多克隆抗体制备及效价评定
多克隆抗体制备
多克隆抗体制备多抗一般制备流程：完全抗原的准备→兔子的免疫→效价检测和终放→抗体亲和纯化→抗体的浓缩和保存。
【晶莱生物】具体实验步骤如下：1.兔子的准备挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只（约2Kg），使其适应新的生活环境，至少稳定几天再进行首次取血.预采血（作阴性参照用）1.1 将兔子小心的放入固定的架中,使兔子平静；1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可见(也可不剃)；1.3如果有必要,可用小棉球沾酒精涂抹血管部位,使血管膨胀；1.4用注射器从耳静脉抽取约10ml血液(约5ml血清)；1.5小心抽出针头,适当按压伤口以免流血,然后用酒精棉球消毒伤口；1.6将收集的血液置于37`C灭活30min,最后置于4`C过夜使其凝结释放血清；1.7将凝结好的血液在10000r／min离心10min； h.收集上清，即为血清。
2. 兔子的免疫2.1注射两只兔子的抗原为1ml,抗原缓冲溶液必须不含对兔子有害的化学试剂.每只兔子初次免疫400ug抗原比较适合,也可适当减少以获得更好的结果，后续免疫每次为100ug即可。
2.2 将1ml的佛氏完全佐剂与准备好的1ml抗原充分混匀,呈乳白色；2.3 小心从笼中取出兔子，每只兔子免疫4个部位(背部和大腿根部均可),每个部位250ul,针头呈45度角插入皮下1-2cm,注射完后停留数秒以防止抗原外流。
2.4 免疫周期为20天,免疫完后7-10天取血(包括中途测试取血和最终放血),总共免疫4-5次。
3.效价检测3.1 2个参照:阴性参照为预取血血清，均以1抗起始浓度稀释(封闭稀释液);阳性参照为以前阳性血清3.2 于96孔板中每孔滴加100ul，1ug/ml抗原，于4℃过夜，也可以37℃孵育2小时。
3.3倒掉抗原溶液，每孔加入200ul的封闭液，4℃过夜或者37℃孵育2小时。
3.4倒去封闭液，在吸水纸上拍打尽量吸干残留液体,用洗涤液洗板三次,每次尽量拍干残留液体,若要放置一段时间, 37℃烘干并用封口袋封好于-20℃存放。
多克隆抗体
二、概述Байду номын сангаас二、概述
• 抗原上那部分可以引起机体产生抗体的分子结构 ，叫做抗原决定簇。一个抗原上可以有好几个不 同的抗原决定簇，因而使机体产生好几种不同的 抗体，最终产生出抗体是浆细胞。只针对一个抗 原决定簇起作用的浆细胞群就是一个纯系，纯系 的英文为Clone，音译就是克隆。由一种克隆产生 的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗体能目 标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就象导 弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一 个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来 产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为 多克隆抗体。 • 多克隆抗体又简称多抗。与之相对应的叫单克隆 抗体，简称单抗。
（一）抗原制备 • Ig 是免疫球蛋白，对异种动物而言，是良 好的抗原物质。可以刺激异种动物产生抗 Ig 血清， • 经适当提取后，产生抗 Ig 抗体，又叫第二 抗体或抗抗体。在多数的间接标记反应中， 均需制备 • 抗 Ig 抗体。
（二）材料与试剂
1．提取的动物 Ig 2．弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂 3．青霉素和链霉素 4．实验动物 兔 5．其它材料及试剂
（2）皮下多点注射法：
A、家兔两侧掌（跖内各注射含有完全佐剂抗 原 0.10ml（IgG 含量5mg/ml） ； B、7～10 天后，脊柱两侧多点（颈、胸、腰 椎各两点、共 6 点）皮下注射含不完全佐 剂5的抗原，每点 0.50ml； C、7～10 天后，脊柱两侧重复注射一次； D、7～10 天后试血。不合格者重复步骤D。
（二）抗体的特异性鉴定 抗体的特异性是指与相应抗原或近似抗原物质 的识别能力。抗体的特异性高，它的识别能力就 强。衡量特异性通常以交叉反应率来表示。交叉 反应率可用竞争抑制试验测定。以不同浓度抗原 和近似抗原分别做竞争抑制曲线，计算各自的结 合率，求出各自在 IC50时的浓度，并按下列公式 计算交叉反应率。 如果所用抗原浓度IC50浓度为 pg/管，而一些近似抗原物质的IC50浓度几乎是无 穷大时，表示 这一抗血清与其他抗原物质的交叉 反应率近似为 0，即该血清的特异性较好。
