多克隆抗体的原理及制作方法

多克隆抗体的原理及制作方法

一、原理

多克隆抗体是由针对多种不同抗原表位的抗体组成的混合物。外源性抗原初次进入动物体内后，可引发机体初次免疫应答，即在抗原呈递细胞（antigenpresenting cell，APC）和T细胞的作用下，未

成熟B细胞被激活分化为产生抗体的浆细胞，对于大多数可溶性蛋白抗原而言，动物注射后5～7天，血清中开始出现抗体，并在12天左右达到顶峰，然后逐渐下降。初次免疫应答产生的抗体持续时间较短，亲和力也较低。但是受抗原刺激的B细胞除了分化为抗体产生细胞外，还增殖形成大量记忆性B细胞，它们在实施加强免疫时被快速激活，加强免疫后抗体滴度迅速上升，并持续更长时间，抗体合成率也比初次反应增加几倍到几十倍，加强免疫后7～14天出现抗体的峰值。由于记忆B细胞的存在，需要更少的抗原刺激即可引起再次免疫应答。记忆B细胞是长寿细胞，因此，特异性抗体应答在最后一次加强免疫之后6个月到一年都会存在。本节介绍用佐剂乳化的抗原免疫动物获得多克隆抗血清的方法。该法可用于免疫家兔，小鼠、大鼠或地鼠，也可用于更大的动物如绵羊、山羊或马。

二、材料

（一）动物选择

根据需要可选择适当品系的家兔，小鼠，大鼠或地鼠等动物进行免疫获得抗体。动物的选择取决于所需的抗血清量以及特异性抗原的

物种来源和免疫动物物种之间进化上的差异。家兔常被选作免疫动物，因为兔与人、兔与小鼠之间的遗传学差异大，而人和小鼠来源的蛋白是最经常被研究的对象。每次获取25ml血清的采血量，对兔本身没

有明显的损伤。

（二）抗原

制备优质抗血清很大程度上取决于抗原的质量、纯度和数量。常用纯化的抗原或部分纯化的抗原免疫动物，所用抗原往往是蛋白质或肽。一般而言，细菌或病毒蛋白如血凝素或细菌包膜蛋白有很强的免疫原性，而哺乳动物蛋白如多肽类激素或细胞膜受体则免疫原性较弱。有时也会用到与适当的蛋白质载体、细胞或细胞与组织提取物相交联的半抗原（多糖、核酸、脂类和小分子化学物质等）以增强半抗原的免疫原性，通过化学方法将半抗原连接到已知的免疫原性强的载体蛋白上，常用的载体蛋白有匙孔戚血蓝素（KLH）、牛血清白蛋白（BSA）、鸡卵清蛋白（OVA）等。对于蛋白质抗原，可以是天然蛋白或变性构

