土壤中霉菌的分离
土壤中微生物的分离与鉴定实验报告
Sdu微生物大实验土壤微生物的分离纯化与鉴定【实验目的】1、从各地区土壤中筛选含几丁质酶的真菌及含果胶酶的菌株；2、通过从土壤中分离纯化菌株，掌握培养基的制备与灭菌技术、微生物的筛选、分离纯化方法和无菌操作技术。
3、复习以前学过的各种染色方法，掌握生理生化试验的原理与方法。
4、掌握微生物的鉴定技术、菌种保藏技术。
【实验原理】1、微生物的分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
此次实验采取平板分离法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其基本原理主要包括两个方面：a.选择适合于待分离微生物的生长条件或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰大部分不需要的微生物。
b.微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。
获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板法或平板划线法等技术来完成。
微生物的观察可以用显微镜观察其细胞形态，也可以用肉眼观察其菌落形态。
前者是微生物的显微镜观察技术，后者是微生物的肉眼观察技术。
2、霉菌：霉菌可产生复什分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。
霉菌菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。
霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多（约 3-10μm ），常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。
观察霉菌的形态有多种方法，常用的有直接制片观察法、载玻片培养观察法和玻璃培养观察法三种方法，本实验采用载玻片培养观察法。
3、果胶酶筛选培养基：配制以果胶为唯一碳源的筛选培养基，在该培养基上，只有能分解利用果胶的菌株才能够生长，依此来从土壤中筛选出能够产果胶酶的菌株。
刚果红（Congo Red,简称CR）是一种染料，它可与果胶形成红色复合物，但并不和果胶水解后的产物发生这种显色反应，在含有果胶的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的果胶形成红色复合物。
实验七稀释平板计数法及土壤中真菌的分离纯化
4、涂平皿： 每个稀释度均需要涂布平皿，每皿取菌液0.1ml，
用玻璃刮铲涂布均匀。
5、28℃倒置培养3~7天
6、观察并描述真菌菌落特征
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五、实验结果及分析
稀释平皿计数法：
稀释倍数 106
107
108
菌落数
每ml原菌样品中微生物的活细胞数（菌落形成数，CFU＝
（同一稀释度平板上菌落平均数×稀释倍数）/原菌样品体积
（ml）
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描述酵母菌菌落特征： 描述霉菌菌落特征
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5、37℃倒置培养2天
6、计数：
每ml原菌样品中微生物的活细胞数（菌落形成数，CFU＝
（同一稀释度平板上菌落平均数×稀释倍数）/原菌样品体积
（ml）
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菌落计数规则： （一）选择平均菌落数在30~300间的平板
1、只有一个稀释度符合，以该稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告； 2、有两个稀释度符合，取决于二者比值（高稀释度的菌落数除以低稀释 度的菌落数的值）：
2、若所有稀释度的菌落平均数均小于30，则按稀释倍数最低的平均菌落
数乘以稀释倍数报告；
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四、实验步骤---从土壤里分离真菌
1、熔化培养基 2、倒平皿 3、捻碎土样，将土样溶解在90ml无菌水三角瓶中 4、梯度稀释法稀释土样
10g 10-1
90ml
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10-2
10-3
10-4
1可0-5 编辑版
实验七 稀释平板计数法及土壤中真菌的 分离纯化
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一、实验目的
掌握活菌计数的基本原理及方法 掌握从样品中分离目的微生物的原理及方法
从土壤中分离霉菌的方法
从土壤中分离霉菌的方法咱得先准备好东西呢。
你得有土样，就从你家院子里或者附近小花园挖点土就行。
然后呢，还得有培养基，这就像是霉菌的小餐桌，让它们能在上面生长。
像马丁氏培养基就挺不错的。
还有一些小工具，像无菌水、接种环之类的。
有了这些东西，就开始操作啦。
把土样取来之后，咱得把它放到无菌水里面。
这就像是给土样洗个澡，让里面的霉菌能和土分开点。
你就想象那些霉菌在水里自由自在地游着，不过是微观世界里的小游动啦。
接着呢，要把这个含有土样的无菌水进行稀释。
为啥要稀释呢？因为如果不稀释，那霉菌太多了，都挤在一起，咱就不好区分它们啦。
就像一群人挤在一个小房间里，你都分不清谁是谁，稀释了就像是把他们分散到不同的小房间，看得清楚多啦。
然后把稀释后的溶液，用接种环取一点，放到培养基上。
这就像是把小霉菌们送到它们的新家里。
之后把培养基放到合适的环境里，一般霉菌喜欢温暖又有点潮湿的地方。
就像我们人喜欢住在舒服的房子里一样，霉菌也得有个适宜的环境才能茁壮成长呢。
过几天之后呀，你就会看到培养基上长出各种各样的东西啦。
霉菌呢，一般是毛茸茸的，有各种颜色，像白色、绿色之类的。
这时候你就可以仔细观察啦，看看哪些是你想要的霉菌。
不过宝子们要注意哦，在整个过程中一定要保持无菌的操作。
就像我们在做一件超级精致的手工一样，不能让别的细菌之类的混进来捣乱。
要是不小心混进来了，那就像是一场小派对来了不速之客，会把整个事情搞得乱糟糟的。
从土壤中分离霉菌就是这么个有趣的过程，虽然有点小复杂，但只要你细心一点，就可以成功啦。