多克隆抗体的制备,纯化及检测
利用蛋白质免疫印迹法或免疫电泳方法检查抗体产生情况。
二、亲和层析法纯化抗体
【实验原理】
如图所示，亲和层析的高度选择性使得从某一初始材料中纯化，富集某一含量较低的 目的蛋白成为可能，因此亲和层析是蛋白质分离纯化过程中最有效的方法之一。另外，如 果配基与蛋白质的亲和能力很强，也可同时进行样品的浓缩。
适合产生抗体，因此在注射前通常采用一些经典的方法，比如柱层析、分级萃取、亚细胞
分离等进行抗原的分离和纯化。如果多肽抗原在 SDS/PAGE 中为可见的单一带，抗原从凝
胶中的抽提可作为纯化的最后一个步骤。
⒉ 预放血
轻轻的将兔子放在特制兔盒中，处于放松状态的兔子采血会较容易。按压兔子耳根部
直至血管突出,然后将针头插入耳部血管的中上部，观察到进针后小心推出活塞收集血液
前出现凝固可用温水轻擦切口处，再继续收集。收集适量血液后可用消毒后的纱布轻擦患
处，轻按患处 10 秒-20 秒确定血流停止后方可结束。 ⑵ 将血液在 37°C 恒温箱中放置 30 分钟，再在 4°C 放置过夜。用药铲将血凝块从管
壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4°C，10,000g 离心 10 分钟，收集上清液即为抗 血清，可在-20°C 保存数年。
实验九 多克隆抗体的制备，纯化及免疫电泳
【实验目的】
⒈ 加深对抗体基本知识的了解。 ⒉ 了解多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。 ⒊ 了解免疫电泳的基本过程和实验依据。
一、多克隆抗体的制备 【实验原理】
当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受 抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗 体。多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗 原决定簇相结合。
多克隆抗体的制备,纯化及检测
实验九 多克隆抗体的制备，纯化及免疫电泳【实验目的】⒈ 加深对抗体基本知识的了解。
⒉ 了解多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。
⒊ 了解免疫电泳的基本过程和实验依据。
一、多克隆抗体的制备【实验原理】当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。
多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。
将抗原导入敏感动物体内后，可刺激网状内皮细胞系统，尤其是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。
如图所示，实验动物对初次免疫和二次免疫的应答有明显的不同。
通常初次免疫应答往往比较弱，尤其是针对于易代谢，可溶性的抗原。
首次注射后大约7天，在血清中可以观察到抗体但抗体的浓度维持在一个较低的水平，在大约10天左右抗体的滴度会达到最大值。
但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同，和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。
免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和二次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。
三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似：抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变，这种改变被称为免疫应答的成熟，具有重要的实际意义。
通常在抗原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。
【实验材料】⒈ 实验动物初次抗原注射后的周次0 1 2 3 4 5 6 7初次免疫 二次免疫血清中抗体的水平成年兔。
⒉实验器材特制兔盒；刀片；25G针头；1ml注射器；20 ml 血液收集管；药铲；离心机以及塑料离心管；加样器及加样管；烧杯。
⒊实验试剂⑴抗原；乙醇；20mM 磷酸缓冲溶液pH7.2。
