过氧化物酶染色液(氧化WG-KI法) 使用说明

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过氧化物酶染色Washburn法-检验科临检室作业书

过氧化物酶染色Washburn法1.实验原理粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有过氧化物酶，pox能分解H2O2释放出新生氧，使四甲基联苯胺氧化成联苯胺蓝，后者与亚硝基铁氰化钠结合，再进一步氧化形成稳定的蓝色物质，沉淀于酶活性的细胞质内。

2.标本采集2.1病人准备：了解病人是否对局麻药有过敏史。

凝血因子严重缺陷引起的出血性疾病，穿刺部位有炎症或有畸形，晚期妊娠妇女作骨髓穿刺时要慎重。

2.2标本种类：新鲜抽取的骨髓穿刺液2.3标本采集要求2.3.1高压消毒的穿刺针，一次性无菌手套和抽取骨髓液的无菌注射器。

2.3.2临床上首选穿刺部位为髂后上棘；翻身困难，需多部位穿刺患者可选择髂前上棘为穿刺部分。

小于3岁的小儿还可选择胫骨头内侧为穿刺部位。

3.标本储存：室温避光处保存，若不能及时测定，可采用95％乙醇固定2分钟，可保存数天。

4.标本运输：室温运输5.标本拒收的标准：溶血、稀释标本不能作测定。

6.试剂6.1试剂名称：血细胞pox染色试剂6.2试剂生产厂家：上海太阳生物技术公司6.3试剂组成试剂1：poxⅠ液（紫红色）2℃-8℃避光保存，有效期六个月。

试剂2：poxⅡ液（无色）2℃-8℃避光保存，有效期六个月。

试剂3：95％乙醇，室温避光保存。

试剂4：瑞氏染液，室温避光保存。

7.操作步骤7.1新鲜涂片滴加Ⅰ液数滴（覆盖血膜为宜），室温放置1分钟，勿冲洗即滴加Ⅱ液数滴，混合后室温放置5分钟，流水冲洗。

7.2滴加95％乙醇脱色，水洗后瑞氏染色，复染后镜检观察结果。

8.结果判断8.1阳性—细胞内出现棕黄或蓝黑色颗粒沉淀物质，定位于胞质。

8.2阴性—细胞内无棕黄色或蓝黑色颗粒。

9.临床意义9.1粒细胞系统呈集中状粗颗粒强阳性反应，单核细胞系统呈弥散状颗粒弱阳性反应，部分原始单核细胞可呈阴性反应。

网状细胞及吞噬细胞有不同程度的阳性。

9.2淋巴细胞系、红细胞系、巨核细胞系、浆细胞系等均为阴性反应。

10.操作性能：快速简便，特异性强，灵敏度高。

GENMED 髓性过氧化酶活性染色试剂盒产品说明书(中文版)

GENMED SCIENTIFICS INC. U.S.A GMS80035.1.2 v.A GENMED髓性过氧化酶活性染色试剂盒产品说明书（中文版）主要用途GENMED髓性过氧化酶活性染色试剂是一种旨在使用对苯二胺作为指示剂，分析血液和骨髓细胞样本中过氧化酶表达，所呈现棕黑色沉淀现象的权威而经典的技术方法。

该技术由大师级科学家精心改良、成功实验证明的。

主要适用于血液和骨髓细胞的酶活性检测。

尤其可用于血液学研究和白细胞病理分型鉴定。

产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，灵敏牢固，显色清晰。

技术背景人体髓性过氧化酶（myeloperoxidase；MPO），又称粒细胞过氧化酶（leukocyte peroxidase），主要存在于人体中性颗粒细胞（neutrophil granulocyte）中嗜天青颗粒|（azurophilic granule）里和单核细胞（monocyte）的溶酶体里。

在白血病中，急性淋巴细胞性白血病（Acute Lymphoblastic Leukemia；ALL）的标志之一是髓性过氧化酶活性阴性，以此与急性骨髓性白血病（Acute Myelogenous Leukemia；AML）区别，尤其M3型的髓性过氧化酶活性100％阳性。

髓性过氧化酶活性染色方法包括联苯胺（benzidine）、二氨基联苯胺（diaminobenzidine）以及对苯二胺（p-phenylenediamine）等作为指示剂，但前二者为致癌剂。

