兔多克隆抗体的制备(2020)
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本文部分内容来自网络整理，本司不为其真实性负责，如有异议或侵权请及时联系，本司将立即删除！== 本文为word格式，下载后可方便编辑和修改！ ==兔多抗制备步骤篇一：制备兔多抗兔多抗的制备一．免疫动物实验动物：兔，大耳白，雌雄均可，6个月龄以上，2.5kg左右抗原剂量：首次200?g，以后1mg左右（或0.5mg/kg体重）每次200?g，3-4次即可（吴萌方案） 1颈背部皮下○2耳根后部皮下○3脚掌皮下○4后腿肌肉注射免疫途径：○免疫计划：初免与二免间隔2周，二免与三免间隔至少3周，二免后7-10天测效价。
1颈动脉放血，可得80ml ○2心脏采血采血方式：○二．颈动脉放血（一）器具1、手术刀1把2、手术剪2把3、眼科剪2把4、手术镊2把5、眼科镊2把6、止血钳2直4弯7、手术线8、血管插管9、玻璃容器 10、烧杯（内盛有水） 11、玻璃分针 12、固定架（二）药品1、2％普鲁卡因2、肾上腺素1mg/ml，1支3、酒精棉球三．步骤1．将动物仰面固定于动物固定架上，头部放低，暴露颈部。
2．沿颈部中线用2％普鲁卡因局部麻醉，15min后剪开颈中部皮肤10cm长，沿气管钝性分离皮下组织，暴露气管前的胸锁乳突肌。
3．轻轻分开胸锁乳突肌，在肌束下面靠近气管两侧，即见淡红色搏动的颈动脉，将两侧颈动脉仔细分离，于每侧动脉分别套入2根丝线，1根在远心端，1根在近心端。
4. 腹腔内注射肾上腺素1mg/ml 1支，以升高血压加快心率，避免因放血后血压降低造成凝集，影响取血量。
5. 先将一侧动脉远心端丝线结扎紧，然后在向心端用止血钳夹住（止血钳头部用细塑料管包裹，避免损伤动脉）。
用眼科剪在二侧丝线中间的动脉壁上剪开一小口，以便插入塑料放血管，再以向心端丝线固定，避免放血管从动脉内滑出。
6. 轻轻松开止血钳，使血液很快射入玻璃容器，直至血液缓慢点滴而出时，以同法在对侧动脉内插管放血，并将动物固定架后端抬高，增加放血量。
多克隆抗体的制备方法
多克隆抗体的制备方法多克隆抗体是由多个不同的免疫细胞（多克隆）产生的抗体混合物，可以识别并结合到目标生物标志物上。
多克隆抗体在科学研究、临床诊断和治疗中具有重要的应用价值。
制备多克隆抗体需要经过一系列复杂的实验流程，下面将详细介绍多克隆抗体的制备方法。
一、抗原的选择在制备多克隆抗体时，首先需要选择一个合适的抗原。
抗原通常是目标生物标志物的蛋白质或多肽片段。
选择抗原的关键因素包括其表达水平、稳定性和纯度。
抗原的选择直接影响到最终多克隆抗体的亲和力和特异性。
二、免疫小动物免疫小动物通常是用于制备多克隆抗体的主要实验动物，例如小鼠、兔子、大鼠等。
在免疫前需要确保小动物健康，并对其进行相应的预处理，如注射驱虫药物、进行适当的接种。
还需要根据具体实验要求决定预免疫、免疫计划以及免疫方案的制定。
三、免疫过程免疫过程是制备多克隆抗体的核心环节。
首先需将抗原与适当的佐剂混合，增强免疫原性，然后用于免疫小动物。
在免疫过程中需要控制免疫剂量和免疫间隔时间，以及监测动物的免疫应答情况。
免疫后还需要定期采集血清样本，监测抗体滴度的动态变化。
四、细胞融合与筛选经过一段时间的免疫后，需要从免疫动物的脾脏或骨髓中收集免疫细胞，然后与肿瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
随后采用限稀稀释法将杂交瘤细胞进行单克隆化分，筛选出高亲和力的多克隆抗体细胞株。
五、生产与纯化经过筛选的多克隆抗体细胞株需要进行扩大培养，生产足够数量的多克隆抗体。
之后通过蛋白质纯化技术，如亲和层析、离子交换层析等手段，从细胞培养上清液中纯化出多克隆抗体。
六、性质鉴定与应用纯化后的多克隆抗体需进行性质鉴定，包括亲和力、特异性、稳定性等方面的测试。
最后经过滤菌毒处理后，多克隆抗体可应用于科学研究、临床诊断、生物药物研发等领域。
多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，需要科学合理地选择抗原、合理设计免疫方案、熟练掌握细胞融合和筛选技术，以及对多克隆抗体进行严格的生产和性质鉴定。
多克隆抗体的制备
多克隆抗体的制备9.1 制备多克隆抗体(1) 采购新西兰大白兔，在免疫前取兔免疫前血清。
(2) 取2 ml的弗氏完全佐剂（Frund’s Adiuvant, complete，GIBCOBRL Cat. No1076471）加到含0.5 mg纯化抗原溶液（溶于2 ml的PBS中），搅拌使之充分乳化。
用5 ml注射器抽取此乳化液，接上22G注射针头，排出注射器中的气泡。
(3) 将兔子固定在操作台上，用70%乙醇对所要注射的区域进行清洁消毒，多点皮下注射乳化液。
(4) 四周后，用溶于弗氏不完全佐剂的1 mg抗原乳化液（1:1）对兔进行肌肉和皮下内加强免疫注射，操作步骤同1和2。
初次加强免疫后2周再次进行加强免疫注射。
(5) 第二次加强免疫注射14天后，从兔的耳缘静脉处放血。
使兔血顺管壁下落，以避免发生溶血。
(6) 将兔血在室温下静置数小时后置4℃过夜，用一木质的拨棒将血凝块轻轻的挑松并使之由离心管的侧壁脱落，将血清移到合适的离心管中，5000 g离心10分钟，去除残留的红细胞及其他碎片。
每两星期进行进一步的加强免疫。
每次加强免疫后10天，可采集一次兔血，兔的两只耳朵可轮流交替进行采血。
(7) 最后一次加强后一周到10天内，禁食一天取血检测滴度，达到一定滴度后，距离最后一次加强免疫2周内颈总动脉取血，室温放置2个小时或4℃过夜，4℃ 5000 rpm，离心20分钟收获血清。
9.2抗体的滴度检测及纯化9.2.1 ELISA检测抗体滴度(1) 包板: ELISA检测板中加入100μl用0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.6)配制的抗原(10μg/ml) 4℃包埋过夜。