⑵福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂：【实验方法】⒈抗原的制备抗原制备的主要目的在于在免疫动物体内产生最强、最适当的抗体。
由于纯化的抗原适合产生抗体，因此在注射前通常采用一些经典的方法，比如柱层析、分级萃取、亚细胞分离等进行抗原的分离和纯化。
SOP——多克隆抗体的制备
多克隆抗体的制备1.蛋白纯化：重组蛋白表达形式为包涵体时，可通过切胶进行蛋白纯化。
表达重组蛋白的细菌（200ml菌液为例）4500r/min离心20min，菌体沉淀用15ml PBS 悬起，4500r/min离心15min，共清洗3次。
沉淀用4ml PBS悬起，通过超声处理进行裂解。
超声条件为超声时间3s，间隔3s，全程时间为30min，4℃（置于冰水混合物中），功率为400W。
超声后10000r/min离心5min，沉淀用500µl PBS悬起，后加入400µl 2×SDS凝胶加样缓冲液、100µl DTT混合，立即加入沸水中煮10min。
将500µl 处理后样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（每块凝胶加入500µl 样品）。
凝胶用H2O、PBS清洗后，将凝胶放入预冷的0.25M KCl中显色（或低温显色）30s左右，可见不同位置出现白色的蛋白条带。
将目的蛋白位置的凝胶条切下（尽量避免同时切下其他蛋白条带），PBS（预冷）清洗后，将胶条碾碎放入EP管中（大约占1/2），加入PBS 浸没胶粒（PBS加入量控制在可使胶粒完全溶于其中，上下颠倒可缓慢流动）。
反复冻融3次，10000r/min离心3min，吸取的上清即为纯化后蛋白（可多次离心后小心吸取上清，避免吸到胶粒）。
取纯化后蛋白进行SDS-PAGE电泳，鉴定蛋白的纯化度并测定其浓度。
纯化蛋白置于4℃短暂保存。
2.蛋白复性将纯化蛋白置于已处理的透析袋中（透析袋于2% NaHCO3中煮沸10min，H2O冲洗后于1mM EDTA中煮沸10min，可于4℃1mM EDTA保存），放入复性液（配方：20mM Tris-HCl pH 8.0；0.1mM氧化型谷胱甘肽；0.9mM还原型谷胱甘肽）中，4℃作用1h。
更换复性液，4℃作用2h。
再放入TE缓冲液（配方：10mM Tris-HCl；1mM EDTA pH8.0）中，4℃作用2h或过夜。
诺如病毒衣壳蛋白多克隆抗体的制备及效价分析
诺如病毒衣壳蛋白多克隆抗体的制备及效价分析武娟1，赵玉然2，唐庆娟1,*，王静凤1，王玉明1，李兆杰1，薛勇1，薛长湖1（1.中国海洋大学食品科学与工程学院，食品科学与人类健康实验室，山东青岛266003；2.山东省出入境检验检疫局食品与农产品检测机构，山东青岛266003）摘要：将大肠杆菌表达的GII-4型诺如病毒（Norovirus，NV）衣壳蛋白免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体；收集抗血清，酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测其效价，并对经聚合酶链式反应法（polymerase chain reaction，PCR）验证为阳性的NV感染样品进行检测，比较两种检测方法的差异性。
以原核表达的诺如病毒衣壳蛋白作为抗原制备的NV特异性多克隆抗体具有良好的免疫反应性，抗体效价为1∶10 000，可以用于免疫学检测。
关键词：诺如病毒；衣壳蛋白；原核表达；抗血清Preparation and Titer Analysis of Polyclonal Antibody against Norovirus Capsid ProteinWU Juan1, ZHAO Yu-ran2, TANG Qing-juan1,*, WANG Jing-feng1, WANG Yu-ming1, LI Zhao-jie1, XUE Yong1, XUE Chang-hu1(1. Laboratory of Food Science and Human Health, College of Food Science and Engineering, Ocean University of China,Qingdao 266003, China; 2. Food and Agricultural Products Testing Agency (FATA), Shandong Entry-Exit Inspection andQuarantine Bureau, Qingdao 266003, China)Abstract: New Zealand rabbits were immunized