对苯二胺与邻苯二酚，在髓性过氧化酶的催化下，发生氧化偶联反应，而产生不溶性棕黑色共聚物，用于检测髓性过氧化酶的活性。

其对苯二胺染色反应原理是：髓性过氧化酶p-phenylenediamine ＋ pyrocatechol ＋H2O2→棕黑色不溶性产物产品内容GENMED清理液（Reagent A）毫升GENMED固着液（Reagent B）毫升GENMED染色液（Reagent C）毫升GENMED反应液（Reagent D）微升产品说明书1份保存方式保存GENMED染色液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月用户自备苏木素复染试剂盒（GMS80067）：用于常规染色后复染1.5毫升离心管：用于配制染色工作液的容器小型染色缸：用于染色操作光学显微镜：用于细胞染色后观察分析实验步骤实验开始前，将试剂盒里的GENMED染色液（Reagent C）从－20℃的冰箱里取出，置入冰槽里等待溶化，并避光。

医院检验中心过氧化物酶染色操作规程

医院检验中心过氧化物酶(POX)染色操作规程[原理]粒细胞和单核细胞脑浆内含过氧化物酶，能借助受体(联苯胺)脱氢催化过氧化氢而释放新生氧。

受体被氧化成联苯胺蓝。

再与亚硝基铁氰化钠结合成稳定的蓝色颗粒而沉淀于脑浆内。

[试剂]1．联苯胺溶液：联苯胺0．38，加36％亚硝基铁氰化钠溶液1ml，再取95％乙醇加到100ml，水浴加热助溶。

贮于棕色瓶中，可保存数月。

工作时应小心溶液污染皮肤。

2.稀双氧水：临用前将30％双氧水用蒸馏水1：80稀释。

[操作](1)新鲜干燥血片或骨髓片，加联苯胺液5—8滴，使布满整张涂片，固定1—2分钟。

(2)加等量稀双氧水，用吸球吹吸，使两液混匀，作用4—8分钟。

(3)涂片用流水冲洗。

待干后再用瑞氏染液复染，复染时间约30分钟。

[结果观察]可报告阳性程度或阳性细胞％。

阴性：无蓝色颗粒和蓝色物质。

弱阳性：蓝色颗粒量少且细小，相当于(十)。

阳性：‘蓝色颗粒量多，粗细不一。

相当于(++)。

强阳性：细胞充满粗大紧密蓝色颗粒。

相当于(+++）。

[临床意义](1)粒系统细胞除早期原粒细胞阴性外，晚期原粒细胞及以下各阶段细胞均含有不同程度的蓝色颗粒。

嗜酸性粒细胞颗粒更粗大，呈深蓝色。

嗜碱性细胞为阴性。

(2)单核细胞中，除早期原始阶段外，皆呈弱阳性反应，其颗粒细小稀疏。

(3)某些网状细胞及吞噬细胞可呈不同程度的过氧化物酶阳性反应。

(4)所有淋巴细胞过氧化物酶染色皆为阴性。

(5)该化学染色是区别急性淋巴细胞性白血病和急性非淋巴细胞性白血病的关键化学染色。

FAB分型规定前者阳性率＜3％。

[附注](1)联苯胺溶液若明显变色发绿，应重新配制。

(2)亚硝基铁氰化钠溶液也可在临用前取0．368溶解于1ml蒸馏水中，加热助溶后应用。

(3)双氧水浓度若过高，则有抑制酶作用。

双氧水浓度太高、制片太厚、涂片冲洗不净以及粒细胞破坏过多，可造成假阳性。

涂片中粒细胞若看不见阳性颗粒，红细胞呈棕色或绿色，即示双氧水过浓。

氧化亚甲蓝-碘化钾法髓过氧化物酶快速染色及应用

氧化亚甲蓝-碘化钾法髓过氧化物酶快速染色及应用陈万新;樊丽华;胡间石;刘军【期刊名称】《临床血液学杂志》【年(卷),期】2006(19)2【摘要】目的:介绍一种安全稳定、快速可靠的髓过氧化物酶(MPO)染色新方法(氧化MB-KI法)。

方法:采用亚甲蓝(Methylene blue)为显色剂取代Pereira原法中的Leishman's染料,并采用人工预先氧化亚甲蓝溶液的新方法,使其一步到位达到最佳氧化成熟程度,以后每次配制MPO染色工作液时不必加H2O2。

