多克隆抗体的制备,纯化及检测
多克隆抗体制备
多克隆抗体制备多抗一般制备流程：完全抗原的准备→兔子的免疫→效价检测和终放→抗体亲和纯化→抗体的浓缩和保存。
【晶莱生物】具体实验步骤如下：1.兔子的准备挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只（约2Kg），使其适应新的生活环境，至少稳定几天再进行首次取血.预采血（作阴性参照用）1.1 将兔子小心的放入固定的架中,使兔子平静；1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可见(也可不剃)；1.3如果有必要,可用小棉球沾酒精涂抹血管部位,使血管膨胀；1.4用注射器从耳静脉抽取约10ml血液(约5ml血清)；1.5小心抽出针头,适当按压伤口以免流血,然后用酒精棉球消毒伤口；1.6将收集的血液置于37`C灭活30min,最后置于4`C过夜使其凝结释放血清；1.7将凝结好的血液在10000r／min离心10min； h.收集上清，即为血清。
2. 兔子的免疫2.1注射两只兔子的抗原为1ml,抗原缓冲溶液必须不含对兔子有害的化学试剂.每只兔子初次免疫400ug抗原比较适合,也可适当减少以获得更好的结果，后续免疫每次为100ug即可。
2.2 将1ml的佛氏完全佐剂与准备好的1ml抗原充分混匀,呈乳白色；2.3 小心从笼中取出兔子，每只兔子免疫4个部位(背部和大腿根部均可),每个部位250ul,针头呈45度角插入皮下1-2cm,注射完后停留数秒以防止抗原外流。
2.4 免疫周期为20天,免疫完后7-10天取血(包括中途测试取血和最终放血),总共免疫4-5次。
3.效价检测3.1 2个参照:阴性参照为预取血血清，均以1抗起始浓度稀释(封闭稀释液);阳性参照为以前阳性血清3.2 于96孔板中每孔滴加100ul，1ug/ml抗原，于4℃过夜，也可以37℃孵育2小时。
3.3倒掉抗原溶液，每孔加入200ul的封闭液，4℃过夜或者37℃孵育2小时。
3.4倒去封闭液，在吸水纸上拍打尽量吸干残留液体,用洗涤液洗板三次,每次尽量拍干残留液体,若要放置一段时间, 37℃烘干并用封口袋封好于-20℃存放。
多克隆抗体制备的基本过程
多克隆抗体制备的基本过程
多克隆抗体制备的基本过程包括以下步骤：
1. 免疫原的选择：选择合适的免疫原，可以是蛋白质、多肽、细胞表面抗原等。
2. 免疫动物的选择：选择适合的免疫动物，常见的包括小鼠、兔子等。
3. 免疫动物的免疫：将免疫原注射到免疫动物体内，刺激其免疫系统产生特异性抗体。
4. 收集免疫动物的血清：在免疫动物免疫一段时间后，收集其血清，其中含有特异性抗体。
5. 分离特异性抗体：通过多种方法如沉淀、层析等技术，将特异性抗体从血清中分离出来。
6. 筛选特异性抗体：对分离出的抗体进行筛选，通常采用ELISA、免疫组化等方法，筛选出特异性较好的抗体。
7. 克隆特异性抗体：将特异性较好的抗体细胞与骨髓瘤细胞（如SP2/0）融合，形成杂交瘤细胞。
8. 杂交瘤细胞的筛选：通过培养基中添加抗代谢毒物质如氨甲酰青霉素（HAT），筛选出只含杂交瘤细胞的细胞。
9. 单克隆抗体的扩增：将筛选出的单克隆细胞进行培养和扩增，得到大量的单克隆抗体。
10. 纯化和鉴定：对单克隆抗体进行纯化和鉴定，确保其纯度和特异性。
11. 应用：获得的多克隆抗体可以应用于免疫组化、免疫沉淀、免疫印迹、免疫荧光等实验和应用中。
需要注意的是，多克隆抗体制备的过程可能因具体实验目的、免疫动物的选择等因素而有所差异。
以上是一般的基本步骤，具体实验过程中还需根据实际情况进行调整和优化。
蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备方法参考
蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备方法参考一、蛋白的原核表达实验目的蛋白的原核质粒的构建。
适用范围蛋白原核表达。
实验原理参考实验室工具书《分子克隆实验指南》《抗体制备与使用实验指南》实验试剂病毒RNA的提取（Trizol法）相关试剂，反转录相关试剂（M-MLV Buffer、10M dNTPs、DEPC水、随机引物、RNA酶抑制剂、反转录酶M-MLV），GenStar高保真酶，T4连接酶，菌液PCR相关试剂，Western blot试剂盒实验设备和材料DH5a感受态细胞、BL21感受态细胞操作步骤（一）病毒RNA的提取（Trizol法）参照分子克隆的方法进行，（1）将250 μL液体样品加入1.5 mL Ep 管中，再加入750 μL冰预冷的TRIZOL。
（2）将样品剧烈混合后，在室温静置5 min。
（3）加入200 μL氯仿，颠倒Ep管混和两次，并剧烈振荡混和，使液体充分混匀呈乳白状（无分相现象）后，再室温静置5 min。
（4）在4℃条件下，以12000×g 离心15 min。
（5）将上层水相转移到一个新的Ep 管中，加入等体积的异丙醇并上下颠倒混匀，然后在室温静置至少 10min。
（6）在4℃条件下，以12000×g 离心15 min 后，小心并尽可能地去除全部上清液。
（7）用1 mL 75% DEPC 乙醇洗涤RNA 沉淀和管壁，4℃ 12000×g离心5 min后小心弃去乙醇。
（8）将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用 10μL 无 DEPC 水（无RNA酶的水）将RNA溶解并于-20℃保存。
（二）反转录反应体系（20 μL）：按下列顺序加样M-MLV Buffer 4 μL10M dNTPs 1 μLDEPC 水 3 μL随机引物 1 μL RNA酶抑制剂 0.5 μL反转录酶 M-MLV 1 μL提取的 RNA 9.5 μL总体积20 μL反应条件：42℃水浴 1~1.5 h（三）引物设计与合成依据新城疫毒株全基因序列，运用Oligo或者Primer Premier5.0软件设计上下游引物，设计引物是注意选择常用的酶切位点以及保护性碱基的添加引物使用前用灭菌超纯水配成相应浓度，-20℃保存备用。
重组人sCR1多克隆抗体制备及纯化鉴定
【 摘 要】 目的 制备原 核表达人 ｓ Ｒ 多克隆抗体并对其进行鉴定 。方法 Ｃ １ 提取人总 Ｒ Ａ进行 Ｒ — Ｎ Ｔ
采
・
论 著・
Ｐ Ｒ扩增合成 ｃ Ｎ 以 ｃ Ｎ Ｃ Ｄ Ａ， Ｄ Ａ为模板 。 构建重组表达质粒 ｐ Ｔ ８—ｓ ＲＩ 在大肠杆菌巾表达人 ｓ Ｒ 融 Ｅ ２ａ Ｃ 。 ＣＩ