等你真的分离出霉菌的时候，那种成就感就像你自己做出了一道超级美味的菜肴一样棒呢。
霉菌的分离实验报告
霉菌的分离实验报告引言霉菌是一类真菌，广泛存在于自然界的土壤、空气、植物等环境中。
它们以分解有机物质为生，在自然界中具有重要的生态作用。
然而，霉菌也是一种常见的病原微生物，能够引起多种人类和动植物的感染疾病。
为了更好地了解霉菌的特性和传播途径，本实验旨在通过分离方法获取纯净的霉菌菌株，并初步分析其形态特征。
实验材料和方法实验材料：- 手套- 剪刀- 无菌培养基（琼脂）- 玻璃棒- 离心管- 蒸馏水- Petri 洁净培养皿- 测量瓶实验方法：1. 霉菌样品的收集：在潮湿的环境中选择具有明显霉斑的表面进行采样，避免采集到周围环境中的杂菌。
2. 实验场所的准备：在无菌条件下完成所有操作，保持实验环境的卫生。
3. 样品处理：带着手套使用剪刀将具有霉斑的样品剪下，并将其放入离心管中。
加入20 ml 的蒸馏水，将离心管盖好，摇匀样品，使其充分悬浊。
4. 稀释与分离：取0.1 ml 的上述悬浊液加入测量瓶中，再加入9.9 ml 的蒸馏水进行10倍稀释。
取1 ml 的稀释液加入离心管中，再加入9 ml 的蒸馏水进行10倍稀释。
依次取样进行稀释，最后取适量稀释液均匀涂布在无菌琼脂培养皿上。
5. 培养条件：将琼脂培养皿孵育在恒温培养箱中，温度为25 ±2，培养时间为48 - 72小时。
6. 菌落形态观察：在培养箱中取出培养皿，通过目测观察霉菌菌落的形态特征，如颜色、形状、凸起程度等。
实验结果经过培养箱中的恒温孵育，在培养皿上出现了多个菌落。
根据其形态特征，选取了三个菌落用无菌棉签分别划线后进行传代。
菌落1- 颜色：灰白色- 形状：圆形- 表面：粗糙- 边缘：光滑菌落2- 颜色：绿色- 形状：不规则- 表面：绒毛状- 边缘：锯齿状菌落3- 颜色：黑色- 形状：扁平- 表面：光滑- 边缘：光滑结论通过实验，成功分离得到了三种霉菌菌株，并对其进行了初步的形态特征分析。
菌落1为灰白色、圆形，表面粗糙，边缘光滑；菌落2为绿色、不规则形状，表面绒毛状，边缘呈锯齿状；菌落3为黑色、扁平形状，表面光滑，边缘光滑。
土壤中微生物的分离纯化(电子版实验报告)
微生物实验报告土壤中微生物的分离与纯化指导教师：李海花周四晚第四组实验成员: 杜玉琪180112010009董天涵180112010008蒋怡菲180112010018逄颖180112010035【摘要】利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离和纯化，通过观察微生物的菌落形态特征判断菌的类型并通过平板划线进行分离纯化【关键词】土壤、微生物、菌落观察、分离纯化1.实验目的（1）通过对几种培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。
（2）掌握倒平板的方法、接种和无菌操作技术。
（3）初步观察来自土壤中的几类微生物的菌落形态特征，并能判断菌的类型。
（4）学习平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基本技能。
2.实验原理（1）培养基的配制与灭菌培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别、保存各种微生物或积累代谢产物。
一般的培养基应包含适合微生物生长的6大营养素即水分、碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子。
不同微生物对pH要求不一样，霉菌和酵母菌的培养基的pH一般是偏酸的，而细菌和放线菌培养基的pH一般为中性或微碱性。
所以配制培养基时还要根据不同微生物的要求将培养基的pH调到合适的范围。
已配制好的培养基必须立即灭菌，如来不及灭菌，应暂存冰箱，以防止其中微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养基酸碱度所带来不利影响。
（2）微生物的培养及鉴定接种：将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。
接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。
接种的关键是要严格的进行无菌操作。
鉴定：常见与常用的微生物中,根据它们的主要形态可分为细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类。
细菌菌落光滑，易于基质脱离；放线菌菌落质地致密，菌落较小，广泛延伸；酵母菌菌落较细菌菌落大而厚；霉菌形成的菌落较稀松，多成绒毛状，絮状。
（3）平板分离与活菌计数倒平板：按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、土样编号和实验日期等。
土壤微生物的分离纯化与鉴定
目录摘要利用分离纯化微生物的基本操作技术以及选择培养基对土壤中的微生物进行分离与纯化,得到能够产生果胶水解酶的细菌以及能够分解几丁质的霉菌;根据菌落形态观察,革兰氏染色结果,芽孢有无及位置,运动性以及一系列的生理生化试验的结果,对照种属特征初步鉴定分离纯化的微生物所属的类群;关键词土壤微生物、细菌、果胶、霉菌、几丁质、划线分离、纯培养前言在自然条件下,微生物常常在各种生态系统中群居杂聚;群落是不同种类微物的混和体;为了生产和科研的需要,人们往往需要从自然界混杂的微生物群体中分离出具有特殊功能的纯种微生物；或重新分离被其他微生物污染或因自发突变而丧失原有优良性状的菌株；或通过诱变及遗传改造后选出优良性状的突变株及重组株;这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物的分离纯化技术;纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代;分离纯化技术主要由采集样品、富集培养、纯种分离和性能测定等几个基本环节组成;实验目的1.学习利用选择培养基从土壤中分离能够产生特殊水解酶的细菌以及霉菌的方法；2.学习运用划线分离法纯化分得的细菌以及真菌的方法；3.学习测定土壤中细菌数目,种类的方法；4.根据菌落形态,染色结果,运动性以及生理生化试验鉴定未知细菌；小室培养法观察鉴定未知真菌;实验原理一、经典分类鉴定方法以上便是在微生物鉴定过程中的经典思路及流程,因此我们可以针对以上各项指标设计一系列试验包括形态学观察,染色,生理生化试验,免疫学试验等对其进行逐步定位;二、现代分类鉴定方法1．