with the recombinant norovirus (NV) capsid protein expressed in E. coli to prepare polyclonal antibody. The antiserum was collected and evaluated by ELISA method, and a comparative evaluation with PCR was carried out by using both methods to detect NV-positive samples identified by PCR. The antiserum had a good immunoreactivity at a dilution of 1:10 000, suggesting its availability for immunological experiments. Compared with PCR, the ELISA method was more simple and rapid. Although the sensitivity of ELISA was worse than that of PCR, this problem was able to be meliorated by purified virus. This study establishes the basis for a rapid and economical norovirus enzyme-linked immunosorbent assay kit.Key words: norovirus; capsid protein; prokaryotic expression system; polyclonal antibody中图分类号：TS254.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）11-0105-04 doi:10.7506/spkx1002-6630-201411021诺如病毒（Norovirus，NV）是目前最为常见的食源性病毒之一，是一种单链RNA病毒。
多克隆抗体制备综合性实验 - 副本
多克隆抗体制备综合性实验实验原理：抗体是在抗原刺激机体免疫系统后，活化的B淋巴细胞针对抗原决定簇产生抗体，由一个B细胞细胞克隆针对某一抗原决定簇产生的抗体称为单克隆抗体（monoclonal antibody, McAb）。
若由多抗原决定簇刺激机体，相应活化多个B细胞克隆，产生多种McAb的混合物，称之为多克隆抗体（polyclonal antibody, PcAb）。
抗体的制备包括抗原的制备和纯化、动物免疫和血清分离纯化与鉴定。
许多免疫学诊断都以抗原抗体反应为基础。
实验操作：1.抗原的制备（第一周）用抗原刺激机体可使机体产生抗体，抗原的性质、纯度和活性影响其免疫动物后获得抗体的特异性和效价。
为了提高抗原的免疫原性以获得高水平的抗体，一般需在可溶性抗原中加入佐剂。
本实验抗原为混合人全血清（20份血清混合）。
以下步骤需无菌操作（1）混合20份人全血清。
（2）取混合人全血清，用生理盐水1:4稀释。
（3）将稀释血清按与完全佐剂1:1体积的比例混匀，制成油包水状态。
将佐剂5 ml置磁力搅拌器上，边搅拌边滴加抗原，继续搅拌使其完全乳化。
将抗原液与佐剂等比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡使抗原充分乳化。
乳化过程比较费时、费力，但若乳化不充分，会影响免疫的效果。
完全乳化标准：(1) 取1滴至冰水表面，若乳剂稳定，在冰水表面不会扩散。
(2) 振荡后，1000rpm离心一分钟，如水相和油相不分层即可注射。
2.基础免疫(1) 固定家兔(2) 剪去家兔颈背部、大腿、足底的毛，碘酒和酒精棉球消毒。
(3) 免疫方法可采用背部多点注射法。
即于家兔脊柱两旁、大腿、足掌选4-6点皮下注射，每点注0.1ml，每只家兔共注射1ml。
间隔2周后再于上述部位选不同点注射（不要选择临近位点，否则溃疡愈合不好）。
抚去注射处的兔毛并用乙醇消毒暴露的皮肤。
捏出皮肤，将针头以相对皮肤15度的角度进针，进针深度为1cm-2cm，小心不要刺入肌肉中。
多克隆抗体制备及效价评定ppt课件
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
（二）可溶性抗原制备： 指蛋白质、多糖和脂类等。
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1）细胞的破碎（物理法、化学法）
