体效价。 1. 2. 2 间接 EL ISA 方法的建立按常规间接 EL ISA 操作步骤 ,采用方阵法确定抗原最佳包被浓度、二抗最佳工作浓度、抗原包被条件、封闭液、封闭时间、酶标二抗反应时间、底物反应时间及间接 EL ISA方法阴阳临界值 ,确定蛋白最佳包被浓度为 10μg/m l。 1. 2. 3 肝素酶抗体检测方法采用已建立的 EL ISA 方法检测免疫小鼠血清中抗体的效价。小鼠尾静脉取血 50 μl,离心取上清检测。具体步骤如下 :分别用本室原核表达的肝素酶短片段 (第 72～171位氨基酸 )及不含信号肽的肝素酶长片段 (36～543 位氨基酸 )包被酶联板 ,包被浓度为 10 μg / m l, 4℃过夜 ; PBST ( 20 mmol/L Tris pH 7. 5, 100 mmol/L NaCl, 0. 05% Tween20)洗涤 3遍 ,拍干 , 2% BSA 封闭 , 37℃, 30 m in;弃掉封闭液 ,拍干 ,每孔加入 100 μl稀释的小鼠血清 ,同时设置阴阳性对照 : 阴性对照选择未免疫的正常 BALB / c小鼠血清 ; 阳性对照为商品化单克隆抗体 ( 1 ∶ 2 000) , 37℃, 60 m in; PBST洗涤 3 遍 ,每孔加入 100 μl的 HRP标记的羊抗鼠 IgG (1∶5 000) , 37℃, 30 m in; PBST洗涤 3 遍 ,拍干 ;配制 TMB反应液 (常规方法 ) ,每孔加入 100μl的反应液 ,室温放置 5～10 m in,用 2 mol/L 的 H2 SO4终止反应 ;检测 D450值。实验数据采用两因素析因设计定量方差分析。 1. 2. 4 W estern印迹鉴定抗肝素酶抗体特异性肝素酶标准品经 12% SDS2PAGE分离后 ,转印至 PVDF膜上 ,用含 5% 脱脂奶粉的 TBST对 PVDF膜进行封闭。一抗分别用抗血清 (1∶5 000稀释 )和商品化 HPA 单抗 ( 1∶2 000稀释 )孵育 ,二抗为辣根过氧化物酶 ( HRP)偶联的羊抗鼠 IgG ( 1 ∶5 000 稀释 ) ,使用 ECL 试剂在暗室内曝光、显影、定影。 1. 2. 5 内源性肝素酶鉴定抗肝素酶抗体特异性复苏 7721和 HepG2两种肝癌细胞 ,扩大培养至 5 ×107个细胞 ,收