象的蛋白，这主要决定于抗体的用途。比如用于筛选细菌cDNA表达

文库或免疫印迹的抗体，最好用变性蛋白制备抗血清；而筛选真核生物转染系统表达的cDNA产物、或对天然细胞合成的蛋白进行免疫印

迹检测时，最好用天然蛋白质制备的抗血清。需要注意的是，少量的非目标污染物往往比目标免疫原的抗原性更强，所得抗血清对非目标蛋白的活性比对目标蛋白的结合能力更强。

（三）佐剂

佐剂是能非特异性增强抗原免疫原性，也可改变免疫应答类型的物质。它通过改变抗原物理性状，延长抗原在体内存留时间，增强APC对抗原的呈递和处理能力，刺激淋巴细胞增殖从而扩大免疫应答反应。目前常用的佐剂有以下几种：①福氏佐剂（Freund adjuvant，FA），是一种最常用的油包水（water-in-oil）佐剂。根据加或不加灭活分枝杆菌而分为完全福氏佐剂（complete Freunds adjuvant，CFA）和不完全福氏佐剂（incomplete Freunds adjuvant，IFA）。CFA 含有羊毛脂、矿物质油和灭活分枝杆菌，不但能增强免疫原性，也能改变免疫应答的类型；IFA中仅含羊毛脂和矿物质油，可增强抗原免疫原性。值得注意的是，CFA是极强的炎性物质，尤其是注射到皮内或眼睛可能引起严重皮肤腐烂或视力丧失。因此处理CFA时需使用手套和保护性眼罩。②生物来源的佐剂如卡介苗、短小棒状杆菌、百日咳杆菌、细菌内毒素、大肠埃希菌脂多糖、植物血凝素等。③无机化合物佐剂如氢氧化铝、钾明矾等。④人工合成佐剂如多聚肌苷酸-多聚胞苷酸［poly（IC）］、多聚腺苷酸-多聚尿苷酸［poly（A-U）］、脂质体和CpG寡核苷酸佐剂等。免疫佐剂常与抗原同时注入动物体内。选择安全有效的佐剂用于动物免疫是备受关注的问题。福氏佐剂因其免疫效果可靠能获得较高的抗体滴度而广泛地使用了50余年。然而，由于这种佐剂的使用常给动物带来一定程度的痛苦和不适，研究者在积极寻找相应替代品。本节主要介绍福氏佐剂免疫法（CFA/IFA免疫法）。

三、免疫步骤（CFA/IFA免疫法）

1.佐剂的制备福氏完全佐剂和不完全佐剂可以选择市售品，也可以自制。自制福氏佐剂时，将液状石蜡与羊毛脂按5∶3比例混合（也有研究者使用的比例为3∶5，佐剂中羊毛脂含量高，与抗原混合后研磨时，较易达到油包水状态），煮沸或高压灭菌，趁热混匀，即成不完全佐剂。在油相中加入卡介苗，使其终浓度为0.25mg/ml，即为福氏完全佐剂。自制佐剂在室温保存过程中，福氏佐剂会变得浓稠，卡介苗常沉淀于容器底部，使用前需要水浴加热，充分混匀。

2.免疫前动物采血，分离血清作为对照。

3.免疫抗原的准备充分混匀CFA。用PBS（不要使用含Tris的缓冲液）溶解蛋白抗原至0.25～0.5mg/ml，加2ml CFA至2ml蛋白抗原中，制备的免疫原足够免疫4只家兔和80只小鼠。

4.用3ml玻璃注射器（19-G针头）吸取CFA/抗原混合物。移去针头，尽可能排除空气，将注射器连上接合器或三通旋塞，在另一头连上一个空的3ml玻璃注射器。推动注射器栓，使混合物从一个注射器进入另一个注射器，如此反复来回推动。直到混合物颜色变白成为“油包水”状的乳化悬液。去掉接合器或旋塞，接上21-G针头，将一小滴乳液滴在50ml冷水的表面，检测乳状物是否稳定。乳化好的油包水乳状液应该在水面上结合很紧，形成乳滴；如果乳滴很快分散，则需重复上述操作来混匀抗原以形成乳状物。另一种做法：将抗原与佐剂混合物置于乳钵中研磨，使其成为油包水状态。我们的经验是在冰浴中研磨，或将其保持在低温状态，易于得到抗原/佐剂油包水乳

液免疫抗原的准备。

5.将全部抗原佐剂乳液移到一个注射器中，接上22-G针头到注射器并去除气泡。

6.固定动物将佐剂/抗原乳液注射到动物体内。常用的免疫途径有：皮内、皮下、肌肉、淋巴结、腹腔、足垫等。初次免疫一般选择吸收缓慢的途径，以延长抗原刺激时间。免疫家兔时，多选择背部多点皮下注射（10～20个点），免疫小鼠多用腹腔注射。

7.初次免疫10～14天后抽取少量静脉血，分离血清。

8.按以上步骤2～4准备抗原进行加强免疫，加强免疫用IFA为佐剂。

9.初次免疫2～8周后开始加强免疫，7～14天后抽取血样，分离血清。

10.加强免疫间隔时间为1～2周，连续加强数次。初次免疫前后、每次加强免疫后，均需采集动物血样并分离血清检测抗体滴度。

四、分离血清

免疫完成后即可给动物放血，放血前动物应禁食24小时。采血方法参见第四十三章“免疫细胞分离纯化技术”。

1.将血样装在离心管或平皿中于室温放置4小时或4℃过夜，直到形成血凝块。

2.用一根木棒从离心管或平皿侧面轻轻拨动血凝块，然后用木棒