• 反复冻融法 • 超声破碎法 • 自溶法 • 酶处里法 • 表面活性剂处理法
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• 2）提取与纯化： ①超速离心分离—是一种根据分离物质的
比重特点，通过差速或梯度密度离心， 将分子大小不同的抗原颗粒分开的方法， 只适宜少数大分子物质的分离。
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目的要求
• 掌握多克隆抗体制备的基本原理。 • 掌握多克隆抗体制备的操作步骤。 • 掌握肥达反应的实验原理、操作流程和结果判
断。
• 熟悉ELISA的实验原理、操作流程和结果判断。 • 了解细菌抗原和病毒抗原免疫程序上的异同。 • 了解免疫动物的选择原则。
实验一多克隆抗体的制备（可溶性抗原）
实验一多克隆抗体的制备（可溶性抗原）上海师范大学实验报告专业、年级生物科学班级姓名学号课程名称免疫学实验名称多克隆抗体的制备（可溶性抗原）实验日期基本原理免疫动物是通过给待免疫的动物注射抗原，使其获得相应的抗体的过程。
抗原给予的方法不仅对免疫应答的起始有较大影响，而且决定着对新注射抗原的免疫吞噬和吞噬后加工处理的细胞类型，并影响对其发生免疫应答的外周淋巴器官。
材料(一)动物：健康雄性家兔2只(二)器材：剪刀、镊子、注射器(2ml、50ml)附针头(9号、6号)、称量瓶(10ml)、量筒、动物固定架、灭菌三角烧瓶(200ml)、手术器械一套、血管夹、黑丝线、塑料放血管等。
(三)试剂1.灭菌生理盐水；2.纯化人IgG(10mg／ml)；3.消毒酒精及碘酒；4.弗氏不完全佐剂（FCA）5.弗氏完全佐剂（FIA）6.弗氏完全佐剂乳化抗原(FCA-IgG)的制备：吸2ml FCA于研钵中，逐滴加入1mg／ml 纯化人IgG 1 ml，边滴入边研磨直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上不散开为合格。
7. 弗氏不完全佐剂乳化抗原(FIA-IgG)的制备：吸2ml FIA于研钵中，逐滴加入1mg／ml纯化人IgG 1 ml，边滴入边研磨直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上不散开为合格。
免疫方法1.用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分毛，以酒精及碘酒消毒皮肤；2.第一次免疫: 用2ml注射器吸取弗氏完全佐剂(FCA)乳化的抗原(人IgG)下称FCA-IgG)液1ml，每侧脚掌皮下各注入0.5ml。
3.第二次免疫：间隔14天后，于两侧腘窝及鼠蹊部肿大的淋巴结内注入FIA-IgG，每个淋巴结注0.1ml，其余注入淋巴结附近皮下共1ml。
如淋巴结未肿大或肿大不明显时，直接注入两侧腘窝及鼠蹊部皮下。
4.间隔10天后，从耳静脉采血0.5～1.0ml，分离血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价(即试血)。
效价至少应达到1∶16以上时才能放血。
多克隆抗体实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习多克隆抗体的制备方法；2. 掌握多克隆抗体的纯化、鉴定及效价检测技术；3. 熟悉多克隆抗体的应用。
二、实验原理多克隆抗体是由多个B细胞克隆产生的抗体，具有特异性强、亲和力高、产量高等特点。
多克隆抗体制备过程主要包括抗原免疫、抗体提取、纯化、鉴定及效价检测等步骤。
三、实验材料1. 实验动物：小鼠（6周龄）；2. 抗原：目的蛋白；3. 试剂：免疫球蛋白G（IgG）亲和层析柱、蛋白纯化试剂盒、SDS-PAGE凝胶、Western Blot试剂盒、酶标仪、凝胶成像系统等；4. 仪器：离心机、PCR仪、电泳仪、Western Blot仪、酶标仪等。
四、实验方法1. 抗原免疫（1）取抗原溶液，加入等体积的福氏完全佐剂，混匀；（2）将混合液注射入小鼠腹腔，免疫剂量根据抗原量和小鼠体重确定；（3）免疫后第2周，重复注射抗原和福氏不完全佐剂，加强免疫；（4）免疫后第3周，采集小鼠血清，进行抗体效价检测。
2. 抗体提取（1）将小鼠血清与蛋白提取缓冲液（pH 7.4）按1:4比例混合；（2）4℃条件下，以15000 rpm离心30分钟，收集上清液；（3）上清液经0.22μm滤膜过滤，得到抗体溶液。
3. 抗体纯化（1）将抗体溶液加入IgG亲和层析柱；（2）用蛋白纯化试剂盒进行梯度洗脱，收集抗体峰；（3）将抗体峰浓缩至适当体积，得到纯化抗体。