多克隆抗体的制备流程及原理

多克隆抗体的制备流程及原理
多克隆抗体的制备流程及原理可以参考以下步骤：
1. 抗原免疫：使用目标抗原免疫动物，例如小鼠，在一定时间间隔内多次免疫。

抗原可以是纯化的蛋白质、多肽片段或者细胞/组织提取物。

2. 细胞融合：将免疫小鼠脾脏与骨髓中的浆细胞混合，然后使用聚乙二醇等方法促使细胞融合，获得杂交瘤细胞。

3. 杂交瘤筛选：将杂交瘤细胞悬浮液分别分装于多个培养皿中，含有杀死未融合细胞的培养基中，通过限制性稀释法或离子交换法，筛选出高产、单克隆抗体的杂交瘤细胞。

4. 单克隆抗体培养与提取：将筛选出的单克隆杂交瘤细胞进行扩增培养，获取大量的细胞。

然后通过细胞培养上清液、腹水或腹水灌洗法获得单克隆抗体。

多克隆抗体制备的原理如下：
多克隆抗体是指由多个不同的抗体产生细胞(即多克隆细胞)产生的一类抗体。

其制备的原理是通过免疫动物多次免疫，激发机体产生大量的抗原特异性抗体。

不同的抗原特异性抗体由不同的抗体产生细胞产生，并经过体内的嫁接与筛选，获
得了多个具有抗原特异性的抗体。

多克隆抗体具有较广泛的抗原特异性，可以识别目标抗原的不同位点，因此可以广泛应用于免疫学、分子生物学、生物医学等领域。

多克隆抗体的制备技术

多克隆抗体的制备技术
多克隆抗体的制备技术是一种利用多个B细胞克隆的方法，用于生产特定抗原的抗体。

具体步骤如下：
1. 抗原制备：首先，需要制备抗原。

抗原可以是蛋白质、病原体、多肽或其他分子，可以通过基因工程技术在大肠杆菌等表达系统中表达、纯化或合成。

2. 免疫小动物：将制备好的抗原注射到小动物体内（如小鼠、兔子或大鼠）作为免疫原。

这样做可以激发动物的免疫系统产生抗原特异性的抗体。

3. 收集抗体：收集免疫小动物产生的抗原特异性抗体。

一般情况下，可以通过静脉采血或收集腹水来获得抗体。

4. 抗体纯化：对采集到的抗体进行纯化，可以使用亲和层析或离子交换层析等技术进行精确的纯化。

5. 克隆：将纯化的抗体进行多次稀释，然后分别稀释至单个细胞级别。

接下来，将单个细胞分别种植在含有培养液的孔中，使其形成克隆。

6. 验证：对每个克隆进行酶联免疫吸附测定（ELISA）或其他检测方法验证抗体的特异性和亲和力。

7. 扩大培养：对验证合格的克隆进行扩大培养，使其产生大量的抗体。

通过以上步骤，可以制备出多个来自不同克隆的抗体，这些抗体可以与同一抗原结合，用于生物学研究、诊断和治疗等领域。

实验一多克隆抗体的制备（可溶性抗原）

实验一多克隆抗体的制备（可溶性抗原）上海师范大学实验报告专业、年级生物科学班级姓名学号课程名称免疫学实验名称多克隆抗体的制备（可溶性抗原）实验日期基本原理免疫动物是通过给待免疫的动物注射抗原，使其获得相应的抗体的过程。