ｔｅ ｅ ｎ ｉ ｏ ｙ ｐ ｏ ｅ ｔ ｓ ｈ ｓ ａ ｔ ｄ ｒ ｐ ｒｉ ．Ｍ ｅ ｈ ｄ Ｔ ｅ ｆ ｌ ｌ ｎ ｔ ＤＮＡ ｆ ｈ ｍａ ｓ Ｒ１ ａ ｏ ｔｉ ｅ ｕ ｉｇ Ｔ— ｂ ｅ ｔｏ ｓ ｈ ｕｌ ｅ ｇｈ ｃ ｏ ｕ ｎ Ｃ ｗ ｓ ｂａ ｎ ｄ ｓｎ Ｒ
ｂ Ｓ ｙ ＤＳ－ ＡＧＥ． Ｒｅ ｕ ｔ ｒ ｅ ａｂ ｉ ｏｙ ｌｎ ｌ ｎ ｉｏ ｙ ｇ ｉ ｓ Ｐ ｓｌ ｓ ｈ ｒ ｂ ｔ ｐ ｌｃｏ ａ ａ ｔ ｄ ａ ａ ｎ ｔ ｕ ｎ ＣＲ Ｉ ｆ ｓｏ ｐ ｏ ｅｎ ｏ ｌ ｂ ｈ ｍａ ｓ ｕ ｉｎ ｒ ｔｉ ｃ ｕ ｄ ｓ ｅ ｉ ｃ ｌｙ ｒ ｃ ｇ ｉｅ ｈ ｍａ Ｃ ｆ ｓ ｎ ｐ ｏｉ ．Ｃｏ ｃｕ ｉ ｎ Ｔ ｅ ｈ ｍａ Ｃ ｕ ｉｎ ｐ ｏｅ ｎ ｗ ｓ ｕ ｅ ｐ ｃｆ ａｌ ｅ ｏ ｎｚ ｕ ｎ ｓ ＲＩ ｕ ｉ ｒ ｔ ｉ ｏ ｎ ｎ ｌ ｓ ｈ ｕ ｎ ｓ ＲＩ ｆ ｓｏ ｒ ｔ ｉ ａ ｓ ｄ ｏ
ａ ｈ ｉ ｓ ｔ ｅ ｍｍｕ ｏ ｅ ａ ｔｒ ｕ ｉ ｅ ａ ｄ ｅｏ ｄｎ ，ｗｈｃ ｈ ｓ ｅｔｒ ａ ｔ ｅ ｉｉ ａ ｄ ｍｍｕ ｏ ｅ ｉ ｉ ． ｈ ｎ ｇ ｎ ｆ ｐ ｒ ｄ ｎ ｒ ｆｌ ｉ ｇ ｅ ｉ ｆ ｉｈ ａ ｂ ｔ ｎ ｉ ｎｃ ｔ ｎ ｉ ｅ ｇ ｙ ｎ ｇ ｎ ｃｔ Ｆ ｅ ｙ
微囊藻毒素(MC-LR)多克隆抗体的制备、纯化及鉴定
Ｐｒ ｄｕ ｔｏ ｕ ｉ ｃ ｔｏ ｎ ｈ ｒ ｃ ｅ ｚ ｔ ｎ ｏ ｏ ｙ ｎ ｉ ｏ ｉｓ ｏ ｃ ｉ ｎ ｐ ｒｆ ａ ｉ ｎ ａ ｄ ｃ ａ ａ ｔ ｒ ａ ｉ ｆｐ ｌ ａ ｔｂ ｄ ｅ ｉ ｉ ｏ ａ ａ ｎｓ ｉｒ ｃ ｓｉ － ｇ ｉ ｔｍ ｃ ｏ ｙ ｔｎ ＬＲ
Ａ ｓｒｃ ： ｂｅｔ ｅ Ｐｏ ｕｔ ｎａ ｄｃ ａａｔ ｉ ｔ ｎｔｅ ｏ ａ ｔ ｏ ｉ ｇｉｓ ＭＣ Ｓ － Ｒ Ｍｅｈ ｄ ｍ ｃｏｙｔ ． ｂ ｔ ｔ ０ ｊｃｉ ｒｄ ｃ ｏ ｎ ｈ ｒｃ ｒ ａ ｏ ｌ ｎ ｂｄｅ ａａ ｔ Ｙ Ｔ Ｌ ． ｔｏ ｓ ｉ ｃ ｓ ｎ ａ ｖ ｉ ｅｚ ｉ ｈ ｐ ｙ ｉ ｓ ｎ ｒ ｉ Ｌ （ Ｃ Ｌ ）ｗ ｓ ｏ ｊｇｔ Ｌ ｔ ｎｉｍ ｕ ｅｔ ａｂｔ ｙ ｈ ｕｉ ｅ ｏ ． ｕｉ ｅａ ｔｅｕ ｙｃｎｒｕ ａ Ｒ Ｍ － Ｒ ａ ｃｎｕａ ｄ ｔ Ｋ Ｈ， ｈ ｔ ｅｒ ｉｂ ｅｒ ｔ ｅｍ ｔ ｄ Ｐ ｒｙｔ ｎ ｓ ｍ ｂ ｅｔ ｆ ｌ ｅ ｏ ｅ ｎ ｎ ｈ ｂ ｔ ｏ ｎ ｈ ｆ ｈ ｉｒ ｉ ｇ
多克隆抗体的制备,纯化及检测
实验九 多克隆抗体的制备，纯化及免疫电泳【实验目的】⒈ 加深对抗体基本知识的了解。
⒉ 了解多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。
⒊ 了解免疫电泳的基本过程和实验依据。
一、多克隆抗体的制备【实验原理】当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。
多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。
将抗原导入敏感动物体内后，可刺激网状内皮细胞系统，尤其是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。
如图所示，实验动物对初次免疫和二次免疫的应答有明显的不同。
通常初次免疫应答往往比较弱，尤其是针对于易代谢，可溶性的抗原。
首次注射后大约7天，在血清中可以观察到抗体但抗体的浓度维持在一个较低的水平，在大约10天左右抗体的滴度会达到最大值。
但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同，和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。
免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和二次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。
三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似：抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变，这种改变被称为免疫应答的成熟，具有重要的实际意义。
通常在抗原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。
【实验材料】⒈ 实验动物初次抗原注射后的周次0 1 2 3 4 5 6 7初次免疫 二次免疫血清中抗体的水平成年兔。
⒉实验器材特制兔盒；刀片；25G针头；1ml注射器；20 ml 血液收集管；药铲；离心机以及塑料离心管；加样器及加样管；烧杯。
⒊实验试剂⑴抗原；乙醇；20mM 磷酸缓冲溶液pH7.2。
⑵福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂：【实验方法】⒈抗原的制备抗原制备的主要目的在于在免疫动物体内产生最强、最适当的抗体。
由于纯化的抗原适合产生抗体，因此在注射前通常采用一些经典的方法，比如柱层析、分级萃取、亚细胞分离等进行抗原的分离和纯化。
促红细胞生成素多克隆抗体及酶标抗体的制备及纯化研究
ｉ ｍｍｕ ｏｔ ｎｔ ｈ ｏ ａｏ ｒｐ ｙ ｍｅ ｏ ｄ ｔｅ ｔｅ ｅｅ ｈｇ ｌ ｐ ｒ ｅ ．０ ｉ ｍｅ ｅ ｎ ｅ ｆ ｋｎ ｅ Ｅ Ｓ ｓｙ ｔｍ． ｎ ａ ｌｉ ｃ ｒ ｍ ｔｇａ ｈ ｔ ｄ ａ ｙ ｗ ｒ ｉｈｙ ｕｉ ｄ ｓ ｔ ｅ ｄ ｏ ｉ ｇｔ Ｈ Ａ ｙ ｓ ｔ ｙ ｈ ｎ ｈ ｈ ｆ ｉ ｔ ｈ ｔ ｍａ ｈ ｅ
Ａ ｓ ａｔＯ ｊｃｖ Ｐｒ ｅ ｅｒ Ｐ ｓ ｇｔ ｍｕｏ￣ｎｙｃｒ ａ ｇａｈ ｅ ｏ，ｎ ｍ ｎｚ ｅ ｅｌ ｄｒ ｂｓ ｂｔ ｃ： ｂｅｔ ｅ ｕｉ ｄｔ ｈ Ｏ ｕｉ ｅｉ ａｎａ ｉ ｈｏ ｔｒｐｙｍ ｔ ｄ ａｄｉ ｕｉｄＮ ｗＺａ ｎ ａ ｉ ｒ ｉ ｉ ｆ ｈ Ｅ ｎ ｈ ｎ ｔ ｍ ｏ ｈ ｍ ｅ ａ ｂｔ
ｔｅ ａ ｔ ｏ ｙ ｉ ｓ ｏ ｌ ｅ ｐｉ ｈ ｎｉ ｄ ，ｔ ｈ ｕｄ ｂ ｒｍｅ ｌ ｕ ｉ ｅ ｙｔｅ ｓｌ ｎ ｂ ｙｐ ｒ ｄ ｂ ａｔ ｇ—ｏ ｔ ａ ｄｔ ｅ ｕｉ ｅ ｉ ｅＳ Ａ ａ ｉ ｃ ｌｍｎ Ｐ ｅ ａｅ ｅｅ ｚ ｍｅｌ－ ｉ ｆ ｈ ｉ ｕ ，ｎ ｈ ｎ ｐ ｒ ｄｗ ｔ ｔ Ｐ ｍｎ￣ ｏｕ ． ｒｐ ｒ ｄｔ ｎｙ ｉ ｆ ｈｈ ｈ ａ