(2) 抗原抗体反应：弃去板里的液体，用PBS-Tween(0.2%)洗一次，然后加入梯度稀释的抗体, 37℃反应1个小时。
用PBS-Tween洗3次，加入羊抗兔辣根过氧化物酶抗体，37℃反应15-30分钟。
用PBS-Tween洗6次。
(3) 显色：加入配制好的底物TMB显色。
兔多克隆抗体的制备流程
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1. 免疫原制备。
选择具有免疫原性的抗原，如蛋白质、多肽或多糖等。
兔抗CAP43多克隆抗体制备和初步纯化
【摘要】目的制备兔抗Cap43多克隆抗体。
方法以30个氨基酸组成的多肽为半抗原与钥孔血蓝蛋白(mcKLH)通过碳化二亚胺(EDC)法化学偶联成完全抗原(多肽-mcKLH)免疫家兔；制备兔抗Cap4443多克隆抗体；斑点ELISA法检测抗体效价，经辛酸-硫酸铵法初步纯化抗体后，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳考马斯亮蓝检测其纯化后的纯度。
结果经免疫11周得到兔抗Cap43多克隆体，抗体效价为1：500。
结论采用EDC化学偶联半抗原和大分子载体蛋白mcKLH，使其成为同时具有免疫原性与免疫反应性的完全抗原，用其免疫家兔获得多克隆抗体。
【关键词】半抗原流行病学和动物实验已证实，镍化合物可以致癌，以致肺癌为主。
为进一步研究Cap43在镍所特异引起肺癌者体内组织及血清中的表达水平及其特点，本实验采用硫化二亚胺(EDC)连接多肽与大分子载体蛋白的方法，使其组成完全抗原，进而免家兔制备抗Cap43多克隆抗体，为研究镍所致肺癌提供依据。
1 材料与方法1 1 材料多肽由上海生工全自动合成仪合成；EDC试剂盒(美国Pierce公司)，完全及不完全福氏佐剂(美国Sigma公司)；HRP-羊抗兔和 DAB (北京中杉金桥生物技术公司)；硝纤维素膜(NC膜)，SephadexTMG-25 脱盐柱(Amersham Biosciences,Sweden),小牛血清，牛血清白蛋白(洛阳华美公司)；loading buffer(北京碧云天生物公司)；其他试均为国产分析纯；日本大耳兔平均体重15kg(本校动物实验中心)。
1 2 方法12 1 Cap43特征性肽段的合成由上海生工合成Cap43 C末端特征性的由10个氨基酸(TRSRSHTSEG)重复3次所组成的肽段。
总质量为10mg，合成后期经HPLC纯化，纯度>95%。
冷冻干燥4℃保存。
12 2 免疫大耳白兔制备抗Cap43抗血清 (1)正式实验之前的动物准备：取5只体重1.5kg的雄性家兔作为免疫动物，同时抽取免疫前的动物血清作为阴性对照。
多克隆抗体的标准制备流程
多克隆抗体的标准制备流程包括以下步骤：
1.免疫原的选择：选择合适的免疫原，可以是蛋白质、多肽、细胞表面抗原等。
2.免疫动物的选择：选择适合的免疫动物，常见的包括小鼠、兔子等。
3.免疫动物的免疫：将免疫原注射到免疫动物体内，刺激其免疫系统产生特异性
抗体。
4.收集免疫动物的血清：在免疫动物免疫一段时间后，收集其血清，其中含有特
异性抗体。
5.抗体的纯化和鉴定：利用亲和层析、离子交换等方法对抗体进行纯化，并通过
蛋白质印迹、ELISA等方法对抗体进行鉴定。
6.抗体的保存：将纯化的抗体进行分装，并加入适量的防腐剂，放入-20℃的冰
箱中进行保存。
多克隆抗体的制备过程中需要注意以下几点：
1.免疫原的纯度和浓度要高，以保证产生的抗体特异性高、效价高。
2.免疫动物的种属差异会影响抗体的质量和效价，因此要选择与免疫原同种属的
动物作为免疫对象。
3.在免疫过程中要保证免疫原的质量和安全性，避免对动物造成不必要的伤害。
4.在纯化和鉴定抗体时，要选择合适的方法和试剂，以保证抗体的质量和特异性。
5.在保存抗体时要注意温度和湿度等环境因素，避免抗体失活或变质。
总之，多克隆抗体的制备是一个相对复杂的过程，需要严格按照标准流程操作，以确保抗体质量和安全性。
多克隆抗体的制备技术
多克隆抗体的制备技术
多克隆抗体的制备技术是一种利用多个B细胞克隆的方法，用于生产特定抗原的抗体。
具体步骤如下：
1. 抗原制备：首先，需要制备抗原。
抗原可以是蛋白质、病原体、多肽或其他分子，可以通过基因工程技术在大肠杆菌等表达系统中表达、纯化或合成。
2. 免疫小动物：将制备好的抗原注射到小动物体内（如小鼠、兔子或大鼠）作为免疫原。
这样做可以激发动物的免疫系统产生抗原特异性的抗体。
3. 收集抗体：收集免疫小动物产生的抗原特异性抗体。
一般情况下，可以通过静脉采血或收集腹水来获得抗体。
4. 抗体纯化：对采集到的抗体进行纯化，可以使用亲和层析或离子交换层析等技术进行精确的纯化。
5. 克隆：将纯化的抗体进行多次稀释，然后分别稀释至单个细胞级别。
接下来，将单个细胞分别种植在含有培养液的孔中，使其形成克隆。
6. 验证：对每个克隆进行酶联免疫吸附测定（ELISA）或其他检测方法验证抗体的特异性和亲和力。
7. 扩大培养：对验证合格的克隆进行扩大培养，使其产生大量的抗体。
通过以上步骤，可以制备出多个来自不同克隆的抗体，这些抗体可以与同一抗原结合，用于生物学研究、诊断和治疗等领域。
成年家兔制备多克隆抗体技术
在含有多种抗原决定簇的抗原刺激下，体内多个 B 细胞克隆被激活并产生针对多种不同表位的单克隆抗体，其混和物为多克隆抗体。
机体内所产生多克隆免疫血清实质上是由多种抗体组成的混合物，又称多克隆抗体。
本技术专题介绍以成年家兔制备多克隆抗体一、实验原理当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。
多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。
二、实验材料1. 实验动物成年兔。
2. 实验器材特制兔盒；刀片；25G针头；1ml注射器；20 ml 血液收集管；药铲；离心机以及塑料离心管；加样器及加样管；烧杯。