抗原给予的方法不仅对免疫应答的起始有较大影响，而且决定着对新注射抗原的免疫吞噬和吞噬后加工处理的细胞类型，并影响对其发生免疫应答的外周淋巴器官。

材料(一)动物：健康雄性家兔2只(二)器材：剪刀、镊子、注射器(2ml、50ml)附针头(9号、6号)、称量瓶(10ml)、量筒、动物固定架、灭菌三角烧瓶(200ml)、手术器械一套、血管夹、黑丝线、塑料放血管等。

(三)试剂1.灭菌生理盐水；2.纯化人IgG(10mg／ml)；3.消毒酒精及碘酒；4.弗氏不完全佐剂（FCA）5.弗氏完全佐剂（FIA）6.弗氏完全佐剂乳化抗原(FCA-IgG)的制备：吸2ml FCA于研钵中，逐滴加入1mg／ml 纯化人IgG 1 ml，边滴入边研磨直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上不散开为合格。

7. 弗氏不完全佐剂乳化抗原(FIA-IgG)的制备：吸2ml FIA于研钵中，逐滴加入1mg／ml纯化人IgG 1 ml，边滴入边研磨直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上不散开为合格。

免疫方法1.用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分毛，以酒精及碘酒消毒皮肤；2.第一次免疫: 用2ml注射器吸取弗氏完全佐剂(FCA)乳化的抗原(人IgG)下称FCA-IgG)液1ml，每侧脚掌皮下各注入0.5ml。

3.第二次免疫：间隔14天后，于两侧腘窝及鼠蹊部肿大的淋巴结内注入FIA-IgG，每个淋巴结注0.1ml，其余注入淋巴结附近皮下共1ml。

如淋巴结未肿大或肿大不明显时，直接注入两侧腘窝及鼠蹊部皮下。

4.间隔10天后，从耳静脉采血0.5～1.0ml，分离血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价(即试血)。

效价至少应达到1∶16以上时才能放血。

多克隆抗体实验报告(3篇)

第1篇一、实验目的1. 学习多克隆抗体的制备方法；2. 掌握多克隆抗体的纯化、鉴定及效价检测技术；3. 熟悉多克隆抗体的应用。

二、实验原理多克隆抗体是由多个B细胞克隆产生的抗体，具有特异性强、亲和力高、产量高等特点。

多克隆抗体制备过程主要包括抗原免疫、抗体提取、纯化、鉴定及效价检测等步骤。

三、实验材料1. 实验动物：小鼠（6周龄）；2. 抗原：目的蛋白；3. 试剂：免疫球蛋白G（IgG）亲和层析柱、蛋白纯化试剂盒、SDS-PAGE凝胶、Western Blot试剂盒、酶标仪、凝胶成像系统等；4. 仪器：离心机、PCR仪、电泳仪、Western Blot仪、酶标仪等。