中国实验诊断学
２１年 １ 月 ０１ Ｏ
第 １卷 ５
第 ｌ 期 ０
多克隆抗体的制备及抗体效价测定
这样各排第1孔至第5孔的血清稀释度为 1：20、1：40、1：80、1：160、1：320。
6. 按H、O、PA、PB标记符号，第1排1-5孔 加入“O”型伤寒杆菌实验菌液，第2排各孔加入 “H”型伤寒杆菌实验菌液，第3排加入甲型副伤寒 杆菌实验菌液，第4排加入乙型副伤寒杆菌实验菌 液，每孔均加入实验菌液0.1mL。
编辑课件
操作步骤
一、免疫原的制备
免疫原（immunogen）指能刺激机体免疫
系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗 原最重要的性质是免疫原性 （immunogenicity）
免疫原—天然抗原、人工 合成抗原； 蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原；
编辑课件
（一）细胞性抗原制备： 绵羊红细胞（SRBC）- 溶血素； 细菌- 抗菌抗体（动物免疫血清）
基纤维素(CMC)等皆可与半抗原结合，加入福氏完 全佐剂可诱导动物产生良好的抗体。
编辑课件
2.连接方法
半抗原与载体的连接有物理法和化学法。
• 物理法 是用物理吸附法将载体与半抗原连 接，其原理是通过电荷和微孔来吸半抗原， 吸附载体主要有PVP和CMC等；
• 化学法 是利用某些功能基团把半抗原连接 到白质类或多肽类聚合物载体上。不同的半 抗原应选用不同的方法进行连接。
编辑课件
（四）免疫佐剂
• 某些物质与抗原一起或先于抗原注入 机体，可增强机体对该抗原的特异性 免疫应答或改变免疫应答类型，此类 物质称为免疫佐剂(immunoadjuvant)， 简称佐剂。
编辑课件
1. 佐剂的种类
佐剂一般包括以下几类： ①无机佐剂： 如氢氧化铝、明钒等 ②生物性佐剂： 如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆
编辑课件
颈动脉分离图
SOP——多克隆抗体的制备
多克隆抗体的制备1.蛋白纯化：重组蛋白表达形式为包涵体时，可通过切胶进行蛋白纯化。
表达重组蛋白的细菌（200ml菌液为例）4500r/min离心20min，菌体沉淀用15ml PBS 悬起，4500r/min离心15min，共清洗3次。
沉淀用4ml PBS悬起，通过超声处理进行裂解。
超声条件为超声时间3s，间隔3s，全程时间为30min，4℃（置于冰水混合物中），功率为400W。
超声后10000r/min离心5min，沉淀用500µl PBS悬起，后加入400µl 2×SDS凝胶加样缓冲液、100µl DTT混合，立即加入沸水中煮10min。
将500µl 处理后样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（每块凝胶加入500µl 样品）。
凝胶用H2O、PBS清洗后，将凝胶放入预冷的0.25M KCl中显色（或低温显色）30s左右，可见不同位置出现白色的蛋白条带。
将目的蛋白位置的凝胶条切下（尽量避免同时切下其他蛋白条带），PBS（预冷）清洗后，将胶条碾碎放入EP管中（大约占1/2），加入PBS 浸没胶粒（PBS加入量控制在可使胶粒完全溶于其中，上下颠倒可缓慢流动）。
反复冻融3次，10000r/min离心3min，吸取的上清即为纯化后蛋白（可多次离心后小心吸取上清，避免吸到胶粒）。
取纯化后蛋白进行SDS-PAGE电泳，鉴定蛋白的纯化度并测定其浓度。
纯化蛋白置于4℃短暂保存。
2.蛋白复性将纯化蛋白置于已处理的透析袋中（透析袋于2% NaHCO3中煮沸10min，H2O冲洗后于1mM EDTA中煮沸10min，可于4℃1mM EDTA保存），放入复性液（配方：20mM Tris-HCl pH 8.0；0.1mM氧化型谷胱甘肽；0.9mM还原型谷胱甘肽）中，4℃作用1h。
更换复性液，4℃作用2h。
再放入TE缓冲液（配方：10mM Tris-HCl；1mM EDTA pH8.0）中，4℃作用2h或过夜。
多克隆抗体的制备技术
多克隆抗体的制备技术
多克隆抗体的制备技术是一种利用多个B细胞克隆的方法，用于生产特定抗原的抗体。
具体步骤如下：
1. 抗原制备：首先，需要制备抗原。
抗原可以是蛋白质、病原体、多肽或其他分子，可以通过基因工程技术在大肠杆菌等表达系统中表达、纯化或合成。
2. 免疫小动物：将制备好的抗原注射到小动物体内（如小鼠、兔子或大鼠）作为免疫原。
这样做可以激发动物的免疫系统产生抗原特异性的抗体。
3. 收集抗体：收集免疫小动物产生的抗原特异性抗体。
一般情况下，可以通过静脉采血或收集腹水来获得抗体。
4. 抗体纯化：对采集到的抗体进行纯化，可以使用亲和层析或离子交换层析等技术进行精确的纯化。
5. 克隆：将纯化的抗体进行多次稀释，然后分别稀释至单个细胞级别。
接下来，将单个细胞分别种植在含有培养液的孔中，使其形成克隆。
6. 验证：对每个克隆进行酶联免疫吸附测定（ELISA）或其他检测方法验证抗体的特异性和亲和力。
7. 扩大培养：对验证合格的克隆进行扩大培养，使其产生大量的抗体。
通过以上步骤，可以制备出多个来自不同克隆的抗体，这些抗体可以与同一抗原结合，用于生物学研究、诊断和治疗等领域。
多克隆抗体实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习多克隆抗体的制备方法；2. 掌握多克隆抗体的纯化、鉴定及效价检测技术；3. 熟悉多克隆抗体的应用。
二、实验原理多克隆抗体是由多个B细胞克隆产生的抗体，具有特异性强、亲和力高、产量高等特点。
多克隆抗体制备过程主要包括抗原免疫、抗体提取、纯化、鉴定及效价检测等步骤。
三、实验材料1. 实验动物：小鼠（6周龄）；2. 抗原：目的蛋白；3. 试剂：免疫球蛋白G（IgG）亲和层析柱、蛋白纯化试剂盒、SDS-PAGE凝胶、Western Blot试剂盒、酶标仪、凝胶成像系统等；4. 仪器：离心机、PCR仪、电泳仪、Western Blot仪、酶标仪等。
四、实验方法1. 抗原免疫（1）取抗原溶液，加入等体积的福氏完全佐剂，混匀；（2）将混合液注射入小鼠腹腔，免疫剂量根据抗原量和小鼠体重确定；（3）免疫后第2周，重复注射抗原和福氏不完全佐剂，加强免疫；（4）免疫后第3周，采集小鼠血清，进行抗体效价检测。