结果:本法(氧化MB-KI法)MPO阳性产物呈棕黑色颗粒状,细胞核为蓝绿色。

与Washburn联苯胺法比较,两者阳性率十分相近,差异无显著性意义(P>0.05)。

结论:氧化MB-KI 法所显示的MPO阳性反应对比鲜明、易于判断,避免了假阴性结果的发生。

试剂安全、稳定可靠、易于配制、操作简单、染色时间短,是理想的MPO染色方法。

【总页数】3页(P107-109)【关键词】髓过氧化物酶类;细胞化学;碘化钾;亚甲蓝【作者】陈万新;樊丽华;胡间石;刘军【作者单位】华中科技大学同济医学院附属协和医院血液病研究所【正文语种】中文【中图分类】Q55【相关文献】1.氧化Wright-Giemsa-碘化钾法髓过氧化物酶快速染色及应用 [J], 陈万新;丁飞;李毅;刘军;樊丽华2.血细胞髓过氧化物酶染色--吡啰红G-过氧化氢-碘化钾法及其应用 [J], 陈万新;吴健民3.吡啰红B-过氧化氢-碘化钾法髓过氧化物酶快速染色及应用 [J], 陈万新;吴健民4.4种碘化钾-过氧化氢法髓过氧化物酶染色结果比较 [J], 陈万新;朱红琳;薛梅;官阳5.氧化吡啰红G-碘化钾法在血细胞髓过氧化物酶快速染色中的应用 [J], 陈万新;吴健民因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

过氧化物酶染色标准操作程序

过氧化物酶染色标准操作程序1.检验目的通过对血细胞内过氧化物酶的染色测定，可用于白血病细胞的鉴别与分型。

2.检测原理血细胞内过氧化物酶（POX）能将无色的二氨基联苯胺的氢原子转移给过氧化氢，使前者变为有色染料沉积在细胞质酶所在部位。

1.标本新鲜的骨髓细胞涂片及血液细胞涂片。

2.试剂联苯胺液(A液)、H2O2(B液) 、瑞姬氏染液(C液) 、磷酸盐缓冲液(D液) 3.环境和安全5.1环境温度要求：2~8℃保存,有效期12个月。

5.2安全控制：工作中所有与病人的样本接触或有潜在性接触可能的样本都视为污染物。

在操作时有必要穿戴保护性的工作服、外套和手套。

在处理废弃样本时不可触摸废弃物，一定戴手套和护目镜以避免直接接触。

如果操作人员不小心接触血液、试剂、废弃物/皮肤或衣物上沾到了样本、试剂及废液，用大量清水冲洗并适当考虑必要的医疗措施。

4.操作步骤6.1新鲜的涂片滴加A染色液数滴(以覆盖涂片为宜),再滴加B染色液数滴(A 液:B液=1:1),混合后室温染色5~10分钟,流水冲洗2分钟，待干。

6.2然后用瑞姬氏染色(C液)与磷酸盐缓冲液(D液)1:2比例混合，对其染色3~5分钟,流水冲洗,干后镜检。

7.检验结果解释阴性------胞质内无沉淀物（无色）阳性------胞质内出现棕黄或蓝黑色沉淀物8.实验室临床解释8.1粒细胞系统呈集中状颗粒强阳性反应，单核细胞系统呈弥散状颗粒弱阳性反应，部分原始单核细胞可呈阴性反应。

8.2淋巴细胞系、红细胞系、巨核细胞系、浆细胞系等均为阴性反应。

8.3在白血病细胞的鉴别与分型中的应用：强阳性提示：FAB中的M1，M2，M3；部分强阳性与弥散状弱阳性提示：FAB中的M4；弥散状弱阳性提示：FAB中的M5；阴性提示：FAB中的M0，M5，M6，M7，ALL等。

9.变异潜在来源若样本采集后不能及时测定，可采用95%乙醇固定2分钟后，可保存数天。

宜可使用某些抗凝血（肝素、EDTA），样本在未染色前切勿沾有甲醇和氧化剂类试剂，以免细胞内的过氧化物酶被抑制或破坏。

过氧化物酶显色

过氧化物酶显色
过氧化物酶显色是一种常见的生物学实验技术，它利用过氧化物酶催
化底物产生颜色反应，从而实现对样品中过氧化物酶活性的定量分析。

下面，我将从原理、实验步骤、应用等方面介绍这种技术。

一、原理
过氧化物酶显色技术的主要原理是利用底物发生氧化还原反应，从而
产生可见光吸收，实现对过氧化物酶活性的定量分析。

过氧化物酶催
化底物如TMB（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine）在存在过氧化氢（H2O2）的情况下，底物发生氧化反应，生成过氧化物，过氧化物再将底物氧化产生高分子产物，在酸性环境中产生深蓝色或棕色沉淀，
可通过比色法分析结果。