四、实验方法1. 抗原免疫（1）取抗原溶液，加入等体积的福氏完全佐剂，混匀；（2）将混合液注射入小鼠腹腔，免疫剂量根据抗原量和小鼠体重确定；（3）免疫后第2周，重复注射抗原和福氏不完全佐剂，加强免疫；（4）免疫后第3周，采集小鼠血清，进行抗体效价检测。

2. 抗体提取（1）将小鼠血清与蛋白提取缓冲液（pH 7.4）按1:4比例混合；（2）4℃条件下，以15000 rpm离心30分钟，收集上清液；（3）上清液经0.22μm滤膜过滤，得到抗体溶液。

3. 抗体纯化（1）将抗体溶液加入IgG亲和层析柱；（2）用蛋白纯化试剂盒进行梯度洗脱，收集抗体峰；（3）将抗体峰浓缩至适当体积，得到纯化抗体。

4. 抗体鉴定（1）SDS-PAGE电泳：将纯化抗体样品与标准蛋白进行SDS-PAGE电泳，比较分子量；（2）Western Blot：将纯化抗体样品与目的蛋白进行Western Blot检测，观察抗体特异性。

5. 抗体效价检测（1）将抗原溶液与纯化抗体溶液按一定比例混合；（2）加入底物溶液，酶标仪检测吸光度值；（3）根据吸光度值，计算抗体效价。

五、实验结果1. 抗原免疫：小鼠在免疫后第3周，血清抗体效价达到最高值。

2. 抗体提取：纯化抗体溶液经SDS-PAGE电泳，分子量与目的蛋白一致。

多克隆抗体制备免疫小鼠

多克隆抗体制备免疫小鼠多克隆抗体制备免疫小鼠是一种常用的制备多克隆抗体的方法。

下面是具体的步骤：1. 选择抗原：首先需要确定所需要制备抗体的抗原。

抗原可以是蛋白质、多肽、多糖等。

2. 免疫小鼠：将所选抗原注射到小鼠体内，以诱导其产生特异性抗体。

通常，抗原会和佐剂（如完全弗氏佐剂）混合，以增强免疫响应。

3. 免疫程序：将抗原注射到小鼠体内，通常分为初次免疫和加强免疫两个阶段。

初次免疫后，会进行一定的间隔时间（通常是2-4周）再次注射抗原，以增强免疫效果。

4. 细胞融合：在小鼠免疫后，从其脾脏中采集免疫细胞（通常是脾细胞），与骨髓瘤细胞（如SP2/0或NS1等）进行细胞融合。

5. 筛选和培养：将融合细胞进行稀释后，接种到培养基中，以培养成杂交瘤细胞。

培养基中通常会添加相应的选择剂，以选择出杂交瘤细胞。

6. 克隆筛选：将培养出的杂交瘤细胞进行单克隆化，即分离成单个克隆细胞。

这可以通过稀释法或细胞限 dilution法来进行。

7. 抗体鉴定：对筛选出的单克隆细胞进行抗体鉴定，通常采用酶联免疫吸附试验（ELISA）或免疫组化技术来检测抗体的特异性和亲和力。

8. 抗体生产：经过抗体鉴定后，将选出的单克隆细胞培养扩大，并进行大规模的培养和抗体生产。

多克隆抗体制备免疫小鼠的主要优点是可以获得多种不同的抗体，具有较高的灵敏性和多样性。

然而，由于免疫小鼠需要一定的时间来产生抗体，需要一定的动物资源和成本支出，而且制备的抗体可能存在一定的批次变异。

因此，每个实验室需要根据自己的需求和实际情况来选择适合自己的抗体制备方法。

小鼠抗人MyosinVa多克隆抗体的制备和鉴定

ISSN1007 - 8738细胞与分子免疫学杂志 (Chin J Cell Mol Immunol) 2009, 25 (5)
451
·论著 ·
文章编号 : 1007 - 8738 (2009) 05 - 0451 - 03
小鼠抗人 M yosin Va多克隆抗体的制备和鉴定
韩海勃 , 蓝林祥 △ , 张志谦 3 , 赵威 (北京大学临床肿瘤学院北京肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所临床实验室 , 恶性
秀人才支持计划项目 (NCET20720031) 作者简介 : 韩海勃 (1977 - ) , 女 , 山东高密人 , 助理研究员 , 硕士
蓝林祥 (1980 - ) , 男 , 福建龙岩人 , 实习研究员 , 硕士 3 Corresponding author, E2mail: zqzhang@public3. bta. net. cn △同为第 1作者
肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室 , 北京 100142)
[摘要 ] 目的 : 制备 M yosin Va多克隆抗体 , 为深入研究其功能和探讨其与肿瘤等疾病的相关性提供工具。方法 : PCR 扩增编码人 M yosin Va C末端 (M yoVaCT) 278个氨基酸的 cD2 NA 片段 , DNA 重组入原核表达质粒 pET28a, 转化大肠杆菌 BL21菌株 , 异丙基 β2D 硫代半糖苷 ( IPTG) 诱导表达 H is2 M yoVaCT融合蛋白。经电泳纯化的融合蛋白免疫 BALB / c小鼠 , 制备抗血清。通过 EL ISA和免疫荧光法鉴定血清特异抗体效价和特异性。结果 : 成功构建了 pET28a /M yoVaCT原核表达载体 , 转化 BL21后可高效表达融合蛋白 H is2M yoVaCT, 纯化蛋白免疫小鼠后产生的 M yosin Va多抗可特异检测细胞内源性 M yosin Va的表达及定位情况 , 同时能特异识别细胞内外源表达的 M yosin Va分子。结论 : 获得了效价和特异性都良好的 M yosin Va抗体 , 适合应用于 M yosin Va的检测。 [关键词 ] M yosin Va; 融合蛋白 ; 多克隆抗体 [中图分类号 ] R392. 11 [文献标识码 ] B

