兔多克隆抗体的制备(2020)

兔多克隆抗体的制备

一、兔多克隆抗体

1.多克隆抗体的概念

抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。一般而言，抗体按靶位点不同主要分为单克隆抗体和多克隆抗体，由多个B淋巴细胞克隆产生的，受到多种抗原决定簇刺激并可以与多种抗原表位结合的抗体就是多克隆抗体。

2.兔多克隆抗体的优点

1.制备体系成熟。

2.抗兔二抗产品丰富，商业化好，适合检测。

3.制备成本相对低廉。

3.为何选择兔子

4.一般流程

多抗一般制备流程：完全抗原的准备→兔子的免疫→效价检测和终放→抗体亲和纯化→抗体的浓缩和保存。

二、兔多克隆抗体制备流程

1.兔子的准备

挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只（约2Kg），使其适应新的生活环境，至少稳定几天再进行首次取血.

预采血（作阴性参照用）

1.1 将兔子小心的放入固定的架中,使兔子平静；

1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可见(也可不剃)；

1.3如果有必要,可用小棉球沾酒精涂抹血管部位,使血管膨胀；

1.4用注射器从耳静脉抽取约10ml血液(约5ml血清)；

1.5小心抽出针头,适当按压伤口以免流血,然后用酒精棉球消毒伤口；

1.6将收集的血液置于37`C灭活30min,最后置于4`C过夜使其凝结释放血清；

1.7将凝结好的血液在10000r／min离心10min；h.收集上清，即为血清。

2. 兔子的免疫

2.1 注射两只兔子的抗原为1ml,抗原缓冲溶液必须不含对兔子有害的化学试剂.每只兔子初次免疫400ug抗原比较适合,也可适当减少以获得更好的结果，后续免疫每次为100ug即可。

2.2 将1ml的佛氏完全佐剂与准备好的1ml抗原充分混匀,呈乳白色；

2.3 小心从笼中取出兔子，每只兔子免疫4个部位(背部和大腿根部均可),每个部位250ul,针头呈45度角插入皮下1-2cm,注射完后停留数秒以防止抗原外流。

2.4 免疫周期为20天,免疫完后7-10天取血(包括中途测试取血和最终放血),总共免疫4-5次。

3.效价检测

3.1 2个参照:阴性参照为预取血血清，均以1抗起始浓度稀释(封闭稀释液);阳性参照为以前阳性血清

3.2 于96孔板中每孔滴加100ul，1ug/ml抗原，于4℃过夜，也可以37℃孵育2小时。3.3倒掉抗原溶液，每孔加入200ul的封闭液，4℃过夜或者37℃孵育2小时。

3.4倒去封闭液，在吸水纸上拍打尽量吸干残留液体,用洗涤液洗板三次,每次尽量拍干残留液体,若要放置一段时间, 37℃烘干并用封口袋封好于-20℃存放。

3.5取包被好的96孔板，第一孔加入阴性参照液100ul，第二孔加入阳性参照液100ul，第三孔加入1:500的待测抗血清，后续各孔在此基础上倍比稀释，于37℃孵育1 小时。

3.6倒掉液体，用洗涤液洗板三次，拍干。每孔加入100ul的HRP标记的小鼠抗兔IgG（1：2000稀释），于37℃孵育45分钟。

3.7倒掉液体，用洗涤液洗板三次，拍干。每孔加入100ul的TMB底物（Sigma 单组份TMB ）37℃孵育5—20分钟(根据颜色深浅来决定显色的时间)。

3.8每孔加入50ul的终止液（2N H2SO4），在酶标仪上读取波长450nm处的吸光值。

抗体效价检测达到10万以上后可以对兔子进行终放血。抗体的纯化

4.抗体的亲和---亲和柱的制备

4.1 称取1mg CNBr-Sepherose 4B的琼脂糖凝胶加入2mmol／L的盐酸中，4`C过夜使其充分溶涨，可获得3ml溶涨胶。

4.2 将凝胶转移入纯化柱中，用约20ml 2mmol／L的盐酸洗介质3次。

4.3 用偶联缓冲液洗介质一次，因为活化基团在偶联缓冲液PH值下易水解，所以此步骤最好在几分钟内完成。

4.4 将溶解在5ml偶联缓冲液中的5-10mg的抗原加入凝胶中

4.5 室温下轻轻混合摇动2-4小时，或4`C过夜，如需测定结合效率此步骤结束后取少量溶液待测。用20ml的偶联缓冲液洗介质一次。

4.6 加入15m l 1% BSA 溶液室温下孵育2小时或4`C过夜。

4.7 用磷酸盐缓冲液洗涤介质3次以上，每次15ml以上h.

4.8抗原固相化完成，可用于纯化。

4.9 若不立即使用或者使用后，用20%的乙醇封存。

5.抗血清的纯化和保存

5.1抗血清用PBS等体积稀释，5000-10000r／min离心15分钟，取上清.

5.2用10倍体积的PBS清洗抗原亲和柱以平衡柱子。

5.3将稀释好的抗血清10ml加入平衡好的柱子中。

5.4室温下轻轻混合摇动2-4小时，或4`C过夜

5.5用10倍体积的PBS清洗抗原柱，以洗去结合在柱子上的杂蛋白

5.6用2倍体积的抗体洗脱液洗涤柱子，以得到特异性抗体

5.7用10倍体积PBS平衡柱子

5.8用20%的酒精封存柱子，4`C保存。

在得到洗脱的抗体后，经蔗糖或聚乙二醇浓缩后于PBS中透析除盐，使用紫外可见分光光度计在波长280nm处测定抗体OD值，所得OD值除以1.35即为所测抗体的浓度，添加40-50%甘油置于-20`C可长期保存。