二、实验步骤
1. 准备样品：将待测样品加入显色液中，显色液的具体组成根据样品
的性质而定。

注意：样品中不要含有过氧化氢，否则会干扰结果。

2. 添加底物：加入TMB底物。

3. 加入过氧化氢：加入H2O2。

4. 活化催化剂：等待5-10分钟，让催化剂活化。

5. 加入停止液：加入酸性停止液，停止反应。

6. 分析结果：通过分析样品颜色深浅或光密度值，计算出样品中过氧化物酶的活性。

三、应用
过氧化物酶显色技术被广泛应用于各种生物学、医学领域中。

例如，利用过氧化物酶显色技术可以进行酶动力学研究、检测样品中过氧化物酶的活性、检测生物体内一氧化氮的浓度等。

此外，它还可以应用于药物筛选、抗氧化剂研究等。

总之，过氧化物酶显色技术具有操作简单、灵敏度高、准确性好等优点，是一种常用的生物学实验技术。

它的应用领域广泛，对于生物学和医学领域的研究和工作有着重要的意义。

过氧化物酶(微量法)试剂盒使用说明

过氧化物酶（微量法）试剂盒使用说明货号:BC0095规格:100T/96S产品内容：提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存；试剂一：液体20mL×1瓶，4℃保存；试剂二：液体×1瓶，4℃保存；用时每瓶加入3mL 试剂一，充分溶解待用；用不完的试剂4℃保存一周。

试剂三：液体3mL×1瓶，4℃保存。

产品简介：POD（EC 1.11.1.7）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。

POD 催化H 2O 2氧化特定底物，在470nm 有特征光吸收。

试验中所需的仪器和试剂：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水操作步骤：一、粗酶液提取：1、细菌、细胞或组织样品的制备收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3秒，间隔10秒。

重复30次）；8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。

称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液进行冰浴匀浆。

8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

二、POD 测定操作表1、分光光度计或酶标仪预热30min 以上，调节波长至470nm，蒸馏水调零。

2、测定前将试剂一、二和三在37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）放置10min 以上。

3、样本测定表试剂名称测定孔（μL）样本10蒸馏水60试剂一120试剂二30试剂三30在微量石英比色皿或96孔板中按顺序加入上述试剂，立即混匀并计时，记录470nm下30s时的吸光值A1和1min30s后的吸光值A2。

计算ΔA=A2-A1。

注意：若一次性测定样本较多，可将试剂一、二、三和蒸馏水按比例配成混合液，在37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）放置10min以上，测定时加入240μL混合液和10μL样本测定。

【医学课件】细胞化学染色检验

实验九：细胞化学染色检验（一）三、碱性磷酸酶染色（NAP）
3. 方法步骤： 1) 新鲜干燥的涂片用冷10%甲醛甲醇固定液固定30s，流水轻轻冲
洗30～60s，待干。 2) 把涂片浸入基质孵育液中，在室温(冬季放水浴箱)下温育10～
15min。 3) 流水冲洗1 ～ 2min，加苏木素染色液中复染5～8min，流水冲
1.目的掌握骨髓铁染色(bone marrow iron stain)的原理、方
法、注意事项及临床意义。
2. 原理骨髓小粒中的含铁血黄素称细胞外铁，其所含的三价铁
经稀盐酸处理后而游离，并能与酸性亚铁氰化钾溶液发生普鲁士蓝反应，生成蓝色亚铁氰化铁沉淀，定位于含铁的部位。细胞内铁也可用此法显示，根据反应的强弱可了解骨髓中铁的含量。
实验十：细胞化学染色检验（二）一、铁染色（Iron stain）
3.方法步骤 1) 干燥涂片用甲醇固定10min，待干。 2) 玻片上滴满酸性亚铁氰化钾，37℃染色30min。 3) 用蒸馏水冲洗后用核固红染液复染10～15min。 4) 流水冲洗，待干，镜检。 5) 结果判断 (1) 幼红细胞核呈鲜红色，胞质呈淡黄红色，铁粒呈蓝绿色。 (2) 细胞外铁用低倍镜观察涂片，特别是涂片尾部和髓粒附
实验九：细胞化学染色检验（一）一、过氧化物酶染色（POX)
5. 临床意义
6.
POX染色是鉴别急性粒细胞白血病(acute
myeloblastic leukemia, AML)、急性单核细胞白血
病(acute monocytic leukemia, AMOL)、急性淋巴
细胞白血病(acute lymphocytic leukemia, ALL)的
重要细胞化学染色方法。AML时白血病细胞可呈阳性

花粉活力染色液(过氧化物酶法)

花粉活力染色液(过氧化物酶法)简介：花粉活力的大小直接影响授粉、受精过程，与植物的产量密切相关，通过花粉活力的测定，可了解花粉的可育行，并掌握不育花粉的形态、生理特征。