免疫抗体和多克隆抗体的制备和应用

免疫抗体和多克隆抗体的制备和应用免疫抗体和多克隆抗体是在生物识别、生物学研究、疾病诊断、治疗和预防等方面广泛应用的研究工具。

本文将介绍免疫抗体和多克隆抗体的制备方法和应用领域。

1. 免疫抗体的制备免疫抗体是由动物免疫系统产生的抗体，经过分离、纯化和浓缩制备而成。

主要包括单克隆抗体和多克隆抗体。

1.1 单克隆抗体的制备单克隆抗体是一种高度特异性、亲和力强的免疫抗体，适用于复杂蛋白质分子的特异性检测和定量分析。

其制备主要包括以下步骤：(1) 免疫原制备：选择纯化后的单个蛋白或多肽作为免疫原，经过多次免疫小鼠、大鼠或兔子等动物。

(2) 制备淋巴细胞：从免疫动物的脾脏或淋巴结中获得淋巴细胞。

(3) 制备骨髓瘤细胞：从骨髓瘤患者中筛选出与免疫细胞融合的骨髓瘤细胞。

(4) 实现细胞的杂交：以多核融合剂将淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合。

(5) 选择和筛选：细胞融合后，使用一种名为“限制性稀释”法的技术来选择和筛选产生单克隆抗体的杂交瘤。

(6) 扩增：将杂交瘤扩增到满足免疫抗体生产的数量。

(7) 收集：从生产的杂交瘤中收集单克隆抗体。

1.2 多克隆抗体的制备多克隆抗体是由多个不同B细胞分泌的免疫抗体组成，在体内能针对不同的抗原位点金标记物。

其制备主要包括以下步骤：(1) 免疫原制备：选择纯化后的单个蛋白或多肽作为免疫原，经过多次免疫小鼠、大鼠或兔子等动物。

(2) 收集血清：收集免疫动物的血清。

(3) 分离抗体：将血清分离抗体，具体过程包括酸性与碱性裂解、硫酸铵法沉淀、Ion交换层析、凝胶过滤等。

(4) 纯化和鉴定：将分离的抗体再纯化，使用SDS-PAGE和Western Blot等方法进行鉴定。

2. 多克隆抗体的应用多克隆抗体的适用性很广，可以应用于免疫诊断、治疗和治疗等多个领域。

2.1 免疫诊断多克隆抗体在医学上的应用，尤其是在临床诊断中，具有非常重要的价值。

例如，乳腺癌和结肠癌等疾病仅有免疫Cl17-1A单抗才能检测出其产生的抗原，同时多克隆抗体也广泛用于生化分析、流行病学调查等领域。

〖医学〗医学免疫学创新性实验----伤寒沙门菌多克隆抗体的制备

2. 用2ml注射器吸取1ml伤寒沙门菌液进行皮内注射,共4-6点,每点大约。
3. 每周免疫1次,连续3-4次。
三、小鼠腹腔免疫方法 1.用左手抓取小鼠固定,消毒腹部皮肤。 2.用1ml注射器吸取伤寒沙门菌进行腹腔注射。 3.每周免疫1次,连续3-4次。
四、兔标记方法: 1班:剪去头左侧毛 2班:头右侧 3班:脖左侧 4班:脖右侧 5班:腹左侧 6班:腹右侧 7班:臀左侧 8班:臀右侧
1. 将大白兔固定,将耳缘静脉附近的毛剪去,并用酒精棉球消毒。
2. 用2ml注射器吸取1ml (初次0.5ml)伤寒沙门菌液经耳缘静脉注入大白兔体内。
3. 每周免疫1次,连续3-4次。
注意:先自耳缘静脉远端注射。
二、大白兔皮内免疫方法
1. 先将大白兔固定,剪去背部兔毛,注意不要剪破皮肤。然后用酒精棉球进行消毒。
2. 抗原和抗体在体内外均可以发生特异性结合,可利用肥大氏反响检测动物血清中伤寒沙门菌抗体的含量。
实验材料: 1. 新西兰雄性大白兔共16只,2只/班,昆明鼠48
只,6只/班 2. 灭活伤寒沙门菌 3. 注射器(免疫用、采血用)、碘酒酒精棉球等 4. 肥大氏反响用实验材料
一、大白兔耳缘静脉免疫方法
▪ 二、大白兔皮内免疫方法 ▪ 1.先将大白兔固定,剪去背部兔毛,注意不
要剪破皮肤。然后用酒精棉球进行消毒。
▪ 2.用2ml注射器吸取1ml伤寒沙门菌液进行皮内注射,共4-6点,每点大约。
▪ 3. 每周免疫1次,连续3-4次。
▪ 三、小鼠腹腔免疫方法 ▪ 1.用左手抓取小鼠固定,消毒腹部皮
肤。
▪ 2.用1ml注射器吸取伤寒沙门菌进行腹腔注射。
▪ 3.每周免疫1次,连续3-4次。