微生物遗传型的鉴定（1） DNA碱基比例的测定 G+Cmol%以下为该方法的关键因素：解链温度法Tm值G+Cmol%值只能做否定判断；G+Cmol%值差别>5,属不同的种；差别>10,属不同的属;2 核酸分子杂交法DNA-DNA分子杂交原理：DNA分子解链的可逆性和碱基配对的专一性;结论：I DNA同源性≥ 60% 同种II DNA同源性≥ 70% 同亚种III DNA同源性60~ 70% 不同亚种IV DNA同源性20~ 60% 同属316s rRNA作为细菌进化的计时器本次实验中由于实验性质以及仪器试剂限制,主要以微生物形态鉴定以及生理生化指标鉴定为主;实验整体思路：在确定取样环境之后,对微生物原样进行梯度稀释,产生合适的浓度在选择培养基上进行涂板用于微生物的选择与计数；通过检测得到有特定功能的细菌以及霉菌进行菌种的分离纯化,用平板划线法多次划线得到纯种；对得到的纯种细菌染色并镜检,利用形态学方法以及运动性对微生物做一粗略的定位；根据镜检设计相关生理生化试验作进一步定位；运用小室培养法观察霉菌形态并对其进行鉴定；根据以上获得的信息确定微生物类群并加以定位;实验仪器及材料1.土样：18号土样2.试剂及培养基a)培养基：果胶酶筛选培养基；几丁质酶真菌筛选培养基；果胶酶划线分离培养基；几丁质酶划线培养基；细菌半固体培养基；淀粉培养基；葡萄糖酵解培养基；乳糖酵解培养基；蛋白胨水培养基b)试剂：草酸铵结晶紫染液、番红复染液等各种染料以及卢戈氏碘液、95%乙醇、5%孔雀绿水溶液、无菌水等3.仪器锥形瓶500mL×2；300mL×2；100mL×3、培养皿20套、试管20支、移液管3支、烧杯、玻璃棒、载玻片、盖玻片、光学显微镜、涂布棒、U型管、德汉氏小管、酒精灯、漏斗、接种环、滤纸、棉塞、牛皮纸、无菌操作台、灭菌锅、纱布等实验步骤A.细菌的筛选,分离纯化及鉴定1.细菌的筛选a)土样处理i.配制生理盐水：在烧杯中配置％的生理盐水,用移液管各移取9ml于五支洁净试管,再移取90ml配置好的生理盐水于三角烧瓶,并放入少许玻璃珠,包好灭菌；ii.加土样：冷却后准确称取10g土样放入盛有90ml无菌生理盐水并带有少许玻璃珠的三角烧瓶中,充分震荡摇匀,然后放在30℃恒温培养箱中静置15min;b)果胶酶菌种筛选i.梯度稀释：用一支无菌吸管吸取1ml土壤悬液加入到盛有9ml无菌水的试管中充分混匀,此为10-1稀释液,以此类推制成10-2、10-3两种稀释度的土壤溶液如下图；ii.涂布：配制果胶酶筛选培养基,110度灭菌20-30分钟,冷却后倒平板在培养皿盖周边用记号笔做好标记,分别写上10-1、10-3两种稀释度字样,每稀释度标记三皿,然后用无菌吸管分别由10-3、10-1两管土壤稀释液中吸取适量对好放入已写好稀释度的平板中央位置,每皿准确放入,用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀,其方法是将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动,使之均匀分布,然后改变方向90度沿另一垂直线来回推动,平板内边缘处改变方向用涂布棒再涂布几次；iii.培养：将平板倒置于30℃恒温箱中培养1-2天；iv.果胶酶透明圈平板检测：取10-1涂布平皿,用％的刚果红染色15-20min后,倒掉刚果红,用1mol/L的NaCl脱色几分钟至观察到透明圈,则说明水解圈内的菌有水解果胶的能力；v.菌落描述：取此菌进行菌落形态描述,就菌落的大小大、中,小,颜色白,黄,粉红等,干湿干、湿,边缘整齐,不整齐,表面光滑,粗糙,有无突起等分别进行阐述并详细记录；2.细菌的分离纯化a)划线分离：制备果胶酶划线培养基,灭菌后倒平板,挑取具有水解圈的菌种,第一次划线分离培养1-2天后取分离所得单菌落再进行第二次划线分离,划线分离的具体方法是：先在平皿上划定区域,然后将接种针在火焰上进行灭菌操作,取含菌种的培养皿,在火图细菌的划线分离示意图焰上方注意：不能离火焰太近打开培养皿盖,先拿接种针在上盖处划线以降温,然后用接种针轻挑所选菌落一到两下,将平皿盖上放好,再取刚刚冷却了的干净平皿在1区进行划线接种操作;操作完毕后对接种针进行灭菌操作,完成后在火焰上方打开平皿盖,将接种针冷却后从1区引线到2区,再如图所示划线,划完后引线到3区,同上进行划线,划线完毕后盖盖平放；b)纯种保藏：再配制一份普通细菌培养基,分装试管后灭菌,制得斜面,将纯种划线接种在斜面上培养保存并进行下一步的鉴定;3.细菌的基本形态及运动性鉴定a)纯种果胶酶水解能力的测定配制果胶酶筛选培养基,110度灭菌20-30分钟,冷却后倒平板在培养皿盖周边用记号笔做好标记,将分离纯化的细菌点种于平板上注意：点种的量不宜过多,以3～4个为宜,在30℃培养箱中培养1～2天,取培养后的平皿用％的刚果红染色15-20min后,倒掉刚果红,用1mol/L的NaCl脱色几分钟至观察到透明圈,测量并记录透明圈的大小b)简单染色步骤i.涂片取一块载玻片,在上边用胶头滴管加半滴无菌水,用接种环无菌操作将沾有菌的接种环置于载玻片上的无菌水种涂抹,待看到微弱的浑浊即可；注意取菌不要太多ii.干燥与固定涂菌面朝上,通过火焰以干燥并固定菌物,固定过程应使载玻片通过火焰2-3次,注意温度的控制,过热的温度会将细菌杀死,温度以手背感觉微微发烫为标准；iii.染色将载玻片平放于载波片支架上,滴加结晶紫染液覆盖涂菌部位即可,染色iv.水洗倾去染液,将载玻片的涂菌面朝下,自来水冲洗,水流不宜太急、太大,至洗出水无色为止；v.干燥用吸水纸吸去多余水分后自然干燥；vi.镜检将制备好的样片置于显微镜下进行观察,先低倍观察,再高倍观察,并找出适当的视野后,将高倍镜转出,在涂片上加香柏油,用油镜观察细菌的形态;c)革兰氏染色步骤i.涂片先在载玻片一侧用记号笔标记间隔的四个区域,在另一侧四个区域的位置分别滴加半滴无菌水;分别取四种活跃生长期菌种大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,枯草杆菌和一种自选菌按常规方法涂片不宜过厚,用酒精灯按照简单染色中所述干燥和固定的方法对四种菌进行干燥和固定;ii.初染滴加草酸铵结晶紫染液使之覆盖涂菌部位,染色后水洗；iii.媒染先用卢戈氏碘液冲去残留水迹,再用碘液覆盖1min后水洗；iv.脱色先用乙醇冲去水迹,然后用95%乙醇覆盖脱去色素,脱色约30s,立即用水冲洗；v.复染先用番红洗去水迹,然后滴加番红复染后水洗；vi.