2. 抗体提取（1）将小鼠血清与蛋白提取缓冲液（pH 7.4）按1:4比例混合；（2）4℃条件下，以15000 rpm离心30分钟，收集上清液；（3）上清液经0.22μm滤膜过滤，得到抗体溶液。
3. 抗体纯化（1）将抗体溶液加入IgG亲和层析柱；（2）用蛋白纯化试剂盒进行梯度洗脱，收集抗体峰；（3）将抗体峰浓缩至适当体积，得到纯化抗体。
4. 抗体鉴定（1）SDS-PAGE电泳：将纯化抗体样品与标准蛋白进行SDS-PAGE电泳，比较分子量；（2）Western Blot：将纯化抗体样品与目的蛋白进行Western Blot检测，观察抗体特异性。
5. 抗体效价检测（1）将抗原溶液与纯化抗体溶液按一定比例混合；（2）加入底物溶液，酶标仪检测吸光度值；（3）根据吸光度值，计算抗体效价。
五、实验结果1. 抗原免疫：小鼠在免疫后第3周，血清抗体效价达到最高值。
2. 抗体提取：纯化抗体溶液经SDS-PAGE电泳，分子量与目的蛋白一致。
多克隆抗体的制备方法
多克隆抗体的制备方法摘要：一、引言二、多克隆抗体的概念与作用三、多克隆抗体的制备方法1.动物免疫2.融合细胞培养3.筛选与克隆4.抗体检测与纯化四、制备过程中的注意事项五、应用领域与发展前景六、总结正文：一、引言多克隆抗体，作为一种具有广泛应用前景的生物制品，其在科学研究、医学诊断、生物制药等领域具有重要价值。
本文将详细介绍多克隆抗体的制备方法，以期为相关领域的研究者提供参考。
二、多克隆抗体的概念与作用多克隆抗体是指由多个B细胞克隆产生的具有相同抗原结合能力的抗体。
它们可以识别并结合抗原的不同表位，从而提高抗体的针对性和广泛性。
多克隆抗体在免疫检测、疾病诊断、治疗肿瘤和病毒感染等方面具有显著作用。
三、多克隆抗体的制备方法1.动物免疫：选用适合的动物（如小鼠、兔子等）进行免疫，通常采用皮下注射或静脉注射的方式，使动物产生针对特定抗原的免疫应答。
免疫周期一般为2-3周，期间需要多次注射抗原。
2.融合细胞培养：收集免疫动物的脾细胞和骨髓瘤细胞，进行细胞融合。
融合后的细胞能够在体外培养条件下生长繁殖，并分泌针对抗原的抗体。
3.筛选与克隆：筛选出具有特定抗原结合能力的杂交瘤细胞，对其进行克隆化培养。
克隆化培养有助于获得具有相同抗原结合能力的抗体细胞株。
4.抗体检测与纯化：对筛选出的抗体细胞株进行抗体检测，筛选出具有较高抗体滴度的细胞株进行体外培养。
培养后的抗体需进行纯化，以获得高纯度的多克隆抗体。
纯化方法包括柱层析、凝胶过滤等。
四、制备过程中的注意事项1.抗原的选择：选用具有良好免疫原性的抗原，以提高抗体的免疫应答效果。
2.动物免疫方案：根据动物种类和抗原性质制定合适的免疫方案，包括抗原剂量、免疫途径和免疫周期。
3.细胞融合与培养：确保细胞融合充分，避免未融合的细胞或融合细胞的自融合。
培养过程中注意观察细胞生长状态，以保证抗体产量和质量。
4.抗体检测与纯化：采用可靠的抗体检测方法，如ELISA、免疫组化等。
抗呕吐毒素多克隆抗体的制备、纯化及鉴定
验用兔有 限公 司。
１２ 方 法 ．
［ 关键词 ］ 呕吐毒素 ；多克隆抗体 ；鉴定 ［ 中图分类号 ］ Ｒ ９ ． １ ３ ２ １ ［ 文献标识码 ］ Ｂ
１２ １ 完全抗原 的制备 ．．
（） １ 分别 称取 Ｄ Ｃ０ ７ 、 ＨＳ Ｃ ．８ｍｇ Ｎ
足 Ｅ ＩＡ检 测 的需 要 。 ＬＳ
１ ６孔酶标板 ： ｏ ｎ 公 司 。脱 氧 雪腐 镰刀 菌 烯醇 （ Ｏ ）、 Ｃｍｉ ｇ ＤＮ
弗 氏不完全佐剂 （Ｉ Ｆ Ｃ Ａ）、弗 氏完全佐剂 （Ｃ Ａ）、牛血清 白 Ｆ 蛋 白（ Ｓ ）、卵清 蛋 白（ Ｖ ）均购 自于 Ｓｇ ａ 司 ； 根过 ＢＡ ＯＡ ｉ 公 ｍ 辣
１ｍＬ 只 要试剂 Ｄ Ｎ的完全抗原和多克隆抗体基本来 自于国 Ｏ 动物背部皮下多点注射 ， ／ 。初次免疫后 的免疫称为加 强免疫 ， 加强免疫 用福 氏不完 全佐 剂乳 化 ，第 １次加强 免疫 外， 价格 昂贵。我们在本实验室合成了 Ｄ Ｎ免疫抗 Ｏ
于 Ｄ Ｎ的检 测 方 法 ，主要 包 括 薄 层 层 析 法 （ Ｌ 、 方法与免疫抗原 相同 。 Ｏ Ｔ Ｃ） 高效液 相色谱 法 （ Ｐ Ｃ 、气相 色谱 法 （ Ｃ 、Ｌ － １２ ２ 抗 血清的制备 选 ３只健康新 西兰雄性大 白兔 ， ＨＬ ） Ｇ ） Ｃ ． ． 取其 Ａ Ｃ． ＰＩ ＭＳ和免 疫 学 检 测 方 法 。免 疫 学 检 测 方 法 具 有
变的小麦、大麦、玉米 等谷物 籽实 中， 有急性 毒 透析 ７ ，每 １ 透析液 １次 ， 液用小瓶分 装 ， 空冷 具 ２ｈ ２ｈ换 溶 真 性 、免疫 毒 性 和 胚 胎 毒 性 等 危 害 Ｉ 。 目前 国 内关 冻干燥后 ， ４Ｃ保存 。制备 包 被抗 原 所用 的蛋 白为 Ｏ Ａ， ４ 在 ￣ Ｖ
牛乳铁蛋白多克隆抗体的制备、纯化及定量检测
酶 联 免 疫 吸 附 测 定 （ｅｎｚｙｍｅ—ｌｉｎｋ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒ— ｂｅｎｔ ａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）方 法 是 检 测 特 定 蛋 白质 的有 效 方 法 ，具 有 快 速 、灵 敏 、简便 、载 体 易 于 标 准 化 等 优 点 。ＥＬＩＳＡ方 法 结 合 十 二 烷 基 硫 酸 钠 一聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 （ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ—ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＳＤＳ—ＰＡＧＥ）可用 于 针 对 特 定 抗 原 的定 性 和定 量 检 测 。 利 用 此 种 方 法 检 测 生 鲜 乳 及 乳 制 品 中 的乳铁 蛋 白浓 度 需 要 用 到 相 应 的 乳 铁 蛋 白抗 体 ，而 Ｓｉｇｍａ公 司 出售 的 商 品 化 抗 体 价 格 昂贵 ，不 适 合 大批 量样 品 检 测 。因 此 ，本 试 验 通 过 免 疫 新 西 兰大 白兔 来 制 备 兔 抗 牛 乳 铁 蛋 白多 克 隆 抗 体 ，旨在 为 研 究 奶 牛 乳 铁 蛋 白 的 合 成 调 控 提 供 有 效 的试 验 材 料 。为 得 到 纯 度 较 高 、特 异 性 较 强 的抗 体 ，通 过 饱 和 硫 酸 铵 法 和 蛋 白 Ａ 树 脂 对 抗 血 清 进 行 纯 化 ，纯 化 后 得 到 的抗 体 用 ＥＬＩＳＡ 方 法 测 定其 效 价 以 及 与 乳 铁 蛋 白的 抑 制 率 ，以 期 为 定 量