小鼠成纤维细胞激活蛋白多克隆抗体的制备及应用

小鼠成纤维细胞激活蛋白多克隆抗体的制备及应用
小鼠成纤维细胞激活蛋白（DCAF）是一种在细胞周期调节和
转录后修饰中发挥重要作用的蛋白。

它是一个可变的靶受体，对于不同的底物起调节作用。

因此，研究DCAF蛋白的表达
和调节机制对于探索细胞周期调节及癌症等疾病的发生发展具有重要意义。

为了研究DCAF蛋白在上述生物学过程中的作用，需要具有高灵敏度和特异性的抗体。

本文将介绍小鼠成纤维细胞激活蛋白多克隆抗体的制备及应用。

首先，我们选用小鼠DCAF蛋白的特异性肽段进行多肽合成，与大鼠进行免疫。

得到的免疫血清经过筛选和鉴定后，选择具有高效和特异性的多克隆抗体进行纯化和加工，最终制备成为小鼠成纤维细胞激活蛋白多克隆抗体。

接下来，我们应用这些抗体来研究DCAF蛋白在细胞周期的
表达模式及其在调节转录后修饰中的作用。

我们利用免疫荧光染色、免疫印迹等多种方法，研究不同细胞系中DCAF蛋白
的表达情况以及其基因调控的信号通路。

我们还通过共沉淀实验，研究DCAF在蛋白降解和招募促进因子（例如Ubiquitin
配体）中的作用。

此外，我们还在体外细胞实验中，评估这些抗体对于DCAF蛋白的信号与活性的调节效果。

总之，小鼠成纤维细胞激活蛋白多克隆抗体的制备及应用在细胞周期调节和转录后修饰的研究中具有重要应用价值。

未来随着技术的不断发展，这种抗体的表达和筛选手段将更加丰富多样，为探索生物学的前沿科学问题提供支持和保障。

免疫学实验：多克隆抗体制备-免疫小鼠

分组情况
免疫程序
组别时间
Day 0 皮下注射
Day 10 皮下注射
Day 17 腹腔注射
有Байду номын сангаас剂组
无佐剂对照组阴性对照组
40ugOVA 弗氏完全佐剂
40ugOVA 弗氏不完全佐剂
40ugOVA 弗氏不完全佐剂
40ugOVA 40ugOVA 40ugOVA
生理盐水生理盐水生理盐水
Day 24
取血
取血
取血
颈部皮下注射要点
❖ 拇指与食指捏起颈部皮肤 ❖ 水平进针，针头脱空感，缓慢注射，迅速拔出
腹腔注射要点
❖ 抓住颈部皮肤和鼠尾，将小鼠翻转，头部偏下 ❖ 45度进针，靠近腹部中线，进针1cm针头脱空感，缓慢注
射，迅速拔出
注意事项
❖ 戴手套操作 ❖ 注射器针头用后及时盖帽 ❖ 文字记录标记方法 ❖ 经常检查标记保存状况
JLU
JLU
多克隆抗体制备-免疫小鼠
实验材料
❖ 小鼠每组3只 ❖ 注射器每组3只 ❖ 乳胶手套每人1付 ❖ 线手套每组1付 ❖ 记号笔、手术剪刀公用 ❖ 弗氏注射液公用 200ug/ml OVA in 弗氏佐剂 ❖ 无佐剂注射液公用
200ug/ml OVA in 生理盐水 ❖ 生理盐水（对照）公用

免疫学实验-多克隆抗体的制备

羊毛脂+液体石蜡弗氏完全佐剂
羊毛脂+液体石蜡+卡介苗首次免疫用完全佐剂，再次免疫用不完全佐剂。羊毛脂、液体石蜡：油包水乳液，增加滞留时间。卡介苗：增强免疫系统敏感性。提升抗原递呈能
力。
9
2018/3/19
多克隆抗体的分离与纯化
抗血清的制备：取血，离心
亲和层析纯化： ProteinA/G（中性亲和，酸性解离），所有抗体。抗原亲和纯化，特异抗体。
抗体的产生及功能
抗体的产生： B细胞被激活后分化为浆细胞并分泌抗体。
抗体的免疫学功能：识别病原菌表面抗原阻止病原菌侵袭体细胞介导特异性免疫攻击
3
抗体的科研应用
免疫沉淀免疫共沉淀免疫印迹免疫荧光染色流式细胞术
2018/3/19
7
抗体的临床应用
检测待测抗原妊娠检测血型鉴定病原菌鉴定
2018/3/19
JLU
免疫学实验-多克隆抗体的制备
吉林大学生命科学学院生物实验教学示范中心王飞 fei@
内容提要
1
抗体的产生及免疫功能
2
抗体的临床及科研应用
3
抗体制备原理
4
ELISA法测定抗体效价
5
实验项目简介
1
2018/3/19
免疫系统概述
Immune system：protect against disease Major target: detect and distinguish pathogens
4.These bind to any antibodies which are attached to antigen. Excess conjµgante is washed away after a period of incubation