镜检将制备好的样片置于显微镜下进行观察,先低倍观察,再高倍观察,并找出适当的视野后,将高倍镜转出,在涂片上加香柏油,用油镜观察细菌;分别以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌所染颜色作为对照,来判断枯草杆菌以及另一种自选菌的染色结果;d)芽孢染色步骤i.涂片,加热干燥及固定在洁净盖玻片接近中部两处分别滴一滴无菌水,分别接种枯草芽孢杆菌及梭状芽孢杆菌;然后按照常规方法加热干燥及固定；ii.孔雀绿加热染色用木夹夹住载玻片,向载玻片上滴加5%孔雀绿水溶液使之完全覆盖涂菌部位,然后在酒精灯上微微加热孔雀绿着色能力强,加热可使较难染色的芽孢染成绿色,且再难洗脱至染液冒蒸汽开始计时并维持5min,注意加热时应以有蒸汽微微冒出为宜,过热或加热不足均会影响观察效果,且加热时在载玻片上随时补加染液,切勿让涂片干涸；iii.水洗水洗一定要等载玻片冷却后进行,否则可能导致载玻片的破裂;具体水洗按常规方法进行；iv.复染用%番红水溶液复染2min；v.水洗并干燥按常规方法水洗后自然干燥；vi.镜检先在低倍镜下寻找视野范围,然后换用高倍镜调焦,最后加香柏油在油镜下仔细寻找两种细菌以及其周围或内部染成绿色的芽孢;e)半固体穿刺法观察细菌运动性i.配制培养基配制半固体牛肉膏蛋白胨培养基,分装于4支试管内,110度灭菌20-30分钟,正立于烧杯中冷却至室温；ii.在无菌操作台上右手握接种针,以针挑取菌苔.垂直刺入半固体琼脂培养的中心直至接近但勿触及试管底,然后循原路退出;如图所示：iii.接种完成后在30℃条件下培养两天观察并判断其运动性;4.细菌的生理生化试验a)淀粉水解试验i.培养基制备配制淀粉培养基,灭菌后将冷却至50℃左右,无菌操作制成平板；ii.接种用记号笔将平板划成四部分,将所鉴定的菌种在不同位置点种;注：由于四种菌对淀粉的水解程度不同,为防止由于接种量过大导致四种菌对应区域水解部位发生重叠,宜采用点种的方式,如下图;接种完成后贴好标签；iii.培养将上述已接种的平板倒置于30℃培养箱中培养48小时;b)葡萄糖发酵试验i.培养基配制将配制好的葡萄糖发酵培养基分装于试管中同时向每只试管中加入一支德汉氏小管后放入灭菌锅中进行湿热灭菌,冷却至室温;ii.接种用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名;取盛有葡萄糖发酵培养基的试管2支,接种鉴定菌,另一支作为对照;iii.培养将上述已接种的试管置于30℃培养箱中培养48小时;c)乳糖发酵试验i.培养基配制将配制好的乳糖发酵培养基分装于试管中同时向每只试管中加入一支德汉氏小管后放入灭菌锅中进行湿热灭菌,冷却至室温;ii.接种用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名;取盛有乳糖发酵培养基的试管2支,接种鉴定菌,另一支作为对照;iii.培养将上述已接种的试管置于30℃培养箱中培养48小时;d)吲哚试验i.培养基的配制将配制好的蛋白胨水培养基分装于试管中后放入灭菌锅中进行湿热灭菌,冷却至室温;ii.接种用记号笔在各试管上标明所接种的菌名;取盛有蛋白胨水培养基的试管2支,接种鉴定的菌种;iii.培养将上述已接种的试管置于30℃培养箱中培养48小时;e)甲基红试验i.培养基的配制将配制好的蛋白胨水培养基分装于试管中后放入灭菌锅中进行湿热灭菌,冷却至室温;ii.接种用记号笔在各试管上标明所接种的菌名;取盛有蛋白胨水培养基的试管2支,接种鉴定的菌种;iii.培养将上述已接种的试管置于30℃培养箱中培养48小时;5.土壤中分解果胶细菌种类和数目的测定及纯化细菌菌属鉴定取培养三天的菌液1000倍稀释涂布平板3个,观察不同形态菌落的数目以及总菌落数,并记录,求3个平板的总菌数平均值来计算1g土壤中分解果胶的细菌数目;根据以上细菌的形态,革兰氏染色结果,芽孢的位置,运动性以及生理生化试验结果查看伯杰手册对纯种细菌做出鉴定;B.霉菌的筛选,分离纯化及鉴定1.霉菌的筛选a)涂布配制几丁质酶筛选培养基,110度灭菌20-30分钟,冷却至不烫手,无菌操作加链霉素1mL/1000mL倒平板在培养皿盖周边用记号笔做好标记,分别写上100、10-2两种稀释度字样,每稀释度标记三皿,然后用无菌吸管分别由100、10-2两管土壤稀释液中吸取适量对好放入已写好稀释度的平板中央位置,每皿准确放入,用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀,其方法是将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动,使之均匀分布,然后改变方向90度沿另一垂直线来回推动,平板内边缘处改变方向用涂布棒再涂布几次；b)培养将平板倒置于30℃恒温箱中培养2-3天；2.霉菌的分离纯化a)划线分离：制备几丁质酶划线培养基,灭菌后倒平板,挑取长出的菌种,第一次划线分离培养2-3天后取分离所得单菌落再进行第二次划线分离,划线分离的具体方法是：先在平皿上划定区域,然后将接种针在火焰上进行灭菌操作,取含菌种的培养皿,在火焰上方注意：不能离火焰太近打开培养皿盖,先拿接种针在上盖处划线以图霉菌的划线分离示意图降温,然后用接种针轻挑所选菌落一到两下,将平皿盖上放好,再取刚刚冷却了的干净平皿在1区进行划线接种操作;操作完毕后对接种针进行灭菌操作,完成后在火焰上方打开平皿盖,将接种针冷却后从1区引线到2区,再如图所示划线,划完后引线到3区,同上进行划线,划线完毕后盖盖平放；b)再配制一份PDA培养基,分装试管后灭菌,制得斜面,将纯种划线接种在斜面上培养保存并进行下一步的鉴定;3.小室培养法鉴定霉菌a)灭菌准备制作4个平皿,在每个平皿皿底铺一张略小于皿底的圆滤纸片,再放一U形玻棒,其上放一洁净载玻片和四块盖玻片,盖上皿盖、再与1个空平皿一起用牛皮纸包好；在100mL锥形瓶中用甘油配制20%的甘油,加塞包好；最后取10mL 移液管两支用牛皮纸包好;b)灭菌将上述用牛皮纸包好的仪器与试剂连同配好的PDA培养基一并放入灭菌锅中110℃灭菌30min由于培养基中有葡萄糖,为防止由于高温而使糖发生糊化而变质,灭菌温度不宜过高;c)制作琼脂薄片在无菌操作台上分别取已灭菌并溶化冷却至约50℃的马铃薯琼脂培养基6～7mL 注入两个灭菌空平皿中,使之凝固成薄层;在两个凝固后的平板背部用记号笔画下约1～×1～的方格,通过无菌操作,用解剖刀沿画下的方格线将其切成方形的琼脂块;注：解剖刀使用前应先在酒精中浸泡,然后在酒精灯上灼烧,冷却后再进行切割操作d)接种在无菌操作台上,先用镊子将载玻片放于U型玻璃管上,然后用解剖刀取一小块儿琼脂块,置于载玻片上注意：镊子与解剖刀每次使用前都应先在酒精中浸泡,灼烧冷却后再进行下一步的操作,用接种环分别从斜面培养物上挑取很少量的鉴定菌的孢子,分别接种于培养小室中琼脂块的边缘上,用无菌镊子将盖玻片覆盖在琼脂块上;最后用移液管在培养小室中的圆滤纸上加3ml 灭菌的20 %的甘油用于保持平皿内的湿度 ,盖上皿盖并贴标签,每一种菌接种两个小室;e)恒温培养将接种后的平皿正置于28℃培养箱中恒温培养3～4天;f)镜检在显微镜下直接观察小室培养后的载玻片,用低倍镜即可较为清晰的观察到霉菌的菌丝体及孢子,根据真菌手册对所得的菌进行鉴定;实验结果A.细菌部分倍稀释平板的细菌种类和数目表错误!未定义书签。