（中国农 业科学 院北 京畜牧兽 医研究所 ，动物 营养学 国家重点实验 室 ，北 京 １００１９３）
摘 要 ：本 试 验 旨在 制备 高 纯度 和特 异 性 的 牛Байду номын сангаас 铁 蛋 白 多克 隆抗 体 ，为 鉴 定 并 定 量检 测 牛 奶 样
白假丝酵母菌天冬氨酸蛋白酶Sap2多克隆抗体的制备、纯化及鉴定
溶性 的融合蛋 白； 用可溶性 Ｓ ａ ｐ ２免疫小 鼠制备抗血 清 ， 间接酶 联免疫 吸附试验 （ Ｅ Ｉ Ｉ Ｓ Ａ） 检测抗 血清效 价 ， 亲和层
析法纯化抗血 清后 ， 利用 Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ免疫 印迹 （ Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ Ｂ ｌ ｏ ｔ ） 检测抗体特异性 。结 果 该研究成功 制备 了抗 Ｓ ａ ｐ ２多 纯化 后 的 克隆抗体 ， 抗体效价＞ １： ５ １ ２ ０ ０ ； Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ Ｂ ｌ ｏ ｔ 检测结果表 明 ， 该 抗体可 特异性识 别 Ｓ ａ ｐ ２蛋 白。结 论 性 白假丝酵母菌感染奠定 了基础 。
提取 白假 丝酵
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
母菌基 因组 Ｄ ＮＡ 为模 板 ， 经 聚合 酶 链 反 应 （ Ｐ Ｃ Ｒ） 获取 Ｓ ＡＰ ２ 目的基 因 ； 双酶切 Ｓ ＡＰ ２基 因与 原 核 表达 载 体
ｐ ＭＡＬ － ｃ ２ ｘ （ ＋） ， 构建 ｐ ＭＡ Ｌ － ｃ ２ ｘ ／ Ｓ ＡＰ ２重组质粒 ； 在大肠埃希菌 Ｂ Ｌ ２ １ （ Ｄ Ｅ ３ ） 感 受态细胞 中经 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ诱 导表达出可
Ｓ ａ ｐ ２作为抗原免 疫小 鼠， 有较好 的抗原性 和免疫原性 ， 可成功制备 多克隆抗体 ， 并具有高特异性 ， 为快速 检测 侵袭
［ 关 键
词］ 白假丝 酵母 菌 ； 分泌型天冬氨 酸蛋 白酶 ； 多克 隆抗体 ；抗原 ； 抗体 ［ 文献标识码］ Ａ ［ 文章编号］ １ ６ ７ １ —９ ６ ３ ８ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ４—０ ２ ４ １ —０ ６
中国感染控制杂志 ２ ０ １ ３年 ７月第 １ ２卷第 ４期
Ｃ ｈ ｉ ｎ Ｊ Ｉ ｎ ｆ ｅ ｃ ｔ Ｃ ｏ ｎ ｔ ｒ ｏ ｌ Ｖｏ ｌ １ ２ Ｎｏ ４ Ｊ ｕ ｌ ２ ０ １ ３
牛乳铁蛋白多克隆抗体的制备、纯化及定量检测
牛乳铁蛋白多克隆抗体的制备、纯化及定量检测王建;郝丽媛;魏婧雅;孙鹏【摘要】This study aimed at preparing polyclonal antibody against lactoferrin in milk with high purity and specificity to provide experimental materials for the identification and quantification of lactoferrin synthesized in milk and mammary gland. Four healthy New Zealand white rabbits were immunized with bovine lactoferrin and challenged again after 4 weeks. Thereafter,the rabbits were immunized once every 2 weeks until antibody titer was desirable. Then the blood was collected from the heart and the serum was obtained. The antibody was puri-fied by the saturated ammonium sulfate method and protein A resin. The sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)and Western-blot were used to identify the purity and specificity of the puri-fied antibody. Antibody titer was determined and the curve of antibody inhibition was obtained. Finally, we used the obtained antibody to quantitatively determine lactoferrin in commercial liquid milk, milk powder and the homogenate of mammary gland tissue of dairy cows. The results showed that the obtained rabbit anti-bovine lactoferrin polyclonal antibody had high purity and specificity, the antibody concentration was 11.02 mg/mL, and the titer was 1:128 000;lactoferrin concentration in mammary gland tissue of dairy cows was 16.13 μg/g, that in commercial liquid milk was close to 0, and that in milk powder was 5.28 μg/g. In conclusion, lacto-ferrin polyclonal antibody with high purity and specificity was prepared bysaturated ammonium sulfate method and protein A resin in the present study, which can be used to identify lactoferrin in products like milk.