3. 实验试剂(1) 抗原；乙醇；20mM 磷酸缓冲溶液pH7.2。
(2) 福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂：福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂的成分（福氏完全佐剂的制备：使用前在福氏不完全佐剂中加入适量杀死的分枝杆菌）三、实验步骤(一) 抗原的制备抗原制备的主要目的在于在免疫动物体内产生最强、最适当的抗体。
由于纯化的抗原适合产生抗体，因此在注射前通常采用一些经典的方法，比如柱层析、分级萃取、亚细胞分离等进行抗原的分离和纯化。
如果多肽抗原在SDS/PAGE中为可见的单一带，抗原从凝胶中的抽提可作为纯化的最后一个步骤。
(二) 预放血轻轻的将兔子放在特制兔盒中，处于放松状态的兔子采血会较容易。
按压兔子耳根部直至血管突出,然后将针头插入耳部血管的中上部，观察到进针后小心推出活塞收集血液1ml -5ml。
结束收集后，退出针头并按压伤处以制止血流，再用乙醇消毒。
取收集的血液在37°C恒温箱中放置30分钟以防止激活补体系统，再将试管在4°C 放置过夜使血液凝固。
用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4°C，10,000g离心10分钟，收集上清液在4°C保存。
多克隆抗体的制备方法
抗体的制备方法与原理一、抗血清的制备有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。
（一）用于免疫的动物作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。
动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。
若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。
（二）免疫途径免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。
途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。
（三）佐剂由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。
佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。
常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg卡介苗就成为完全佐剂。
配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。
免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。
一种兔抗人肌红蛋白多克隆抗体血清的制备方法[发明专利]
![一种兔抗人肌红蛋白多克隆抗体血清的制备方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/4ef2b8b7804d2b160a4ec0c7.png)
专利名称：一种兔抗人肌红蛋白多克隆抗体血清的制备方法专利类型：发明专利
发明人：刘永需,柳飞,赵红,孟庆福,罗杰,庄桂玉,吴硕
申请号：CN201911116283.5
申请日：20191115
公开号：CN110746506A
公开日：
20200204
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种兔抗人肌红蛋白多克隆抗体血清的制备方法，该方法包括以下步骤：抗原准备：选用人肌红蛋白抗原，注射前以弗氏佐剂进行乳化得抗原乳剂；使用上述抗原乳剂对兔进行多次注射；血清效价检测：注射后8‑10天采血，分离血清，检测其双扩效价；首次注射部位为10个，后足掌及背部皮下选取多个部位点进行注射，第二次到第五次免疫注射部位在背部皮下选取多个部位点进行注射，第六次免疫注射部位为兔耳静脉注射。
采用本发明方法，成本低，过程简单，生产抗体质量稳定，抗体生产速度快，抗体水平高，抗原用量小。
使大规模生产高质量诊断试剂原料成为可能，更好地服务于诊断行业。
申请人：青岛康大生物科技有限公司
地址：266406 山东省青岛市黄岛区张家楼镇驻地
国籍：CN
代理机构：北京律远专利代理事务所(普通合伙)
代理人：张燕
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多克隆抗体的制备方法
多克隆抗体的制备及效价测定多克隆抗体的制备步骤一、器材剪刀(剪兔毛用)一把、弯头眼科手术镊子(游离血管用)一把、直头眼科手术剪(剪血管用)一把，手术刀架，手术刀片，注射器(1ml、10ml，25ml)附针头，兔子固定架，灭菌三角烧瓶(200ml)或平皿(直径18cm)、弯头止血钳四把，直头止血钳两把，手术缝合线，塑料放血管，纱布等。
二、试剂生理盐水(或PBS)弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant，FCA)弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant，FIA)二甲苯，酒精棉，脱脂棉，2% NaN3三、免疫原：蛋白或KLH偶联的多肽。
每次免疫100-200μg免疫原。
四、兔子的选择兔子的重量应在四斤以上，两耳光滑，明显可见耳静、动脉，健康。
五、免疫用生理盐水稀释免疫原，然后与相应的佐剂进行1:1混合。
抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射。
每个区域大约用1/4的免疫原。
这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。