土壤、水质检测——放线菌、霉菌、大肠杆菌的分离方法
土壤、水质检测——放线菌、霉菌、大肠杆菌的分离方法微生物因为体积小、质量轻、适应性强、繁殖能力强等特点，广泛分布于自然界中。
它们存在于食品、化妆品、饲料、环境等人们能触及的各个角落中。
某些微生物对产品的污染，不仅影响到产品本身的质量，更严重的是它危及消费者的健康和安全。
科标检测研究院凭借多年的微生物检测经验，可提供快速、高效、权威的第三方微生物检测服务，赢得社会业内广泛认可。
主要针对食品、医药、化妆品、农产品、一次性产品以及工业产品等进行微生物检测以及产品微生物污染分析。
以下介绍几种菌的分离方法：一、从土壤中分离放线菌1.制作高氏一号培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。
2.称取土壤10克，放入装有100毫升无菌水的锥形瓶中，并加入10%酚10滴，以抑制细菌生长。
振荡10分钟，制成10-1菌悬液。
按照连续稀释分离法，进一步制成10-3菌悬液。
3.用移液管吸取0.1毫升10-3菌悬液，注入平板培养基上，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀涂抹在整个培养基上。
然后将培养皿倒置于25-30℃温箱中，培养7-10天，培养基上会出现微生物菌落。
如果菌落的硬度较大，干燥致密，且与基质紧密结合，不易被针挑起，这就是放线菌菌落。
4.挑取放线菌菌落，接种于斜面培养基上。
二、从土壤中分离霉菌1.制作豆芽汗葡萄糖培养基，并添加80%乳酸数滴，以抑制细菌生长。
将培养皿中，凝成平板，待用。
2.称取10克土壤，按上述分离放线菌的方法制成10-4或10-5的菌悬液。
3.取0.1毫升菌悬液注入培养皿内培养基上，用玻璃刮刀涂抹均匀。
然后将培养皿倒置于2 5-30℃温箱内培养3-4天。
培养基上会出现微生物菌落。
霉菌菌落常长成绒状、棉絮状或蜘蛛网状，可根据这一特征寻找霉菌菌落。
4.挑取培养皿内的霉菌菌落接种于斜面培养基上三、从饮水中分离大肠杆菌1.制作伊红美蓝培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。
2.用灭过菌的锥形瓶盛取河水或沟水，按1:10稀释。
曲霉的分离问题回答
曲霉的分离曲霉是一种真菌，广泛存在于自然界中的土壤、水体和空气中。
它们具有很强的代谢能力，可以分解有机物质，是生物降解和有机废弃物处理的重要微生物。
此外，曲霉还可以产生一些重要的代谢产物，如抗生素、酶、有机酸等，在食品工业、医药工业、环境保护等领域具有广泛应用。
曲霉的分离是研究其代谢特性和产物合成机制的基础。
以下是关于曲霉分离的详细介绍：1. 分离方法（1）土壤样品法：从自然环境中采集土壤样品，将其加入含有适当营养成分的琼脂培养基中，在适当温度下培养并筛选出曲霉菌株。
（2）空气样品法：采用空气采样器采集室内或室外空气中的微生物样品，将其接种到含有适当营养成分的琼脂培养基中，在适当温度下培养并筛选出曲霉菌株。
（3）食品样品法：从食品中采集曲霉样品，将其接种到含有适当营养成分的琼脂培养基中，在适当温度下培养并筛选出曲霉菌株。
2. 培养条件曲霉的生长和代谢需要适宜的温度、湿度和营养物质。
通常情况下，曲霉的最适生长温度为25℃-30℃，最适生长pH值为5.0-7.0。
在培养基中添加合适的碳源、氮源和矿物质元素可以促进曲霉菌株的生长和代谢。
3. 筛选方法在分离得到曲霉菌株后，需要进行筛选以获得具有特定代谢特性或产物合成能力的菌株。
常用的筛选方法包括：（1）形态学特征：通过观察菌落形态、颜色、纹理等特征来鉴定不同种类的曲霉菌株。
（2）抗生素活性：利用抑制其他微生物生长的能力来筛选具有抗生素活性的曲霉菌株。
（3）酶活性：利用曲霉产生的酶来分解特定底物，通过观察底物的降解情况来筛选具有特定酶活性的曲霉菌株。
（4）代谢产物：通过检测曲霉菌株发酵液中的代谢产物来筛选具有特定代谢能力的曲霉菌株。
4. 保存方法分离得到的曲霉菌株需要进行保存以便后续研究。
常用的保存方法包括：（1）冷冻法：将曲霉菌株培养在含有10%-20%甘油或DMSO的琼脂培养基上，将其置于-80℃低温条件下保存。
（2）干燥法：将曲霉菌株培养在琼脂培养基上，将其置于干燥器中进行干燥处理，然后将其保存在低温、低湿度条件下。
如何从土壤中分离出微生物
如何从土壤（污水）中分离出微生物把污水加蒸馏水分别稀释10，100，1000倍，然后加入培养基中培养，如果培养出来菌落重合，菌非常多，无法分离，就加大稀释倍数，直至获得清晰可分离的菌落，有时甚至是非常小的菌落，要用倒置显微镜操作。
而培养基则根据要分离的菌的营养类型进行配置，若要获得多种微生物就要配置多种培养基进行如上操作。
对于土壤加水溶解，对溶解液进行如上操作，不溶的部分就不用管了1.取以少许土壤（一地表以下10cm处为宜）与适量无菌水混匀备用2.做浸出液的梯度稀释3 .涂平板4.划线分离5.接平板，接斜面6.检测从土壤中分离微生物环境工程（1）班一、试验目的1..学会土壤微生物的检测方法，了解土壤中微生物的数量和组成。
2初步掌握从土壤中分离细菌的基本技术。
二、实验原理土壤是微生物生活最适宜的环境、它具有微生物所需要为一切营养物质和微生物进行生长繁殖及生存的各种条件．所以土壤中微生物的数量和种类都很多。
它们参与土壤的氮、碳、硫、磷等元素的循环作用。
此外，土壤中微生物的活动对土壤形成、土壤肥力和作物生产都有非常重要的作用。
因此，查明土壤中微生物的数量和组成情况，对发掘土壤微生物资源和对土壤微生物实行定向控制无疑是十分必要的。
三、实验器材(—)培养基肉膏蛋白胨琼脂培养基（培养细菌）高氏一号琼脂培养基（培养放线菌）查氏培养基（培养霉菌）(二)灭菌稀释水、灭菌吸管、灭菌培养皿。
(三)土壤样品、天平、称旦纸。