小鼠抗HCMV-gB多克隆抗体的制备及初步应用

小鼠抗HCMV-gB多克隆抗体的制备及初步应用韩慧平;于三科【摘要】为了快速制备抗HCMV-gB小鼠多克隆抗体,通过PCR扩增HCMV-gB (57 aa～146 aa)编码序列并克隆到原核表达载体pET21b(+)多克隆位点,用重组质粒转化大肠埃希菌Rosetta (DE3)并通过IPTG诱导表达,经镍胶亲和层析纯化和透析复性获得重组蛋白.以CpG-ODN和Al(OH)3复合佐剂作为重组蛋白的免疫佐剂,通过0周和3周2次肌肉注射免疫Balb/c小鼠,并在第5周采血分离免疫血清.用ELISA检测免疫血清效价,并通过Western blot检测免疫血清对哺乳动物细胞表达的HCMV-gB1和gB2的反应性.结果显示,本研究制备的免疫血清ELISA滴度达到1∶51 200～1∶102 400,进行Western blot 能够与哺乳动物细胞表达的HCMV-gB1和gB2发生特异性反应.此试验获得了能够用于后续研究工作的抗HCMV-gB 小鼠多克隆抗体,本方法具有制备速度快、抗体滴度高和抗原用量少等优点.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2012(033)002【总页数】4页(P51-54)【关键词】CpG-ODN;Al (OH)3;免疫佐剂;多克隆抗体【作者】韩慧平;于三科【作者单位】西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】S852.659.5;S858.21巨细胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）感染在人及动物中普遍存在，不同的物种具有其特定的病毒株，我国人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus，HCMV）感染率高达86%～96%[1]。

HCMV感染对胎儿和免疫功能低下者危害严重[2－3]，而且与动脉粥样硬化和肿瘤发生密切相关[4]。

研制HCMV疫苗对预防该病毒感染具有非常重要的意义[5]。

用改良的基因免疫方法制备小鼠抗人OAT3多克隆抗体

第１７卷第１５期中国现代医学杂志Ｖｏｌ．１７Ｎｏ．１５２００７年８月ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｄｅｒｎＭｅｄｉｃｉｎｅＡｕｇ．２００７文章编号：１００５－８９８２（２００７）１５－１８２６－０５・论著・用改良的基因免疫方法制备小鼠抗人ＯＡＴ３多克隆抗体许国双１，刘安２（１．第四军医大学西京医院肾脏病科，陕西西安７１００３２；２．西安市儿童医院急诊科，陕西西安７１０００３）摘要：目的用改良的基因免疫的方法制备小鼠抗人有机阴离子转运蛋白３（ｈＯＡＴ３）多克隆抗体。

方法提取人肾组织总ＲＮＡ，用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法扩增ｈＯＡＴ３基因中免疫原性较强的细胞内亲水序列片段，克隆到Ｔ－Ａ克隆载体ｐＣＲ２．１中构建ｐＣＲ２．１－ｈＯＡＴ３载体，再从ｐＣＲ２．１－ｈＯＡＴ３中用特异性内切酶ＢｃｌＩ和ＸｍａＩ切下ｈＯＡＴ３基因片段，亚克隆到载体ｐＢＱＡＰ－ＴＴ中构建基因免疫载体ｐＢＱＡＰ－ＴＴ－ｈＯＡＴ３，酶切及序列分析鉴定正确后，用基因枪与辅助载体ｐＣＭＶｉ－ＧＭＣＳＦ和ｐＣＭＶｉ－Ｆｉｔ３Ｌ同时免疫小鼠，１２周后分离血清，ＥＬＩＳＡ方法测定抗体滴度，人肾组织Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和免疫组化鉴定抗体的特异性和定位表达。

结果成功扩增出２２８ｂｐ的ｈＯＡＴ３细胞内亲水序列片段，构建基因免疫载体ｐＢＱＡＰ－ＴＴ－ｈＯＡＴ３，经酶切及序列分析鉴定正确。

Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果显示小鼠抗ｈＯＡＴ３多克隆抗体识别人肾皮质膜蛋白５７ｋＤ的ｈＯＡＴ３。