%本试验旨在制备高纯度和特异性的牛乳铁蛋白多克隆抗体,为鉴定并定量检测牛奶样品中及奶牛乳腺组织中合成的乳铁蛋白提供试验材料.选用4只健康新西兰大白兔,初次免疫乳铁蛋白4周后进行加强免疫,每2周加强免疫1次,待血清达到抗体效价后,对兔进行心脏采血并分离血清,利用饱和硫酸铵法和蛋白A树脂纯化抗体,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western-blot)法分别用于鉴定纯化后抗体的纯度和特异性.测定纯化后抗体效价,并绘制抗体抑制曲线.最后利用所得抗体对市售液态奶、奶牛乳腺组织匀浆液、奶粉样品中的乳铁蛋白进行定量检测.结果表明,本试验制备的兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体纯度较高、特异性较强,抗体浓度为11.02 mg/mL,效价达到1:128000;采用该抗体测定的乳腺组织样品中乳铁蛋白浓度为16.13 μg/g,液态奶中接近于0 μg/g,奶粉中为5.28 μg/g.总之,本试验采用经过饱和硫酸铵法和蛋白A树脂2步纯化后得到了纯度较高、特异性较强的兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体,可以用于牛奶等产品的乳铁蛋白鉴定.【期刊名称】《动物营养学报》【年(卷),期】2018(030)001【总页数】7页(P100-106)【关键词】乳铁蛋白;多克隆抗体;抗体纯化【作者】王建;郝丽媛;魏婧雅;孙鹏【作者单位】中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,动物营养学国家重点实验室,北京100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,动物营养学国家重点实验室,北京100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,动物营养学国家重点实验室,北京100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,动物营养学国家重点实验室,北京100193【正文语种】中文【中图分类】S852.2近年来，人们对乳品质的要求越来越高，乳蛋白作为衡量乳品质的重要指标，其合成的营养调控已经成为奶牛营养学研究的热点。
多克隆抗体的制备实验报告
多克隆抗体的制备实验报告实验二多克隆抗体的制备实验目的和要求：1、掌握多克隆抗体制备方法2、多克隆抗体纯化、保存及效价测定实验内容：1、猪链球菌（2、7、9型）分型血清制备2、猪链球菌（2、7、9型）分型血清效价测定实验方法和步骤：（一）相关免疫血清的制备2014年11.25达，2014年12.2 注射2.0ml抗体1、实验动物分组：成年家兔4组，2只/组2、适应新环境之后，进行免疫：加入之前实验制备的猪链球菌全菌抗原，2ml/只，首免-2w后二免-4w后三免3、采血：首免后2w-4w-6w采血，耳缘静脉采血3mL5、分离血清之后，-20℃保存备用（二）琼脂扩散实验：材料和试剂1、PH8.6，0.1M巴比妥——巴比妥钠缓冲液巴比妥钠10.3 g，巴比妥 1.84 g，硫柳汞100 mg（防腐剂），蒸馏水加热溶解并定容至500ml。
2、1%预复琼脂（或琼脂糖）1g琼脂（或琼脂糖）加蒸馏水100ml溶化即可。
3、1%琼脂糖凝胶1g琼脂糖加50ml蒸馏水置水溶中煮沸溶解或用与波炉加热溶解（注意不要溢出且注意加入蒸发的水），然后再加入50ml上述巴比妥缓冲液混匀，置4℃保存备用。
4、抗原及相应免疫血清。
1．预复琼脂玻板的制备将溶化的1%预复琼脂用滴管加玻板上，使之能将表面覆盖即可，放于温箱内干燥（或自然干燥），即可用以制备凝胶板。
2．凝胶板的制备溶化琼脂糖，在水平桌上将溶化的琼脂糖倒在预复琼脂玻板上，制成厚度约3～4mm厚的琼脂糖凝胶板，待冷却后根据所需形状打孔（注意不宜在室温下放置过久，尽量缩短操作时间，以免干燥）。
3．免疫扩散及结果观察将抗原加入中心孔，倍比稀释的免疫血清加入周围孔，留1孔加双蒸水，以作空白对照（注意：加样至孔满为止，不可外溢）。
待孔内液体渗入凝胶后即可放于温盒中（如需要可重复加样，加样间隔时间应掌握在第一次加样后孔内液体尚未完全扩散完的情况下即加入，以免孔周围形成不透明的白色圈）。
抗STa多克隆抗体的制备、鉴定和纯化
抗STa多克隆抗体的制备、鉴定和纯化胡文丽;匡雪;简宗辉;王皓然;段锐锐;陈培富【摘要】产肠毒素大肠杆菌(ETEC)可引起人及动物急性腹泻,其关键毒力因子为耐热肠毒素(ST).由于ST是一种具有强烈毒性但缺乏免疫原性的小分子肽,如何在保持其免疫原性的同时减弱其毒性已成为制备ST类毒素疫苗的研究热点.本试验以利凡诺法提纯兔血清白蛋白(RSA),经0.2％戊二醛活化,再与人工合成的甲醇可溶性STa 偶联,十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示获得分子质量约108.5 ku的完全抗原.用该偶联物免疫新西兰白兔4次,采集抗血清并用Protein A/G琼脂糖小珠进行纯化,斑点酶联免疫吸附试验(dot-ELISA)和免疫印迹(Western blotting)结果显示抗血清效价均为1∶400.试验结果表明抗STa多克隆抗体成功制备,这为筛选ST结构类似物做有益的铺垫.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2015(042)005【总页数】6页(P1082-1087)【关键词】耐热肠毒素(ST);偶联物;多克隆抗体【作者】胡文丽;匡雪;简宗辉;王皓然;段锐锐;陈培富【作者单位】云南农业大学动物科学技术学院,昆明650201;云南农业大学动物科学技术学院,昆明650201;云南省曲靖农业学校,曲靖655000;云南农业大学动物科学技术学院,昆明650201;云南农业大学动物科学技术学院,昆明650201;云南农业大学动物科学技术学院,昆明650201;云南农业大学动物科学技术学院,昆明650201【正文语种】中文【中图分类】Q813.2研究统计结果表明，国内约有35%的仔猪腹泻是由产肠毒素大肠杆菌（ETEC）引起的［1］，ETEC通过黏附素（普通菌毛）定植于小肠黏膜上皮，然后分泌肠毒素导致腹泻；美国等国家新生仔猪腹泻中，由ETEC引起的占45%以上［2］。