注：抗原注射以前需要收集一些正常血清，已备检测抗体时作为阴性对照。
待兔子在新环境中稳定，大概需要四天左右时间，可以进行耳动脉取血。
取血量约5ml足矣。
免疫用的抗原必须纯化，否则影响抗体的质量。
抗原经FCA或FIA充分乳化后才能注射。
将抗原液与佐剂等比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡使抗原充分乳化，乳化过程比较费时、费力，但若乳化不充分，会影响免疫的效果，振荡后，1000rpm离心一分钟，如水相和油相不分层即可注射。
首次免疫用FCA，以后都用FIA。
免疫方法可采用背部多点注射法。
即于家兔脊柱两旁选4-6点皮下注射，每点注0.1ml，间隔2周后再于上述部位选不同点注射(不要选择临近位点，否则溃疡愈合不好)。
每次免疫的抗原量约100μg。
免疫次数在四五次即可，抗原用量大可以减少次数。
六、取血：免疫一周后，可以耳动脉取血检测抗体效价。
制备兔多抗
兔多抗的制备一．免疫动物实验动物：兔，大耳白，雌雄均可，6个月龄以上，2.5kg左右抗原剂量：首次200μg，以后1mg左右（或0.5mg/kg体重）每次200μg，3-4次即可（吴萌方案）免疫途径：○1颈背部皮下○2耳根后部皮下○3脚掌皮下○4后腿肌肉注射免疫计划：初免与二免间隔2周，二免与三免间隔至少3周，二免后7-10天测效价。
采血方式：○1颈动脉放血，可得80ml ○2心脏采血二．颈动脉放血（一）器具1、手术刀1把2、手术剪2把3、眼科剪2把4、手术镊2把5、眼科镊2把6、止血钳2直4弯7、手术线8、血管插管9、玻璃容器 10、烧杯（内盛有水） 11、玻璃分针 12、固定架（二）药品1、2％普鲁卡因2、肾上腺素1mg/ml，1支3、酒精棉球三．步骤1．将动物仰面固定于动物固定架上，头部放低，暴露颈部。
2．沿颈部中线用2％普鲁卡因局部麻醉，15min后剪开颈中部皮肤10cm长，沿气管钝性分离皮下组织，暴露气管前的胸锁乳突肌。
3．轻轻分开胸锁乳突肌，在肌束下面靠近气管两侧，即见淡红色搏动的颈动脉，将两侧颈动脉仔细分离，于每侧动脉分别套入2根丝线，1根在远心端，1根在近心端。
4. 腹腔内注射肾上腺素1mg/ml 1支，以升高血压加快心率，避免因放血后血压降低造成凝集，影响取血量。
5. 先将一侧动脉远心端丝线结扎紧，然后在向心端用止血钳夹住（止血钳头部用细塑料管包裹，避免损伤动脉）。
用眼科剪在二侧丝线中间的动脉壁上剪开一小口，以便插入塑料放血管，再以向心端丝线固定，避免放血管从动脉内滑出。
6. 轻轻松开止血钳，使血液很快射入玻璃容器，直至血液缓慢点滴而出时，以同法在对侧动脉内插管放血，并将动物固定架后端抬高，增加放血量。
2.5kg白兔可放血约80ml。
7. 将玻璃器皿加盖置37℃温箱1h，再放4℃冰箱过夜，待血块收缩后分离血清。
抗体存在于血液的血清部分，采血后一旦血清析出，应立即将血清与血细胞分离。
多克隆抗体(polyclonal antibody)制备
多克隆抗体(polyclonal antibody)制备1. 免疫动物：两只新西兰兔2. 佐剂：首先用完全弗氏佐剂（CFA），后用不完全弗氏佐剂（IFA）。
3. 免疫原：蛋白或KLH偶联的多肽。
每次免疫100-200μg免疫原。
4. 免疫：用生理盐水稀释免疫原，然后与相应的佐剂进行1:1混合。
抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射。
每个区域大约用1/4的免疫原。
这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。
5. 取血：用19号针头对兔子进行耳动脉取血，室温过夜析出血清。
6. 第0星期采血2ml（获得0.5-1ml免疫前血清）完全弗氏佐剂（CFA）混合的200μg抗原免疫兔。
第2星期完全弗氏佐剂（CFA）混合的200μg抗原免疫兔。
第4星期不完全弗氏佐剂（IFA）混合的100μg抗原免疫兔。
第5星期取检测血清20-30ml取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在生理盐水中的100μg抗原免疫兔。
第6星期如果检测阳性第一次采血20-30ml,溶解在生理盐水中的100μg抗原免疫兔；如果上次检测是阴性，取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测。
第7星期第二次采血20-30ml,溶解在生理盐水中的100μg抗原免疫兔；如果检测仍为阴性，需要讨论这个项目是否继续。
第8星期第三次采血20-30ml,溶解在生理盐水中的100μg抗原免疫兔。
第9星期末次放血20-30ml,纯化混合血样，平均每次纯化可以获得100-150mg抗体，最后进行ELISA和WB等质量检测。
7. 注意：在整个项目中，兔子需要保持9周的免疫和放血。
检测的结果将决定这个项目的继续、修改或终止【注意事项】大家在用药的时候，药物说明书里面有三种标识，一般要注意一下：1.第一种就是禁用，就是绝对禁止使用。
2.第二种就是慎用，就是药物可以使用，但是要密切关注患者口服药以后的情况，一旦有不良反应发生，需要马上停止使用。
兔抗IVM多克隆抗体的制备