花粉中含有过氧化物酶，活力高的花粉过氧化物酶活性也高。

过氧化物酶与氧化剂(如过氧化氢等)形成一种复合物，这种复合物中的过氧化氢被活化，从而能氧化酚类化合物，根据颜色变化可判断花粉的活力。

该染色液仅用于科研领域，不用于临床诊断或治疗。

组成：操作步骤(仅供参考)：1、配制氧化剂工作液：取适量的氧化剂，按氧化剂：蒸馏水的比例混合，即得氧化剂工作液。

室温保存，1个月有效。

注意：氧化剂有腐蚀性，小心操作。

2、取成熟将要开放的新鲜花朵，小心去除花瓣和雌蕊。

3、将花粉物质置于干净的载玻片上，分别滴加芳香胺显色液、氧化剂工作液各1滴，混匀，盖上盖玻片。

4、30℃恒温箱孵育。

5、低倍显微镜下观察，每片取5个视野。

染色结果：活力强紫红色活力弱淡红色无活力或不育无色计算：观察统计100粒花粉，计算有活力花粉的百分数。

其公式为：花粉活力百分数(%)=有活力花粉数/100×100%考前须知：编号名称 DP0108 Storage 试剂(A): 芳香胺显色液 30ml 4℃ 避光试剂(B): 氧化剂 2×1ml RT 使用说明书 1份1、染完色后，应立即显微镜下观察。

2、氧化剂有腐蚀性，小心操作，防止氧化剂挥发，否那么染色力会下降。

3、染色时需要将花粉完全浸没于染色液中。

4、为了您的平安和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期：12个月有效。

相关：编号名称DC0032 Masson三色染色液DF0135 多聚甲醛溶液(4% PFA)TC1169 尿尿素(Urea)检测试剂盒(脲酶波氏比色法)。

过氧化物酶染色作业指导书

过氧化物酶染色作业指导书一、原理血细胞内的过氧化物酶分解H2O2，释出初生态氧，使无色联苯胺氧化成蓝色联苯胺，后进一步变成棕黑色化合物，沉着于胞浆内。

二、试剂1、联苯胺染液：联苯胺0.3g ，碱性品红0.3g ，95%乙醇100ml待完全溶解后与亚硝基铁氰化钠饱和水溶液（0.121mol/L）1ml混匀后，置棕色瓶内可室温保存8-10个月。

2、过氧化氢溶液：3%过氧化氢溶液0.3ml ，蒸馏水25ml 此液临用前新鲜配制3、脱色液：95%乙醇4、复染液：瑞氏染液三、操作步骤1、用常法制备骨髓（血）涂片，待干。

2、在新鲜涂片上滴加联苯胺溶液数滴，以覆盖骨髓（血）膜为适，染1min。

3、滴加等量新鲜配制的过氧化氢溶液，轻轻摇动玻片或用洗耳球轻吹液面，使之混匀染色4-5分钟。

4、用流水冲洗1分钟左右。

5、用95%乙醇脱色，脱至红色退尽为止，水洗，待干。

6、用瑞氏染液复染15-20分钟。

7、水洗，待干，镜检。

四、临床意义1、急性粒细胞白血病时，白血病性原始粒细胞可呈阳性反应，阳性颗粒一般较多较粗大，常呈局限性分布；急性淋巴细胞性白血病时，原始淋巴细胞和幼淋巴细胞均呈阴性反应；急性单核细胞白血病时，白血病性原始单核细胞呈阴性反应，有时虽有少数可呈弱阳性反应，但阳性颗粒少而细小，常弥散分布。

2、小型原始粒细胞和原始淋巴细胞不易区别，如果小型原始细胞呈过氧化物酶阳性反应，可确定为小型原始粒细胞。

3、急性早幼粒细胞白血病有时须与急性单核细胞白血病鉴别，如果白血病细胞呈过氧化物酶强阳性反应，应确定为急性早幼粒细胞白血病。

4、成熟中性粒细胞过氧化物酶活性的变化：（1）、活性增高：可见于再生障碍性贫血、感染（特别是化脓菌感染）、急性淋巴细胞性白血病和慢性淋巴细胞性白血病。

（2）、活性减低：可见于急性粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性单核细胞白血病、骨髓增生异常综合症、放射病及退化性中性粒细胞。