4. 抗体鉴定（1）SDS-PAGE电泳：将纯化抗体样品与标准蛋白进行SDS-PAGE电泳，比较分子量；（2）Western Blot：将纯化抗体样品与目的蛋白进行Western Blot检测，观察抗体特异性。
5. 抗体效价检测（1）将抗原溶液与纯化抗体溶液按一定比例混合；（2）加入底物溶液，酶标仪检测吸光度值；（3）根据吸光度值，计算抗体效价。
五、实验结果1. 抗原免疫：小鼠在免疫后第3周，血清抗体效价达到最高值。
2. 抗体提取：纯化抗体溶液经SDS-PAGE电泳，分子量与目的蛋白一致。
多克隆抗体的制备方法1
抗体的制备方法与原理一、抗血清的制备有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。
（一）用于免疫的动物作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。
动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。
若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。
（二）免疫途径免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。
途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。
（三）佐剂由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。
佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。
常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg卡介苗就成为完全佐剂。
配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。
免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。
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弗氏佐剂（Freund’s adjuvant）,分为 弗氏不完全佐剂和完全佐剂两种： • 前者是由油剂（矿物油或花生油）和乳化 剂（羊毛脂或吐温-80）按1：1～1：5比例 混合而成； • 后者由弗氏不完全佐剂加卡介苗组成。在 免疫动物时，先将弗氏佐剂与抗原等比混 匀，制成“油包水”乳化液。
（四）免疫佐剂
• 某些物质与抗原一起或先于抗原注入 机体，可增强机体对该抗原的特异性 免疫应答或改变免疫应答类型，此类 物质称为免疫佐剂(immunoadjuvant)， 简称佐剂。
1. 佐剂的种类
佐剂一般包括以下几类： ①无机佐剂： 如氢氧化铝、明钒等 ②生物性佐剂： 如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆 菌、百日咳杆菌、革兰阴性杆菌内毒素、霍乱毒素 的B亚单位、胞壁酰二肽和细胞因子等； ③人工合成佐剂： 如双链多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）、双链多聚腺苷酸：尿苷酸（poly A：U）； ④油剂：如弗氏完全佐剂、花生油乳剂等； ⑤纳米佐剂
• • • • • （一）免疫原的制备 （二）免疫动物 （三）免疫血清的收集 （四）免疫血清的鉴定 （五）免疫血清的保存
操作步骤
一、免疫原的制备
免疫原（immunogen）指能刺激机体免疫
系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗 原最重要的性质是免疫原性 （immunogenicity）
免疫原—天然抗原、人工 合成抗原； 蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原；
2.连接方法
半抗原与载体的连接有物理法和化学法。
• 物理法 是用物理吸附法将载体与半抗原连 接，其原理是通过电荷和微孔来吸半抗原， 吸附载体主要有PVP和CMC等； • 化学法 是利用某些功能基团把半抗原连接 到白质类或多肽类聚合物载体上。不同的半 抗原应选用不同的方法进行连接。
ห้องสมุดไป่ตู้
根据半抗原拥有的化学基团不同，连接方 法主要有以下几类： ①带游离氨基或羧基以及二种基团皆有的半抗原： 羧基可用混合酸酐法和碳二亚胺法与载体氨基 形成稳定的肽键，带氨基的半抗原则可与载体 羧基缩合。 ②带有羟基、酮基、醛基的半抗原：不能直接与 载体连接，需要用化学方法如琥珀酸酐法、O（羧甲基）羟胺法等方法将之转变为带有羧基 的半抗原衍生物后才能与载体连接。 ③带有酚基的半抗原，可用一氯醋酸钠法或重氮 化的对氨基苯甲酸法，生成带有羧基的半抗原 衍生物。