兔抗ＩＶＭ多克隆抗体的制备摘要：将伊维菌素(IVM)进行化学修饰，引入羧基活性基团，合成具有半抗原结构特征的伊维菌素半琥珀酸酯(IVM－HS)；然后采用NHS法和混合酸酐法将半抗原与聚－L－赖氨酸(PLL)和卵清蛋白(OV A)相偶联，制备人工免疫原(PLL －IVM－HS)和包被原(OV A－IVM－HS)；经凝胶电泳鉴定，用人工免疫原免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体(pAb)，间接ELISA测定其效价｡结果人工免疫原偶联成功，分子结合比为25．3∶1，获得了高价､敏感､特异性的IVM pAb，为IVM残留免疫学检测法的建立奠定了基础｡关键词：伊维菌素；半抗原；人工免疫原；多克隆抗体The Preparation of Polyclone Antibody for Indirect Competitive ELISA of IvermectinResidueAbstract：The active group carboxyl was introduced to Ivermectin (IVM) and formed IVM half succinaate (IVM－HS) which had hapten structure by chemical modification．The method of NHS was used to conjugate IVM－HS to PLL and obtained artificial immunogen PLL－IVM－HS，the coating antigen OV A－IVM－HS was obtained by mixed anhydride reaction method．SDS－PAGE was used to identify PLL－IVM－HS．New zealand white rabbits were immunized with PLL－IVM－HS，the titre of polyclonal antibody(pAb) was detected by indirect ELISA．The results showed that PLL－IVM－HS had been synthesized successfully and its conjugation ratio of IVM－HS to PLL was about 25．3∶1，the high－titer，sensitive and specific IVM pAb had been produced in sera of immunized new zealand white rabbits．This made it possible to establish immunoassay of IVM residues in feed and animal food．Key words：ivermectin；hapten；artificial immunogen；polyclonal antibody伊维菌素(Ivermectin，IVM)是大环内酯类抗寄生虫药物，由于其具有活性强､杀虫谱广等优点，已被广泛地应用在畜禽及水产养殖业上，并且也是农业生产上广泛使用的一种农业杀虫剂，还在医学临床上广泛应用于皮肤病的治疗[1，2]｡但是此类药物在动物性食品中的残留可能会对人及环境产生潜在的危害，同时也严重影响我国农产品的国际竞争力｡传统的HPLC法因其操作过程复杂､费时､检测成本高，严重限制了其在实际操作中的可用性｡由于IVM的使用剂量很小，组织中药物最高残留限量为15～20 ng·g－1，因而对IVM残留的检测十分困难｡随着人们对IVM残留的毒性及环境风险的日益关注，急需更科学､快捷和高效的检测手段｡因此，开发一种简单､快速､适用现场监控的痕量分析方法具有重要的现实意义｡本文在人工抗原合成和鉴定的基础上，拟制备高效价的多克隆抗体，用于IVM的免疫化学分析研究，以期为开发具有自主知识产权的试剂盒奠定基础｡1材料与方法1．1材料1．1．1试验动物健康新西兰大白兔，体重约2 kg，由中牧集团兰州生物制药厂提供｡1．1．2主要试剂聚－L－赖氨酸(PLL)､卵清蛋白(OV A)､弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂(Sigma公司)；羊抗兔IgG－HRP(华美生物工程公司)；酶联免疫吸附测定(ELISA)中所用的试剂均为国产分析纯｡1．1．3仪器设备95－1型磁力搅拌器､台式高速冷冻离心机(日立公司)，DG21型酶联免疫检测仪(南京仪器厂)，pH精确测试仪(美国热电)，Sartorious 电子天平，FD－1冷冻干燥机｡1．2抗原合成和鉴定1．2．1免疫原[5－O－(单)琥珀酰IVM－PLL]和包被原[5－O－(单)琥珀酰IVM－OV A]的合成首先将IVM衍生化[3] ，在C5－OH引入羧基，然后分别采用NHS法和混合酸酐法实现IV A与PLL及OV A的交联｡反应后的终产物在4℃条件下透析3 d，多次换液，最初2 d用0．1 mol·L－1 PBS透析，第3天用蒸馏水透析，Sephdex g－200纯化，冷冻干燥保存｡1．2．2人工抗原的鉴定采用SDS－PAGE法进行鉴定，SDS－PAGE所用浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为15%，浓缩胶电压为80V，分离胶电压为120V，电泳完毕后用考马斯亮蓝R－250 2．5 g·L－1染色5 h，脱色液脱色至背景清晰为止｡凝胶成像系统软件计算载体蛋白与半抗原的结合比[4]｡1．3抗体的制备用合成的免疫抗原5－O－(单)琥珀酰IVM－PLL免疫健康新西兰大白兔，按常规制备血清[5]｡选6只2月龄､体重1．5～2 kg的健康新西兰大白兔，雌雄各半，取雌雄各1只作为阴性对照组，剩余4只为试验组｡将5－O－(单)琥珀酰IVM－PLL冻干粉用生理盐水溶解，配成1 g·L－1的溶液｡初次免疫用等量弗氏完全佐剂乳化后于兔子背部多点注射，每只 1 mL｡加强免疫用弗氏不完全佐剂乳化，第1次加强免疫于足下注射，以后的加强免疫于肌肉注射，每10 d加强免疫1次，剂量与初次免疫相同｡4次加强免疫后从耳缘静脉采血，采用间接竞争酶联免疫法测定抗血清效价｡待效价达到要求后，用耳静脉放血与心脏放血相结合获得抗血清，加入2 g·L－1叠氮钠和500 mL·L－1甘油，分装，－20℃保存备用[6]｡1．4抗体的鉴定1．4．1ELISA基本条件的建立采用间接ELISA法测定抗体效价｡