苏丹黑B（Sudan black B，SB）是一种脂溶性染剂，可溶解于细胞浆内的含脂结构中，使胞质中的脂类物质呈棕黑色或深黑色颗粒。

过氧化物酶染色的原理

过氧化物酶染色的原理
过氧化物酶染色原理是利用过氧化物酶作为反应媒介，在生物样本中特异性地检测目标分子。

过氧化物酶是一种催化剂，能够将底物氧化成有色产物。

具体实验步骤为：首先将待测样本固定在载玻片上，然后加入特异性的一抗，使其与目标分子结合。

接着，加入经过改性的二抗，该二抗上结合有过氧化物酶。

此时，如果目标分子存在于样本中，二抗就会与一抗结合，并把过氧化物酶带到固定的位置。

接下来，加入过氧化物酶底物，其比如碘化四氢-3,3,5,5-四甲基-2,2-联吡啶（DAB），底物会被过氧化物酶催化氧化，形成棕色的有色产物。

该产物会沉积在固定的位置，显示出目标分子所在的位置。

最后，在显微镜下观察载玻片，可以根据有色棕色沉积物的形成位置确定目标分子的存在与否。

过氧化物酶染色技术广泛应用于免疫组化、组织学研究和病理诊断领域。

免疫组化染色操作步骤

免疫组织化学染色原理和操作步骤一、免疫组织化学原理免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。

免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。

间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。

PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP复合物孵育标本，最后用H2O2和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。

生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。

亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。

ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。

在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。

ABC法的敏感性较PAP法更高。

图1. 免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》）SP法与ABC法相似，其不同于ABC法之处在于用生物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。

在标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧化物酶使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。

与亲和素相比，链酶亲和素的结合力与亲和素相图2. SP法原理示意图似而非特异性结合较亲和素低。

过氧化物酶(POD)试剂盒说明书

过氧化物酶(POD)试剂盒说明书一、测定原理：利用过氧化物酶(POD)催化过氧化氢反应的原理，通过测定420nm 处吸光度的变化得出其酶活性。

二、实际的组成和配置试剂一：液体60ml×4瓶，4℃保存6个月试剂二：粉剂×3瓶，4℃保存6个月试剂二应用液的配置：临用每瓶粉剂加入10ml 的双蒸水溶解，4℃避光保存试剂三：液体5ml×1瓶，4℃保存6个月试剂三应用液的配制：临用前用双蒸水15倍稀释，使得1cm 光径，双蒸水调零时A240保持在0.4左右，现用现配。

若A 值太高，则加双蒸水稀释，若A 值太低，则加入适量试剂三。

（一般在25倍左右稀释）试剂四：液体50ml×2瓶，4℃保存6个月。

三、操作步骤：1、前处理：植物组织匀浆的制备：准确称取组织重量，按照重量(g):体积(ml)=1:9的比列加入9倍体积的匀浆介质(推荐使用生理盐水或磷酸盐缓冲液:0.1 mol/L pH 7-7.4)，冰水浴条件下制备成10%的组织匀浆液，3500r/min 离心10min ，取上清液进行测定。

混匀后，3500r/min 离心10min ，取上清于波长420nm 处，1cm 光径，双蒸水调零，测定各管吸光度值。

四、计算及举例1、定义：在37℃条件下，每毫克组织蛋白每分钟催化1ug 底物的酶量定义为一个酶活力单位。

2、植物组织中过氧化物酶(POD)活力计算公式：10)/()min 30()()()1(12-)/(⨯÷÷⨯⨯=ml mgprot ml ml cm OD OD mgprot U POD 匀浆蛋白浓度反应时间样本量反应液总体积比色光经值对照值测定活力 3.计算举例取新鲜桑叶，制备成10%匀浆，取100ul 匀浆上清，按照操作表进行操作，测得数据如下：对照OD 0.237；测定OD 0.665；同时测得10%桑叶匀浆蛋白浓度是1.80mgprot/ml 根据公式计算如下:mgprotU ml mgprot ml ml cm OD OD mgprot U POD / 26.42010001.80300.14.01120.237-0.6651000)/()min 30()()()1(12-)/(=⨯÷÷⨯⨯=⨯÷÷⨯⨯=匀浆蛋白浓度反应时间样本量反应液总体积比色光经值对照值测定活力。

过氧化物酶染色法

项目名称：碱性磷酸酶染色法检验标本：外周血涂片收费标准： 50元检验方法：细胞化学染色原理：在PH9.5时，底物被白细胞的酶水解，释出磷酸根和芳香萘胺，后者与偶氮盐偶合，形成有色沉淀。