伴随着集约化养猪业的发展，病原性大肠杆菌病已成为危害畜牧业的重要细菌病之一，给养殖业带来了严重的危害和巨大的经济损失。
大肠杆菌多克隆抗体的制备和检测
一、实验目的
• 1、学习掌握凝集反应原理与方法 、
二、实验原理
• 1、多克隆抗体 、 • 由多个克隆细胞产生的多种抗体的混合物 即多克隆抗体， 即多克隆抗体，也称第一代人工抗体 天然抗原
(多个抗原表位) 多个抗原表位)
三、实验器材
• 恒温培养箱、高速离心机 恒温培养箱、 • 大肠杆菌、生理盐水、载玻片、家兔等 大肠杆菌、生理盐水、载玻片、
四、实验内容与步骤
• 1、抗原的制备 、 • 大肠杆菌菌悬液→60℃水浴 →稀释达 稀释达9 大肠杆菌菌悬液 ℃水浴1h 稀释达 亿个/毫升 毫升→无菌检查 亿个 毫升 无菌检查 • 2、免疫血清的制备 、 • 家兔耳缘静脉注射免疫 • 采血制备血清 • 3、凝集反应 、
机体
诱发多个B 诱发多个B细 胞克隆活化
产生多种针对不同表位的 相应抗体—多克隆抗体 相应抗体 多克隆抗体
2、凝集反应 、
• 颗粒性抗原（完整的病原微生物或红细胞 颗粒性抗原（ 与相应抗体结合， 等）与相应抗体结合，在有电介质存在的 条件下，经过一定时间， 条件下，经过一定时间，出现肉眼可见的 凝集小块。 凝集小块。 • 参与凝集反应的抗原称为凝集原，抗体称 参与凝集反应的抗原称为凝集原 凝集原， 凝集素。 为凝集素。可分为直接凝集反应和间接凝 集反应两类。 集反应两类。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实验九 多克隆抗体的制备，纯化及免疫电泳【实验目的】⒈ 加深对抗体基本知识的了解。
⒉ 了解多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。
⒊ 了解免疫电泳的基本过程和实验依据。
一、多克隆抗体的制备【实验原理】当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。
多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。
将抗原导入敏感动物体内后，可刺激网状内皮细胞系统，尤其是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。
如图所示，实验动物对初次免疫和二次免疫的应答有明显的不同。
通常初次免疫应答往往比较弱，尤其是针对于易代谢，可溶性的抗原。
首次注射后大约7天，在血清中可以观察到抗体但抗体的浓度维持在一个较低的水平，在大约10天左右抗体的滴度会达到最大值。
但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同，和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。
免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和二次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。
三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似：抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变，这种改变被称为免疫应答的成熟，具有重要的实际意义。
通常在抗原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。
【实验材料】⒈ 实验动物初次抗原注射后的周次0 1 2 3 4 5 6 7初次免疫 二次免疫血清中抗体的水平成年兔。
⒉实验器材特制兔盒；刀片；25G针头；1ml注射器；20 ml 血液收集管；药铲；离心机以及塑料离心管；加样器及加样管；烧杯。
⒊实验试剂⑴抗原；乙醇；20mM 磷酸缓冲溶液pH7.2。
⑵福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂：【实验方法】⒈抗原的制备抗原制备的主要目的在于在免疫动物体内产生最强、最适当的抗体。
由于纯化的抗原适合产生抗体，因此在注射前通常采用一些经典的方法，比如柱层析、分级萃取、亚细胞分离等进行抗原的分离和纯化。
如果多肽抗原在SDS/PAGE中为可见的单一带，抗原从凝胶中的抽提可作为纯化的最后一个步骤。
⒉预放血轻轻的将兔子放在特制兔盒中，处于放松状态的兔子采血会较容易。
按压兔子耳根部直至血管突出,然后将针头插入耳部血管的中上部，观察到进针后小心推出活塞收集血液1ml -5ml。
结束收集后，退出针头并按压伤处以制止血流，再用乙醇消毒。
取收集的血液在37°C 恒温箱中放置30分钟以防止激活补体系统，再将试管在4°C放置过夜使血液凝固。
用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4°C，10,000g离心10分钟，收集上清液在4°C保存。
⒊注射抗原⑴准备两只成年兔，将100µg抗原/兔溶入1ml磷酸缓冲溶液中待用。
在1ml福氏不完全佐剂中加入分枝杆菌制成完全佐剂，并加入1ml抗原溶液，剧烈震荡使之充分乳化，用3ml注射器抽取该乳化液，接上25G针头，排除注射器中的气泡。
从笼中取出兔子放在平坦处，在4个不同的部位进行皮下注射，两处在后背，两处在大腿处。
抚去注射处的兔毛并用乙醇消毒暴露的皮肤。
捏出皮肤，将针头以相对皮肤15度的角度进针，进针深度为1cm-2cm，小心不要刺入肌肉中，在4个不同部位分别各注射约500µl抗原溶液。
注射结束后，将针在注射处放置几秒钟后再轻轻拔出，并用乙醇在注射处消毒。
在4个部位重复上述操作。
用相同方法免疫另一只家兔。
⑵每4-6周注射抗原，并在注射后的7天-10天按照步骤2收集血液。
将收集的血液与注射前收集的血液进行比较，检查是否有抗体产生。
待确定产生抗体后可大量收集血液，但每只兔子收集血液不能多于40ml以防止休克。
⒋收集血液⑴将家兔轻轻放入固定架上,二甲苯涂于耳部血管的上中部，用刀片倾斜45°在该处切出0.23cm-0.3cm的切口使血液能自由的流出。