用1 mg·L－1的溶液5－O－(单)琥珀酰IVM－OV A包被96孔酶标板，每孔100 μL，于4℃冰箱过夜｡充分洗涤后，用20 g·L－1的OV A溶液封闭酶标板，每孔200 μL，4℃冰箱过夜｡洗涤后，于37℃温育箱内烘干待用｡上述步骤使得测定的抗体效价是针对IVM的｡取4条酶标板条｡第1行加抗体稀释液作为空白对照；第2行加1∶1 000稀释的阴性血清；以下6行分别为1∶400､1∶800､1∶1 600､1∶3 200､1∶6 400和1∶12 800的阳性血清，每孔100 μL，室温孵育30 min｡然后依次加入HRP标记的羊抗兔IgG和TMB显色液，均为每孔100 μL，每一步都要经过洗涤和孵育｡最后用2 mol·L－1 H2SO4终止反应，测定OD450值｡用方阵滴定法测定抗体及包被原的工作浓度｡选择光密度值为1．0左右时的抗原浓度和抗体稀释度作为工作浓度｡1．4．2抗体敏感度的测定用间接竞争ELISA测定抗体对IVM的敏感度｡用含10%甲醇的PBST(0．01 mol·L－1 PBS，pH7．4，含0．05%的Twen －20)溶液｡配制0､0．01､0．10､1．00､2．00､10．00& #65380;20．00､100．00 μg·mL－1的标准溶液，与抗体预混过夜｡按已优化的竞争ELISA条件操作，将含0 ng·mL－1标准品孔的OD值减去含最大浓度标准品孔的OD值定为B0，其余孔OD值经同样方法校正后定为B；以B/B0值为纵坐标，相应的标准品浓度log值为横坐标，绘制标准曲线，并计算抑制中浓度(I50)及最低检测限(I10)｡1．4．3抗体特异性的测定为了检测所得抗血清是否对IVM有较强的特异性，采用间接竞争ELISA法，在最适工作浓度的抗血清中加入倍比稀释的IVM 标准液，事先进行预孵育，然后再加至酶标板上进行反应，观察各孔OD值的变化，基本步骤同效价测定，不同之处在于加样，配制浓度为1 mg·mL－1的IVM 母液，进行倍比稀释，50 μL IVM抗血清以二分之一工作浓度加等体积比稀释的IVM标准溶液，先在37℃孵育1h，同时以50 μL的抗血清和等体积PBS混合物作为标准，以50 μL PBS与50 μLPBS混合物作空白对照，然后再加到酶标板上进行反应，每孔100 μL，37℃孵育1 h｡1．4．4抗体的交叉反应性检测在优化的间接竞争ELISA基础上，测定与多拉菌素､莫西霉素的I50值，并计算其交叉反应率｡交叉反应率(%)=I50(IVM)/I50(竞争物)×1002结果与分析2．15－O－(单)琥珀酰IVM－PLL的SDS－PAGE分析合成的人工抗原5－O－(单)琥珀酰IVM－PLL的SDS－PAGE条带的迁移率比载体的迁移率略小(图1)，表明人工抗原的分子质量大于相应载体的分子质量，证明人工抗原合成成功｡并可以计算出结合比为25．3｡2．2抗体效价的测定间接ELISA的测定表明，用非免疫5－O－(单)琥珀酰IVM－OV A包被，以惰性蛋白OV A封闭及每一步骤均充分洗涤，便可排除非特异性吸附的可能，故测定的抗体效价是针对IVM的｡将获得的4种兔血清分别作ELISA试验，间接ELISA测定表明，若以A450≥阴性对照的2．1倍作为抗血清的效价，由此测得的抗血清效价为1∶12 800｡系列浓度的包被抗原包被酶标板，抗血清作7个稀释浓度，同时在一96孔酶标板上用方阵滴定法进行确定｡选择OD值在1．0左右，且抗原抗体用量最少的抗原包被物浓度和抗血清的稀释度为最适工作浓度｡包被抗原浓度为0．03 g·L－1，抗血清最适工作稀释度为1∶5 000｡2．3抗IVM标准工作曲线在上述优化条件下，将标准IVM溶液按间接竞争ELISA方法进行测定｡以标准IVM溶液浓度的对数为横坐标，以抑制率为纵坐标，绘制出标准曲线｡抑制率I=(B0－B)/B(B为样品OD值，B0为空白对照OD 值)｡最小检测限为0．94 ng·g－1，线性回归方程为y=62．30－19．07x｡选用与IVM具有相同大环内酯结构的多拉菌素和莫西霉素来做抗体的特异性分析｡结果表明，抗体对多拉菌素和莫西霉素的交叉反应率均小于0．1%｡3讨论特异性抗体的制备是利用免疫学方法进行化学药物残留分析的关键因素，小分子物质抗体的制备往往很困难｡而IVM属于小分子物质，本身无免疫原性，必须经过结构改造后与大分子载体蛋白结合方具有免疫原性｡笔者根据IVM的结构特点，将C5－OH进行结构改造，获得羧基后，与载体蛋白PLL 偶联在一起，免疫动物后产生IVM的特异性抗体｡采用间接ELISA法测定其效价达到1∶1．28×106｡Schmidt等报道了A VM单克隆抗体的制备，分别选择C4′及C5两个位点进行反应，用由C4′位羟基反应得到的半抗原与BSA偶联免疫balb/c系小鼠，产生了良好的免疫应答；而用由C5位羟基反应得到的半抗原，用同样的方法与BSA 及伴白蛋白(conalbumin)连接，却不具有免疫原性｡这可能是由于偶联物的结合比不同及制备方法不同(半抗原的不同活性位点与蛋白相连)引起的[7]｡本试验选用IVM C5位上羟基作为改造位点，将其转变为琥珀酸半酯，从而在分子中引入羧基，再用NHS法与PLL连接，合成的人工抗原经动物免疫证明具有良好的免疫原性｡参考文献：[1]朱兆璋，李骥联，沈寅初．天然杀虫素阿维菌素的结构改造产物伊维菌素[J]．农药译丛，1995，17(6)：21－28．[2]马少丽，李闻，郭志宏．阿维菌素对犬､驴和骡的毒性观察[J]．青海畜牧兽医，2001，31(3)：22－23．[3]EVRARD P，GASPAR P，MAGHUIN－ROGISTER g．Aspecific radioimmunoassay for the detection of 19－nortestosterone residues in urine and plasma of cattle[J]．Journal Oflmmunoassay，1986，7(4)：353－363．[4]KAMPS H C，CARLIN R J，SHEFFIELD C，et al．Analysis of hapten －carrier protein conjugates by nondenaturing delelectrophoresis[J]．Journal Immunological Methods，1993，164：245－253．[5]朱立平，陈学清．免疫学常用实验方法[M]．北京：人民军医出版社，2000．56．[6]孙敬方．动物试验方法学[M]．北京：人民卫生出版社，2001．232－241．SCHMIDT D J，CLARKSON C E，SWANSON T A．Monoclonal antibodies for immunoassay of avermectins [J]．J Agric Food Chem，1990，38：1763－1770．。