试剂：1.固定液（保存于4℃）冰箱2. 0.05缓冲液（PH9.4~9.6）保存于4℃冰箱3.底物4.二甲基甲酰胺5.固紫B操作步骤：1.血片或髓片放置4C固定液中30秒，流水冲洗，空气晾干2.工作液：（1）用二甲基甲酰胺溶解底物后，倒入缓冲液中（2）再加入固紫B混匀3.把固定后的玻璃片放入工作液中，置37C水温箱45分钟4.流水冲洗5.苏木精复染6.流水洗，晾干7.直接油镜观片结果：酶活动处呈亮红颗粒正常参考值：积分10～100分/100个中性分叶核细胞意义：NAP活性增高见于细菌性感染、类白反应、再障、某些肿瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病急性变等。

NAP活性减低见于慢性粒细胞白血病、急性粒细胞白血病、绿色瘤、红白血病、PNH、病毒感染等。

注意事项：1.外周血涂片标本需新鲜，收到标本后需立即用专用固定液固定。

2.试剂需防在4℃冰箱内，临用前拿出，试剂打开后需立即应用，最长不得超过30min。

项目名称：过氧化物酶染色法检验标本：骨髓涂片收费标准：50元检验方法：细胞化学染色检验原理：过氧化物酶在细胞内的颗粒从H2O2中释放出氧，氧化联苯胺，引起在过氧化酶活性处，沉积棕黑色的化合物。

试剂：1.0.3%联苯胺酒精溶液2.H2O2溶液（3%H2O2+蒸馏水5ml）操作步骤：1.骨髓涂片加0.3%联苯胺酒精溶液10-15滴2.一分钟后，加H2O2溶液10-15滴3.五分钟后，流水冲洗4.再用瑞氏染液复染5.水洗，晒干结果：酶活力处呈棕黑色。

意义：急性白血病中可借过氧化物酶染色区蓓别急淋与急非淋。

急淋POX呈阴性反应，FAB分型规定阳性率＜3%。

急非淋呈阳性反应，阳性率≥3%。

注意事项：1.骨髓涂片标本需新鲜，收到标本后需立即染色。

临床血液学检验：实验四过氧化物酶染色(POX)

涂片滴加A液3滴固定60秒（DW冲洗，待干）
滴加B液（高碘酸）3滴氧化10 min， DW冲洗，待干
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操作步骤
滴加C液（雪夫染液） 3滴氧化15 min， DW冲洗待干
滴加D液（甲绿） 3滴复染5分钟
DW冲洗待干
镜检
结果
阳性反应：胞质内染红色或紫红色，呈弥散状、颗粒或块状。胞核染成绿色。
滴加D液（甲绿） 3滴复染5分钟
滴加C液3滴，D液6滴混匀
5分钟
甩干，镜检
DW冲洗待干镜检
CLL
ALL
ALL
ALL中粗粗粒散在分布
A:红白血病
B:巨幼贫
M6 PAS 染色
•
POX
新鲜涂片
PAS
涂片滴加A液3滴固定60秒（DW冲洗，待干）
滴加A液3滴（覆盖标本即可）滴加B液（高碘酸） 3滴氧化10 min， DW冲洗，待干然后
滴加等量B液3滴,吹匀 10分钟
水洗，甩干
滴加C液（雪夫染液） 3滴氧化15 min， DW冲洗待干
• 结果判断（100×）
胞浆中出现红棕色至蓝黑色颗粒为阳性反应
• （—）无颗粒沉着 • （弱+）颗粒细小，分布稀疏 • （+）颗粒较粗常呈局灶性分布 • （++）颗粒粗大分布较密占胞浆1/2~2/3 • （+++）颗粒粗大，呈团块状分布 • （++++）颗粒布满细胞，可覆盖胞核
• 正常参考值
• 正常人淋巴细胞、红细胞、巨核细胞、成熟嗜碱性粒细胞，均无POX；
• 粒细胞系统：早幼粒以下阶段细胞均为阳性，且逐渐加强，嗜酸粒细胞阳性最强