凝胶过滤层析( 分子筛)的作用机理
亲和层析的作用机理
3）鉴定： 鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、 纯度以及免疫学活性。 • 蛋白的含量—定氮（紫外光280nm等） • 分子的质量—电泳、质谱 • 蛋白的纯度—电泳等 • 免疫学活性—免疫双扩散、免疫印迹
抗原性质分析结果
（三）半抗原性免疫原的制备
（一）细胞性抗原制备： 绵羊红细胞（SRBC）- 溶血素； 细菌- 抗菌抗体（动物免疫血清） （二）可溶性抗原制备： 指蛋白质、多糖和脂类等。
1）细胞的破碎（物理法、化学法）
• • • • • 反复冻融法 超声破碎法 自溶法 酶处里法 表面活性剂处理法
• 2）提取与纯化： ①超速离心分离—是一种根据分离物质的 比重特点，通过差速或梯度密度离心， 将分子大小不同的抗原颗粒分开的方法， 只适宜少数大分子物质的分离。
1.载体选择 • 常用载体：蛋白质、多肽聚合物、大分子聚合物。 （1）蛋白质类：常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋 白、血蛋白等，其中以牛血清白蛋白最为常用。 （2）多肽类聚合物：是由人工合成的多肽聚合物，也 是一类良好的载体，常用的有多聚赖氨酸。 （3）大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲 基纤维素(CMC)等皆可与半抗原结合，加入福氏完 全佐剂可诱导动物产生良好的抗体。
单 克 隆 抗 体 和 多 克 隆 抗 体 产 生 区 别 示 意 图
脾
骨髓瘤小鼠 取腹水
抗原
B 细 胞
骨髓瘤细胞 + PEG, 融合 杂交瘤细胞
Ab1 Ab2 Ab3 Ab4
抗血清
HAT培养， 稀释
Ab3 Ab1 Ab2
Ab4
普通抗血清（多克隆抗体）
Ab1
Ab3
Ab4
单克隆抗体
多克隆抗体制备流程
②选择性沉淀—选择某抗原理化特性，采用相应沉 淀剂或溶液环境。 核酸去除 盐析沉淀法 有机溶剂沉淀法 高分子聚合物沉淀法 例： 50%饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出学清球蛋； 8%～12%PEG6000可沉淀IgG。
•
盐析法沉淀抗原的机理
③超滤法—利用孔径大小不同的特制薄膜对 不同分子大小的抗原物质进行滤筛。 ④层析法— 凝胶过滤 离子交换 亲和层析 ⑤电泳——（略）
3、单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAb）：由一个识别一种抗原表位的B细 胞克隆产生的同源抗体。高度均一、特异 性强、效价高、少或无交叉反应性。
抗体的制备技术经历了三代： • 第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用 抗原免疫动物后获得抗体，称为多克隆抗 体（polyclonal antibody）； • 第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对 抗原中某一抗原决定簇的抗体称为单克隆 抗体(monoclonal antibody, McAb)； • 第三代抗体是利用基因工程技术制备而来， 称为基因工程抗体(genetic engineering antibody)。
多克隆抗体的制备及 抗体效价测定
目的要求
• 掌握多克隆抗体制备的基本原理。 • 掌握多克隆抗体制备的操作步骤。 • 掌握肥达反应的实验原理、操作流程和结果判 断。 • 熟悉ELISA的实验原理、操作流程和结果判断。 • 了解细菌抗原和病毒抗原免疫程序上的异同。 • 了解免疫动物的选择原则。
原理
1、克隆(clone)： 是指无性繁殖细胞系，是由单一 个祖先细胞分裂繁殖而形成的一簇细胞纯系。在 这个家族的所有成员中，如无突变发生，其基因 是完全相同的。 2、多克隆抗体（polyclonal antibody, pAb）：用 一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺 激机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的 不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种 抗体的混合物，即多克隆抗体。