一种卵类黏蛋白兔多克隆抗体的制备方法及免疫分析方法[发明专利]
![一种卵类黏蛋白兔多克隆抗体的制备方法及免疫分析方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/fb9a42f5c281e53a5902ffb1.png)
专利名称：一种卵类黏蛋白兔多克隆抗体的制备方法及免疫分析方法
专利类型：发明专利
发明人：张燕,生威,王薇,刘冰,陆旸,王硕
申请号：CN201510266279.2
申请日：20150522
公开号：CN104945507A
公开日：
20150930
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了一种卵类黏蛋白兔多克隆抗体的制备方法及免疫分析方法，所述制备方法主要过程为卵类黏蛋白直接免疫新西兰大耳白兔，经过五次免疫后股动脉取全血，获得卵类黏蛋白抗体血清；通过优化抗体包被量，检测抗体的稀释倍数，封闭液以及样品缓冲溶液的pH值建立卵类黏蛋白间接竞争ELISA方法。
本发明制备的抗体效价较高，抑制率较好，建立的方法灵敏度和精密度较好。
申请人：天津科技大学
地址：300222 天津市河西区大沽南路1038号
国籍：CN
代理机构：天津滨海科纬知识产权代理有限公司
代理人：刘莹
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1种改良的高效单特异性兔多克隆抗体的制备方法
1种改良的高效单特异性兔多克隆抗体的制备方法钟丹;易维京;李淑慧;胡川闽【期刊名称】《国际检验医学杂志》【年(卷),期】2010(031)004【摘要】目的建立1种改良的高效单特异性兔多克隆抗体的制备方法.方法用RT-PCR方法获得bax保守N端1～123位氨基酸基因片段,并将其插入pET42a 原核表达载体,诱导表达的Bax融合蛋白组合应用GST、His亲和层析技术获得免疫原(pET42a/Bax融合蛋白),HPLC鉴定纯度达95%.利用改良快速免疫法获得人Bax兔多克隆抗体,并经蛋白A柱亲和层析技术,抗原亲和纯化技术获得高效价高特异性的抗体.间接ELISA检测抗体滴度、Western blot和免疫组化试验检测抗体特异性,并与商业化抗体进行对比.结果通过快速免疫法得到人Bax兔多克隆抗体,经过Protein A柱纯化,再经抗原亲和纯化后,间接ELISA证明,抗体效价均达1∶51 200;Western blot显示,只有经过抗原亲和纯化后的抗体特异性高,无其他杂带;免疫组化证明,在原发性肝癌组织中,人Bax兔多克隆抗体能特异地和内源性Bax结合,其高效高特异性已达国外Santa Cruse公司 Bax商业化抗体水平.结论快速免疫法与抗原亲和纯化相结合,获得人Bax高效单特异性兔多克隆抗体,建立了1种改良的高效单特异性兔多克隆抗体的制备方法.【总页数】3页(P315-316,319)【作者】钟丹;易维京;李淑慧;胡川闽【作者单位】第三军医大学,临床生化教研室,重庆,400038;第三军医大学,学员旅十队,重庆,400038;第三军医大学,临床生化教研室,重庆,400038;第三军医大学,临床生化教研室,重庆,400038;第三军医大学,临床生化教研室,重庆,400038【正文语种】中文【中图分类】R446.61【相关文献】1.构建兔抗人凝血因子XIII A亚单位多克隆抗体及特异性鉴定 [J], 陈晓甜;骆云雅;张广森2.兔抗鸡碱性氨基酸转运载体b0,+AT多克隆抗体的制备及其效价和特异性分析[J], 孙育平;甘鲁飞;夏伟光;冯定远;左建军3.优质高产高效兔新品种改良型大白兔 [J], 刘娜4.特异性单克隆与非特异性多克隆抗体荧光免疫偏振法测定肾移植病人全血环孢素浓度的比较及肝功能对血药浓度的影响<英文> [J], 王峰;张华峰;李颖;苏士平;孙斌5.高效液相色谱电化学检测法测定兔血浆单胺递质及其相关化合物 [J], 李广林;郎子文;董明显;杨国林;张国伟;李锦宇;牛建荣;蒲万霞;毛学锋;刘惠玲;何天稀;侯经国因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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兔多克隆抗体的制备
一、兔多克隆抗体
1.多克隆抗体的概念
抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。
一般而言，抗体按靶位点不同主要分为单克隆抗体和多克隆抗体，由多个B淋巴细胞克隆产生的，受到多种抗原决定簇刺激并可以与多种抗原表位结合的抗体就是多克隆抗体。
2.兔多克隆抗体的优点
1.制备体系成熟。
2.抗兔二抗产品丰富，商业化好，适合检测。
3.制备成本相对低廉。
3.为何选择兔子
4.一般流程
多抗一般制备流程：完全抗原的准备→兔子的免疫→效价检测和终放→抗体亲和纯化→抗体的浓缩和保存。
二、兔多克隆抗体制备流程
1.兔子的准备
挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只（约2Kg），使其适应新的生活环境，至少稳定几天再进行首次取血.