（四）恒温箱、气体流量计四、试验程序1、倒平板将培养基加热融化，待冷至55—60℃时，混合均匀后倒平板；2、制备土壤稀释液准确称取土样10g，加入装有90ml 无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡约20min，使土样与水充分混匀，将细胞分散。
用一支无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1 ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、等一系列稀释菌液3、涂布将无菌平板编上10-4、10-5、10-6号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-6稀释液各1ml放入编号10-6的3个平板中，同法吸取10-5稀释液各lml放入编号10-5的3个平板中，再吸取10-4稀释液各lml放入编号10-4的3个平板中（由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换）。
实验二土壤中微生物的分离纯化及观察
实验结果
➢ 详细描述实验中各种微生物在斜面上、半固体和液体 培养基中的培养特征。
思考题
➢ 一个好氧的具周生鞭毛的菌株分别在斜面、半固体和 液体培养基中的培养特征。
➢ 用斜面检测微生物的培养特征接种时，为什么不要划 多条线或蛇形，而只要划一条直线？
➢ 接种环（针）接种前后灼烧的目的是什么？为什么在 接种前一定要将其冷却？如何判断灼烧过的接种环已 冷却？
法和步骤； ➢ 掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方
法。
培养基的种类
➢ 按成分不同分 天然培养基 合成培养基 半合成培养基
➢ 按培养基的物理状态分 固体培养基 半固体培养基 液体培养基
➢ 按培养基的用途分 基础培养基 营养培养基 鉴别培养基 选择培养基
培养基的配制方法和步骤
➢ 称量：按照配方正确称取各种原料置于搪瓷杯中； ➢ 溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解，补足水
（使样品中的微生物细胞充分分散，成单个细胞存 在），再取一定量的稀释液接种，使其均匀分布于培 养皿中特定的选择性培养基内，最后根据在平板上长 出的菌落数计算出每克或每毫升样品中的微生物数量。
实验器材 ➢ 土壤稀释液的三种不同培养基的培养平板 ➢ 菌种：大肠杆菌菌悬液 ➢ 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基 ➢ 仪器或其他用具：1mL无菌吸管，无菌平皿，盛有
灭菌
干热灭菌 ➢ 火焰灼烧法 ➢ 干热灭菌法（烘箱内热空气灭菌法） 湿热灭菌法 ➢ 加压蒸汽灭菌法 紫外线灭菌法 微孔滤膜过滤除菌
火焰灼烧法
直接在火焰上灼烧灭菌 主要用于实验室接种针(环)、试管口、三角瓶口和金属小 工具等的灭菌。
干热灭菌法
设备：电热烘箱 适用于耐高温器皿，160-170℃，维持2小时 注意事项：
土壤中微生物的分离
实验三土壤中微生物的稀释分离、纯化及无菌操作技术一、教学目标与基本要求：1、掌握倒平板的技术和分离纯化微生物的基本操作技术。
2、设计实验方案，分离目的菌，并通过后续实验做出初步鉴定。
二、实验内容：1．用稀释法从土壤中分离细菌、放线菌和霉菌。
2．用平板划线法分离纯化微生物。
3．学习斜宜接种、穿刺接种、平板接种、液体接种等接种方法。
三、实验步骤（一）微生物分离的方法有很多种，但常用的有两种：1.平板划线分离法借助划线使混杂的微生物在平板的表面分散开，二获得单个菌落，从而达到分离的目的，具体方法如下： 1)倒制平板：将固体培养基熔化，冷却至50-55℃，然后在酒精灯火焰旁，以右手持培养基，左手拿培养皿，以无菌操作将培养基注入培养皿内，约15ml，轻微转动培养基，使培养基均匀分布，然后静置于水平位置，凝固即成平板，并在皿该边贴上标签。
2.稀释平板分离法稀释手段，使样品分散到最低限度，然后吸取一定量注入平皿内，倒入培养基，摇匀静置凝固后培养，这样被分离的细菌被固定在原处而形成菌落，可作为一种记数方法。
1)制备土壤稀释液：（细菌的分离）以无菌操作，称取样品1g，加入装有99ml无菌水的锥形瓶中，振荡10-20分钟，使土样与水充分混合，即成10-2土壤稀释液，然后用无菌移液管吸取9ml无菌水的试管内，制成10-3的稀释液将此移液管在试管内反复吸冲三次，然后取出移液管，并将其通过火焰，再插入原来包移液管的纸套内，以备再用，振荡10-3 的稀释液试管，再从纸套取出原来的移液管插入已混匀的试管内，再吹洗三次，然后吸出1ml10-3的稀释液至另一支装有9ml 无菌水的试管中，制成10-4稀释液。
用同样方法再制成10-5、10-6的稀释液，稀释完毕后，可用原来的移液管，从菌液浓度最小的 10-6的稀释液开始吸取1ml10-6稀释液，加到相应编号10-6的无菌培养皿内，以相同方法分别吸取1ml10-5、10-4的稀释液加到相应编号为10-5、10-4的无菌培养皿内，整个分离过程见下图。
土壤中真菌纯化、分离和培养
三、仪器和材料
样品：新鲜土壤 培养基：加有2ml链霉素的PDA培养基。 无菌水：装有9mL无菌水的试管4支。 其它：无菌培养皿4皿、无菌吸管、酒精灯、培养箱等 。
四、真菌纯种分离的操作方法
1、土壤稀释液的制备 用“稀释平板计数法”中的方法
进行，将土样稀释至10－5。
将1瓶土壤菌液（称取土样10g放入盛90mL无菌水）和4 管9mL的无菌水排列好，按10-1、10-2、10-3、10-4及10-5依 次编号。在无菌操作条件下，用lmL无菌移液管吸取 lmL10-1浓度的菌液于一管9mL无菌水中，将移液管吹洗 三次，摇匀即为10-2浓度菌液。同样方法，依次稀释到10-5。
注意：在土壤稀释过程中，吸取不同梯度的菌液需换用 不同的吸管。
土壤稀释液的制备和稀释液的取样
2、分离方法 采用稀释平板分离法。又可分为两种
方法。
混菌法和涂抹法。Βιβλιοθήκη 混 菌 法涂 抹 法
3、培养
将上述接种土壤悬液的平板倒 置于28℃培养3-5d。
4、挑菌纯化 5、计数 6、菌种保存
将分离到的真菌转接到PDA斜面上培养，待长好后，置 于冰籍中保存，必要时进行深入研究。
土壤中 真菌分离、纯化和培养
一、目的要求
掌握从土壤中初步分离培养真菌的方法，从而获得真 菌纯培养技能；了解基本接种技术。
二、实验原理
土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现有重要应用 潜力的微生物的主要菌源。不同土样中各类微生物数量不 同，一般土壤中细菌数量最多；其次为放线菌和霉菌。本 次实验从土壤中分离真菌。