免疫组化结果显示ｈＯＡＴ３定位表达在人近段肾小管上皮细胞基底侧细胞膜。

结论用基因免疫的方法可以成功制备高滴度和特异性抗ｈＯＡＴ３多克隆抗体。

关键词：肾脏；有机阴离子转运蛋白３；小鼠；基因免疫；抗体制备中图分类号：Ｒ３９２．１１文献标识码：ＡＧｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｍｏｕｓｅａｎｔｉ－ｈｕｍａｎｏｒｇａｎｉｃａｎｉｏｎｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ３ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｂｙｉｍｐｒｏｖｅｄｇｅｎｅｔｉｃｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎＸＵＧｕｏ－ｓｈｕａｎｇ１，ＬＩＵＡｎ２（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＮｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，ＸｉｊｉｎｇＨｏｓｐｉｔａｌ，ｔｈｅＦｏｕｒｔｈＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ′ａｎ，Ｓｈａｎｘｉ７１００３２，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ；２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＥｍｅｒｇｅｎｃｙ，Ｘｉ′ａｎＣｈｉｌｄｒｅｎ′ｓＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｘｉ′ａｎ，Ｓｈａｎｘｉ７１０００３，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｏｇｅｎｅｒａｔｅｍｏｕｓｅａｎｔｉ－ｈｕｍａｎｏｒｇａｎｉｃａｎｉｏｎｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ３（ｈＯＡＴ３）ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｗｉｔｈｉｍｐｒｏｖｅｄｇｅｎｅｔｉｃｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．【Ｍｅｔｈｏｄｓ】ＴｏｔａｌＲＮＡｏｆｈｕｍａｎｋｉｄｎｅｙｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｔｈｅｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｈｉｇｈａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｈＯＡＴ３ｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＲＴ－ＰＣＲ，ｔｈｅｎｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏＴ－ＡｖｅｃｔｏｒｐＣＲ２．１ｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｒｅｃｏｍ－ｂｉｎａｔｅｄｖｅｃｔｏｒｐＣＲ２．１－ｈＯＡＴ３．ＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｈｉｇｈａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｈＯＡＴ３ｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍｐＣＲ２．１－ｈＯＡＴ１ｗｉｔｈＢｃｌＩａｎｄＸｍａＩｂｙｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｄｉｇｅｓｔｉｏｎ，ｔｈｅｎｓｕｂｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｐＢＱＡＰ－ＴＴｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｖｅｃ－ｔｏｒｐＢＱＡＰ－ＴＴ－ｈＯＡＴ３．Ｇｅｎｅｇｕｎｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｉｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄａｎｄｔｗｏｏｔｈｅｒａｄｊｕｖａｎｔｐｌａｓｍｉｄｓ，ｗｈｉｃｈｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒａｎｄＦＭＳ－ｌｉｋｅｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ３ｌｉｇａｎｄｒｅｓｐｅｃ－ｔｉｖｅｌｙ，ｉｎｄｕｃｅｄｈｉｇｈｌｅｖｅｌａｎｔｉｂｏｄｙａｆｔｅｒ１２ｗｅｅｋｓ．Ｔｈｅａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ′ｔｉｔｅｒｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＥｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒ－ｂｅｎｔａｓｓａｙ，ａｎｄｉｔｓｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．【Ｒｅｓｕｌｔｓ】Ｉｎｔｒａ－ｃｅｌｌｕｌａｒｈｉｇｈｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｈＯＡＴ３ｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｆｒｏｍｔｏｔａｌＲＮＡｏｆｈｕｍａｎｋｉｄｎｅｙｂｙＲＴ－ＰＣＲ，ａｎｄｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｐＢＱＡＰ－ＴＴｆｏｒｇｅｎｅｔｉｃｉｍｍｕｍｉｚａｔｉｏｎ．ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｖｅｃｔｏｒｐＢＱＡＰ－ＴＴ－ｈＯＡＴ３ｗａｓｃｏｎｆｉｒｍｅｄｂｙｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｄｉｇｅｓｔｉｏｎａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｔｈｅｍｏｕｓｅａｎｔｉ－ｈＯＡＴ３ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｃｏｕｌｄｒｅｃｏｇｎｉｚｅａｂａｎｄｏｆｒｅｌａ－ｔｉｖｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｓｓ５７ｋＤ，ｗｈｉｃｈｗａｓｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈｔｈａｔｏｆｃａｌｃｕｌａｔｅｄｏｎｅｆｏｒｈＯＡＴ３．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｉｎｄｉ－收稿日期：２００６－１２－２１第１５期许国双，等：用改良的基因免疫方法制备小鼠抗人ＯＡＴ３多克隆抗体体内的许多代谢产物和药物最终都是以有机阴离子的形式通过肾小管上皮细胞分泌排除体外的，肾小管上皮细胞对这些阴离子的分泌主要经过两个步骤：第１步，从肾小管周血液通过肾小管上皮细胞基底侧膜转运到肾小管上皮细胞内；第２步，从肾小管上皮细胞通过顶膜转运到管腔内。