预采血（作阴性参照用）
1.1 将兔子小心的放入固定的架中,使兔子平静；
1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可见(也可不剃)；
1.3如果有必要,可用小棉球沾酒精涂抹血管部位,使血管膨胀；
1.4用注射器从耳静脉抽取约10ml血液(约5ml血清)；
1.5小心抽出针头,适当按压伤口以免流血,然后用酒精棉球消毒伤口；
1.6将收集的血液置于37`C灭活30min,最后置于4`C过夜使其凝结释放血清；
1.7将凝结好的血液在10000r／min离心10min；h.收集上清，即为血清。
2. 兔子的免疫
2.1 注射两只兔子的抗原为1ml,抗原缓冲溶液必须不含对兔子有害的化学试剂.每只兔子初次免疫400ug抗原比较适合,也可适当减少以获得更好的结果，后续免疫每次为100ug即可。
2.2 将1ml的佛氏完全佐剂与准备好的1ml抗原充分混匀,呈乳白色；
2.3 小心从笼中取出兔子，每只兔子免疫4个部位(背部和大腿根部均可),每个部位250ul,针头呈45度角插入皮下1-2cm,注射完后停留数秒以防止抗原外流。
2.4 免疫周期为20天,免疫完后7-10天取血(包括中途测试取血和最终放血),总共免疫4-5次。
3.效价检测
3.1 2个参照:阴性参照为预取血血清，均以1抗起始浓度稀释(封闭稀释液);阳性参照为以前阳性血清
3.2 于96孔板中每孔滴加100ul，1ug/ml抗原，于4℃过夜，也可以37℃孵育2小时。
3.3倒掉抗原溶液，每孔加入200ul的封闭液，4℃过夜或者37℃孵育2小时。
3.4倒去封闭液，在吸水纸上拍打尽量吸干残留液体,用洗涤液洗板三次,每次尽量拍干残留液体,若要放置一段时间, 37℃烘干并用封口袋封好于-20℃存放。
3.5取包被好的96孔板，第一孔加入阴性参照液100ul，第二孔加入阳性参照液100ul，第三孔加入1:500的待测抗血清，后续各孔在此基础上倍比稀释，于37℃孵育1 小时。
3.6倒掉液体，用洗涤液洗板三次，拍干。
每孔加入100ul的HRP标记的小鼠抗兔IgG（1：2000稀释），于37℃孵育45分钟。
3.7倒掉液体，用洗涤液洗板三次，拍干。
每孔加入100ul的TMB底物（Sigma 单组份TMB ）37℃孵育5—20分钟(根据颜色深浅来决定显色的时间)。
3.8每孔加入50ul的终止液（2N H2SO4），在酶标仪上读取波长450nm处的吸光值。
抗体效价检测达到10万以上后可以对兔子进行终放血。
抗体的纯化
4.抗体的亲和---亲和柱的制备
4.1 称取1mg CNBr-Sepherose 4B的琼脂糖凝胶加入2mmol／L的盐酸中，4`C过夜使其充分溶涨，可获得3ml溶涨胶。
4.2 将凝胶转移入纯化柱中，用约20ml 2mmol／L的盐酸洗介质3次。
4.3 用偶联缓冲液洗介质一次，因为活化基团在偶联缓冲液PH值下易水解，所以此步骤最好在几分钟内完成。
4.4 将溶解在5ml偶联缓冲液中的5-10mg的抗原加入凝胶中
4.5 室温下轻轻混合摇动2-4小时，或4`C过夜，如需测定结合效率此步骤结束后取少量溶液待测。
用20ml的偶联缓冲液洗介质一次。
4.6 加入15m l 1% BSA 溶液室温下孵育2小时或4`C过夜。
4.7 用磷酸盐缓冲液洗涤介质3次以上，每次15ml以上h.
4.8抗原固相化完成，可用于纯化。
4.9 若不立即使用或者使用后，用20%的乙醇封存。
5.抗血清的纯化和保存
5.1抗血清用PBS等体积稀释，5000-10000r／min离心15分钟，取上清.
5.2用10倍体积的PBS清洗抗原亲和柱以平衡柱子。
5.3将稀释好的抗血清10ml加入平衡好的柱子中。
5.4室温下轻轻混合摇动2-4小时，或4`C过夜
5.5用10倍体积的PBS清洗抗原柱，以洗去结合在柱子上的杂蛋白
5.6用2倍体积的抗体洗脱液洗涤柱子，以得到特异性抗体
5.7用10倍体积PBS平衡柱子
5.8用20%的酒精封存柱子，4`C保存。
在得到洗脱的抗体后，经蔗糖或聚乙二醇浓缩后于PBS中透析除盐，使用紫外可见分光光度计在波长280nm处测定抗体OD值，所得OD值除以1.35即为所测抗体的浓度，添加40-50%甘油置于-20`C可长期保存。