六、注意事项
1、混菌法接种时温度不能过高，应低于45℃， 如不用温度计，则以不烫脸、手为宜。
2、涂布法接种时一定要涂抹均匀，否则就会无 法记数。
土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化
土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化一、实验目的1. 学习、掌握从土壤稀释分离、划线分离各类微生物的技术。
2. 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。
3. 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。
4. 学习平板菌落计数法。
二、实验原理将待分离的样品进行一定的稀释，使微生物的细胞（或孢子）尽量呈分散状态，选用有针对性的培养基，在不同温度、通风等条件下培养，让其长成一个纯种单个菌落。
要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。
微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间见表2-1所示。
表2-1 微生物四大类菌的分离和培养要求样品来源分离对象分离方法稀释度培养基名称培养温度/℃培养时间/d土样细菌稀释分离10-5，10-6，10-7牛肉膏蛋白胨30～37 1～2土样放线菌稀释分离10-3，10-4，10-5高氏1号28 5～7 土样霉菌稀释分离10-2，10-3，10-4马丁氏琼脂28～30 3～5面肥或土样酵母菌稀释分离10-4，10-5，10-6马铃薯葡萄糖28～30 2～3细菌分离平板细菌单菌落划线分离10-2 牛肉膏蛋白胨30～37 1～2三、实验材料1. 菌源土样2. 培养基牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏培养基，高氏合成1号培养基，马铃薯葡萄糖培养基(制平板和斜面)，见附录Ⅲ。
3. 无菌水 250 mL锥形瓶，每瓶装99 mL无菌水(或95mL为分离霉菌用)，内装10粒玻璃珠。
4.5 mL无菌水试管(每人5～7支)。
4. 其他物品无菌培养皿，无菌移液管，无菌玻璃涂棒(刮刀)，称量纸，药勺，橡皮头，10%酚溶液。
（一）系列稀释平板法1. 取土样选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。
先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。
盛土的容器应是无菌的。
将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等杂物，装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。
霉菌的分离纯化和鉴定讲解
尽量存放在与采样环境相当的条件下至菌种分离；
植物和动物：
确保样品的完整性，迅速对植物切口进行消毒，并用石蜡封 住以防外来菌种入侵，用无菌装置带回；如动物粪便的采集应在动物 排便后马上收集其中间部分，避免外源污染，置于无菌袋内；
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二、样品的预处理
1、目的菌的富集培养
根据目的菌的生理特性，加入其所需要的营养物质及微量成分进 行诱导增殖，增菌；设计特定的有利于待分离菌株生长的环境。
⑴具体如下：
开发意图贯穿分离过程，使培养基“只”满足目的菌的要求，
而非目的菌不长；eg.寻找低温碱性脂肪酶产生菌
大剂量加入同类化合物；eg.酒精酵母
特殊成分；eg.维真生菌素抑、制氨剂基：酸放、线无菌机酮盐、等制霉菌素等；
抑制剂：
细菌抑制剂：青霉素、链霉素； 萘啶酸可抑制革兰氏阴性细菌；
3、目的菌的充分释放；
1、培养基设计原则；
初筛 2、分离方法介绍；
1、获得纯培养； 2、选择目的菌株；
复筛
3、培养条件； 1、霉菌简介；
形态学观察 2、菌落形态；
1、真菌的系统发育谱；
2、微生物快速鉴定技术； 生理生化实验
3、霉菌制片观察；
18SrRNA
分子生物学方法
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一、微生物资源的分布及样本的采集
土壤环境：
每年春季或旱雨季之交，一般在3-5月为佳；通常采集1040cm深处的土样；若要分离放线菌和真菌，土样应放到无菌牛皮纸袋 中，一般不放在瓶子或塑料袋中；如果要分离细菌，最好要保湿；
海洋环境及湿地：
0.5μm的滤膜过滤水样，以增加出菌率；Ekmann型采泥器或 重锤式取样器采集；样品装入无菌瓶内，不能密封，在3h内用于实验；
【精品】实验八 土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化95
五、实验报告
1、在你所制备的培养基的平板上长出的菌落分别属于哪个类群？简述它们的菌落形态特征。 2、在分区平板划线法中，为什么每次都需将接种环上剩物烧掉？ 3、为什么要把培养皿备。 2、培养基：牛肉膏蛋白胨培养基，高氏一号培养基，马丁氏培养基，豆芽汁葡萄糖培养基 3、无菌生理盐水。 4、其它物品 无菌培养皿、无菌移液管、无菌玻璃涂棒、称量纸、药勺、橡皮头、10％酚溶液。
四、实验步骤
1、制备土壤稀释液 2、涂布法进行分离 3、培养 4、菌落计数 5、划线分离
实验八 土壤中细菌、放线菌、 酵母菌及霉菌的分离与纯化
一、实验目的 1、熟悉从自然界中分离微生物的原理； 2、掌握细菌、放线菌、酵母菌、霉菌的分离纯化方法。
酵母菌及霉菌的分离与纯化 1、熟悉从自然界中分离微生物的原理； 1、在你所制备的培养基的平板上长出的菌落分别属于哪个类群？简述它们的菌落形态特征。 1、在你所制备的培养基的平板上长出的菌落分别属于哪个类群？简述它们的菌落形态特征。 1、熟悉从自然界中分离微生物的原理； 1、熟悉从自然界中分离微生物的原理； 2、在分区平板划线法中，为什么每次都需将接种环上剩物烧掉？ 2、掌握细菌、放线菌、酵母菌、霉菌的分离纯化方法。 3、为什么要把培养皿倒置培养？ 酵母菌及霉菌的分离与纯化 酵母菌及霉菌的分离与纯化 2、掌握细菌、放线菌、酵母菌、霉菌的分离纯化方法。 1、熟悉从自然界中分离微生物的原理； 2、在分区平板划线法中，为什么每次都需将接种环上剩物烧掉？ 2、掌握细菌、放线菌、酵母菌、霉菌的分离纯化方法。 2、在分区平板划线法中，为什么每次都需将接种环上剩物烧掉？ 微生物四大类菌的分离和培养 2、掌握细菌、放线菌、酵母菌、霉菌的分离纯化方法。 2、在分区平板划线法中，为什么每次都需将接种环上剩物烧掉？ 4、其它物品 无菌培养皿、无菌移液管、无菌玻璃涂棒、称量纸、药勺、橡皮头、10％酚溶液。