用消毒后的管收集滴出的血液，若在结束之前出现凝固可用温水轻擦切口处，再继续收集。
收集适量血液后可用消毒后的纱布轻擦患处，轻按患处10秒-20秒确定血流停止后方可结束。
⑵将血液在37°C恒温箱中放置30分钟，再在4°C放置过夜。
用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4°C，10,000g离心10分钟，收集上清液即为抗血清，可在-20°C保存数年。
【实验结果】利用蛋白质免疫印迹法或免疫电泳方法检查抗体产生情况。
二、亲和层析法纯化抗体【实验原理】如图所示，亲和层析的高度选择性使得从某一初始材料中纯化，富集某一含量较低的目的蛋白成为可能，因此亲和层析是蛋白质分离纯化过程中最有效的方法之一。
另外，如果配基与蛋白质的亲和能力很强，也可同时进行样品的浓缩。
虽然多数情况下不需要将抗体与其他血清蛋白分开，但如果一旦需要，蛋白A亲和层析是一种非常有效的分离方法。
蛋白A是从Staphylococcus aureus中获得，可与抗体重链的Fc片段相结合。
现在已知蛋白A可与多种哺乳动物的IgG相结合也可与某些IgM和IgA相结合。
如果将蛋白A与固相载体相连，例如sepharose CL-4B，这种填料可以成为分离和纯化不同类型，不同亚类抗体或抗体片断的重要工具。
【实验材料】⒈.实验仪器蛋白A柱（含10ml或5ml填料）；泵；离心管；离心机；pH试纸；过滤器；玻璃柱。
⒉.实验试剂⑴TBS缓冲溶液：6.06g Tris (50 mM), 8.78g NaCl (150 mM)以及0.5g叠氮化钠(0.05%)溶于1L蒸馏水中，并用HCl调节pH 7.4。
⑵中和缓冲溶液：121.2g Tris (1 M), 87.8g NaCl (1.5 M), 0.37g EDTA (1mM)及5g叠氮化钠(0.5%)溶于1L蒸馏水中，并用HCl调节pH8.0。
⑶洗脱缓冲溶液(pH2.7)：将3.75g甘氨酸(50 mM)溶解于1L蒸馏水中，用HCl调节pH2.7。
⑷洗脱缓冲溶液(pH1.9)：将3.75g甘氨酸(50 mM)溶解于1L蒸馏水中，用HCl调节pH1.9。
【实验方法】 ⒈ 准备蛋白A sepharose CL-4B 亲和柱通常准备5ml 或10 ml 蛋白A sepharose CL-4B 填料，在真空瓶中将等体积的填料和TBS 缓冲溶液混合，搅拌。
抽真空约15分钟以除去填料中的气泡，否侧在柱中形成的气泡影响柱子的容量和分离效果。
将蛋白A sepharose CL-4B 填料缓慢加入玻璃柱中，利用泵控制填充速度为1 ml/分-2 ml/分，避免柱干，利用10倍于床体积并经过预冷的TBS 缓冲溶液平衡柱子。
⒉ 制备抗血清将抗血清放入冰水或4°C 冰箱中缓慢解冻以避免蛋白质的聚集。
在蛋白质解冻过程中出现的聚集可通过37°C 预热而溶解。
加入固体叠氮化钠至浓度为0.05%，4°C ，15,000xg 离心5分钟，移出澄清的抗血清再经过滤器过滤除去多余的脂。
⒊ 亲和层析将抗体用TBS 缓冲溶液以1：5的比例进行稀释，再用过滤器进行过滤。
以每分钟0.5 ml 的速度将抗血清上到柱上,为保证抗血清与填料的结合，需连续上柱2次并保留上样流出液。
用TBS 缓冲溶液清洗柱子至A λ280nm <0.008后加pH2.7洗脱缓冲溶液，以0.5ml/min 的速度洗脱至所有蛋白均流下来。
用已经加入100ul 中和缓冲溶液的1.5 ml EP 管分管收集洗脱液，混匀后用pH 试纸检查洗脱液的pH ，如果pH 低于7可利用中和缓冲液调至约pH7.4以防止抗体的变性。
在柱中加入10ml,pH1.9洗脱缓冲溶液，按上述方法收集洗脱液至A λ280nm <0.008。
利用分光光度计测定各管中蛋白质的含量。
若蛋白浓度低于0.5mg/ml 可加入10%的甘油以便保存，将纯化的抗体分装后在2°C~8°C 保存。
用含0.05%叠氮化钠的TBS 缓冲溶液清洗柱子后将柱子储存在2°C~8°C 环境。
【实验结果】利用SDS/PAGE 检查洗脱获得的蛋白纯度并利用免疫电泳技术检查纯化后抗体的滴度。
+++2. 特异性结合目标蛋白3. 分离已结合蛋白亲和层析的基本过程 1. 配基与载体相连【注意事项】⒈叠氮化钠有毒，应戴手套并小心操作⒉在纯化过程中，预冷的TBS缓冲溶液可减少蛋白质的非特异性结合和微生物的代谢。
三、免疫电泳【实验原理】免疫电泳又称为γ球蛋白电泳或免疫球蛋白电泳技术，这是一种能够判断血液中三种免疫球蛋白IgM, IgG, IgA含量水平的实验方法。
在这项实验技术中，首先利用蛋白质的分子量和所带电荷的比值运用水平琼脂糖凝胶电泳技术将蛋白质进行分离，然后将特异性的抗体引入到与电泳方向平行的凹槽中，在抗原和抗体的扩散过程中，抗原和抗体适当比例的结合会导致沉淀的产生（如图）。
0.85%盐不仅可以终止扩散过程也可用于洗去未结合的蛋白，抗原和抗体结合所形成的沉淀线即可以肉眼观察也可利用染色方法观察。
免疫电泳技术不仅可用于血清或尿样中单克隆抗体的鉴定，也可用于其它方面，比如免疫复合物的筛选、别和鉴定等各种异常丙种球蛋白血症的识。
免疫电泳技术也是进行蛋白质常规评价的一种可靠，精确的实验方法，可观察蛋白质结构的变化和浓度的改变。
抗体抗原抗原/抗体复合物【实验材料】⒈实验器材水平电泳仪；打孔器；滴管；刀片；电源；水浴(55°C)；蒸馏水；烧杯(400-600ml)；加样枪(5-100ul)。
⒉实验试剂⑴纯化的抗体；蛋白质混合物；1%琼脂。
⑵Tris-巴比妥缓冲溶液：2.24g 巴比妥酸，4.43g Tris，0.053g 乳酸钙及0.065g 叠氮化钠溶于100ml 蒸馏水中。
⑶电泳缓冲溶液：将Tris-巴比妥缓冲溶液与蒸馏水按1：4的比例混合。
【实验方法】⒈准备琼脂糖凝胶将琼脂和电泳缓冲溶液混合放入90°C水浴加热至溶化，制成1%琼脂，将琼脂在冷却前铺在水平玻璃板上，待冷却至室温后，按图用内径4毫米的打孔器打孔及制作凹槽。
⒉电泳将用电泳缓冲溶液稀释的4%-5%的抗原用滴管小心放入小孔中，将胶板放入电泳槽中并用润湿的滤纸将胶板和电泳槽中的缓冲溶液相连。
盖上电泳槽盖，接通电源，6V/cm通电至前沿移动约35mm，时间约为1小时，利用示踪染料判断移动距离。
⒊扩散将胶板移出电泳槽并放在水平位置上,用滤纸润干胶板凹槽中的缓冲溶液,在凹槽中加入适量的抗体(0.2ml~0.25ml)，注意抗体不能溢出凹槽以避免污染.将胶板移至含有叠氮化钠且有一定湿度的盒内,加盖密封后在30°C水浴扩散至少10小时后，移至0.85%盐水中以终止扩散并洗去未结合的蛋白。