土壤微生物的分离和纯化实验报告
土壤微生物的分离和纯化实验报告
土壤微生物是土壤中最为丰富的生物群体之一，它们在土壤中扮演着重要的角色，如分解有机物质、固氮、矿物质转化等。
因此，对土壤微生物的研究具有重要的意义。
本文将介绍土壤微生物的分离和纯化实验。
一、实验目的
1.了解土壤微生物的分离和纯化方法；
2.掌握土壤微生物的培养技术；
3.观察土壤微生物的形态特征。
二、实验步骤
1.取一定量的土壤样品，加入适量的生理盐水中，摇匀后过滤；
2.将过滤液分别接种在不同的培养基上，如营养琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂等；
3.将培养皿放置在恒温培养箱中，控制温度、湿度等条件；
4.观察培养皿中的微生物生长情况，挑选单一菌落进行分离和纯化；
5.将单一菌落接种在新的培养基上，重复以上步骤，直至获得纯种菌株。
三、实验结果
经过培养和观察，我们成功地分离出了多种土壤微生物，如放线菌、链霉菌、芽孢杆菌等。
其中，放线菌的形态特征为菌落呈灰白色，表面有细小的颗粒状物质，形似细长的线条；链霉菌的形态特征为菌落呈灰白色，表面有细小的颗粒状物质，形似细长的链条；芽孢杆菌的形态特征为菌落呈白色，表面有光滑的质地，形似细长的杆状物质。
四、实验结论
通过本次实验，我们了解了土壤微生物的分离和纯化方法，掌握了土壤微生物的培养技术，观察了土壤微生物的形态特征。
这些都为我们深入研究土壤微生物的生态学、生理学、遗传学等方面提供了基础。
同时，我们也认识到了土壤微生物在土壤生态系统中的重要作用，应该加强对其研究和保护。
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Martin 培养基的配制
用量
1L
240ml
20g
4.8g
10g
2.4g
5g
1.2g
1g
0.24g
0,.5g
0.12g
100ml
24ml
900ml
216ml
——
——
115℃ 30min
0.03g
0.0072g
备注
待链霉素加入前，需将培养基冷却到 55℃~60℃，最终含量为 30ug/ml 5 移液管包装：6 支
6.加压蒸汽灭菌 操作者
温度
时间
备注
（二）．实验操作步骤 稀释涂布平板法. 1.倒平板，加入链霉素后，摇匀，趁热倒平板，凝固后，并做好标记，10-3,10-4,10-5,10-6,每梯 度 3 个平板。
2.制备土壤稀释液 待 90ml 无菌水降至室温，称取土样 10g，置入盛有 90ml 无菌水的三角瓶中，震荡，摇匀，
数
均
均
均
均
每克 样品 总菌 数
每克样真菌数： s
x
0.1 10
*10^
n
稀释度为 10-n 平均菌落数 X
2，通过菌落形态的观察辨别出霉菌，并在平板底做好标记
六.参考书目
[1] 周德庆 . 微生物学教程 . 3 版 . 北京: 高等教育出版社, 2013 [2] 熊元林 , 姚小飞 . 赵为 . 微生物实验 . 2 版 . 华中师范大学出版社, 2014 [3] 周德庆 , 徐德强 . 微生物实验教程 . 3 版 . 北京:高等教育出版社, 2013 [4] 李兴杰 . 微生物学 . 北京:高等教育出版社 , 2013 [5] 车振明 . 微生物学 . 北京:科学出版社 , 2011
种类
百分含量
数目(个/克)
细菌
70%~90%
2.5 亿
放线菌
5%~30%
70 万
霉菌
3%~20%
40 万
藻类
1%~2%
5万
原生动物
0.5%~1%
3万
真菌主要存在于土壤表面 10cm 处，在 30cm 处以下很难找到真菌，土壤中常见的真菌 主要是：半知菌，如曲霉，地霉，青霉，木霉
Martin 培养基，是一种适合真菌生长并含有抑制细菌和放线菌生长的链霉素和孟加拉亿 的培养基，能有效地选择土壤中少量存在的真菌，生长在马丁氏培养基的真菌，因大多数被 孟加拉红有一定程度上的抑制，故形成的菌落较少，这正好避免了某些气生菌丝生长旺盛的 霉菌迅速蔓延而造成的不利于霉菌的分离和计数的负面影响。
使土样与水充分混匀，将微生物分散，稀释度为 10-1。
3 梯度稀释 用一支 1ml 无菌吸管从三角瓶中吸取 1ml 土壤悬液加入盛有 9ml 无菌水的试管中充分混
匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取 1ml 加入到另一个盛有 9ml 无菌水的试管中并混匀均 匀，从此类推，制成 10-2，10-3,10-4,10-5,10-6 不同稀释度的土壤溶液。
实验用量（g)
2.无菌水的制备 90ml 的无菌水（三角瓶，带玻璃珠），9ml 试管灭菌水（试管）6 支
3 培养皿的包扎：6 个一组，12 个
4.Martin 培养基的配制
组分
琼脂粉 葡萄糖 蛋白胨 K2HPO4 MgSO4.7H2O 1/3000 孟加拉红
溶液 自来水 自然 pH 加压蒸汽灭菌 链霉素
12014108 B3 组 廖继林 26 蓝伟铭 28 张海峰 30 郭俊来 32 李诏然 34
陈纪廷 36
4 涂布 稀释度为 10-3,10-4,10-5,10-6 的四管土壤稀释液，没梯度取 0.1ml 置入对应标记的平板中，
涂布。
5 培养 将涂布后的平板倒置培养在恒温培养箱中，28℃
五．实验结果及处理
1.计算土壤中真菌数.
稀释 度
10-3
10-4
10-5
10-6
菌落 1 2 3 平 1 2 3 平 1 2 3 平 1 2 3 平
三.实验器材与用品
1.材料 土壤样品，Martin 培养基
2.用品 取样器，三角瓶。托盘天平。分析天平，烧杯，玻璃棒，平皿，试管，量筒，移液
管，洗耳球，报纸，棉线，加压蒸汽灭菌锅，消毒棉，镊子，涂布器，脱脂棉，试管架， 酒精灯，记号笔。
四．实验步骤
（一）.实验前的准备
1.取样
取样人
时间
地点
取样深度
用。 2.学习从自然界中分离霉菌的具体操作方法。
二.实验原理
从土壤中取样，采用马丁氏培养基对试样中的真菌进行富集，通过稀释涂布平板法，获 取有单个孢子繁殖而形成的菌落，通过形态观察，辨别出霉菌，从而使霉菌得到分离。
土壤是微生物的“天然”培养基，是丰富的菌种资源库。