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碱性磷酸酶(NAP)偶氮偶联法试剂:1．10％固定液:甲醛 10ml 甲醇氨基-2 甲基-1.3 丙二醇 (2.625gH2O500ml) 3．基质液:α-磷酸萘酚钠 35mg，溶于 0.05M 缓冲液 35ml，再加入重氮盐固牢兰 B 或 RR35mg 溶解 4．苏木紫染液
(+++)浆暗红少量颗粒 (++++)浆紫红颗粒密淋系:(-)浆无色 (±)浆呈淡红色无颗粒 (＋)浆呈淡红细颗粒(<10 个) (++)浆红弥漫 (+++)浆内有较粗颗粒或少数大块红色物质 (++++)有较多粗颗粒，并有大块红色物质红系:(-)M6、MDS 可阳性巨系、血小板均(＋) 单系、浆、网状细胞均(-) a.PAS 缸（过碘酸 0.5g+1/5M 醋酸钠 5ml+H2O 45ml） ↓ 暗处 10 min ↓ 水洗待干 b.试管（10 ml 的雪夫氏液） ↓ 玻片插入 ↓ 暗处 37℃*45min ↓ 水洗待干 ↓ 苏木紫*1min
结果判断:阳性-胞浆内有兰色颗粒标准 (一）无颗粒（±）颗粒细小而分布松（＋）颗粒粗，局灶（++）颗粒粗大，分布密（+++）颗粒粗大，呈团（++++）颗粒分布整个细胞注意:计数 100 只原始细胞，单、早幼粒不计在内
糖原染色（PAS）试剂: 1．固定液--甲醇或 95%乙醇 2．过碘酸溶液: 过碘酸 0.5g 1/5M 醋酸钠 5ml 蒸馏水 45ml 3．雪夫氏液:将 200ml 蒸馏水煮沸，缓缓加入碱性品红（碱性复红，指示剂）1.0g，待冷却至 50℃(60℃)时加入 1NHCL20ml,待冷却至 25℃(20℃)时加入 2g 偏重亚硫酸钠，立即加盖使溶解，放暗处(冰箱)过夜，取出时呈淡黄或淡红色，次日加活性碳 1g(300mg 起吸附作用)，摇匀后过滤即可，置冰箱保存。 4．偏重亚硫酸钠溶液的配制(含 SO2 的溶液):取 10%亚硫酸氢钠 5ml 加 1NHCL5ml,加 H2O 至 100ml(临用前配) 5．苏木紫液或甲基绿操作:1．涂片用甲醇固定 5 分钟，水洗 2．放入溶液中氧化 10 分钟(暗处)，水洗待干 3．置雪夫氏液内染 45 分钟(暗处)，冬天 37℃ 4．用水冲洗 5．水洗待干(苏木紫 1 分钟) 结果:阳性-胞浆内呈红色颗粒或块状粒系:(-)无色 (±)浆呈粉红色无颗粒 (＋)浆呈淡红细颗粒 (++)浆红少颗粒

过氧化物酶染色原理及临床意义

过氧化物酶染色原理及临床意义
过氧化物酶染色是一种常用的组织学技术，它通过对组织切片进行染色，使细胞内的过氧化物酶活性显现出颜色，从而能够观察到细胞的代谢活动和细胞内酶的分布情况。

过氧化物酶是一类广泛存在于细胞中的酶，它在细胞内起着重要的调控作用。

通过过氧化物酶染色，我们可以观察到细胞内过氧化物酶的分布情况，从而了解细胞的代谢活动和细胞内环境的变化。

过氧化物酶染色的原理是利用过氧化物酶对底物的催化作用，使底物在染色剂的作用下形成有色产物。

常用的过氧化物酶染色方法有DAB（3,3'-二氨基联苯基），这是一种常用的染色剂，它能够与过氧化物酶催化生成的氢氧化物反应，形成可见的棕色沉淀物，从而使细胞的过氧化物酶活性显现出颜色。

过氧化物酶染色在临床上有着广泛的应用。

首先，在病理学领域，过氧化物酶染色可以用来观察肿瘤细胞中过氧化物酶的分布情况，从而了解肿瘤细胞的代谢活动和增殖能力。

此外，过氧化物酶染色还可以用于观察炎症细胞、免疫细胞等的过氧化物酶的活性，以辅助诊断炎症性疾病。

除了在病理学领域，过氧化物酶染色还在神经科学研究中起着重要的作用。

通过观察过氧化物酶在神经元中的分布情况，可以了解神经元的功能状态和代谢活动，从而研究神经系统的疾病和功能异常。

过氧化物酶染色是一种重要的组织学技术，通过观察细胞内过氧化物酶的分布情况，可以了解细胞的代谢活动和环境变化。

在病理学和神经科学研究中，过氧化物酶染色有着广泛的应用，可以帮助我们更好地理解疾病的发生机制和神经系统的功能异常。

过氧化物酶检测标准操作规程

过氧化物酶（pox）检测标准操作规程1.【目的】为了供骨髓涂片及血液细胞涂片染色检查。

2.【职责】1.实验室工作人员均应熟知并严格遵守本SOP，室负责人监督落实。

2.本SOP的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：室负责人、科主任。

3.【标本类型及实验前准备】1.标本类型1.要求新鲜的骨髓细胞涂片或血液细胞涂片。

2.若样本采集后不能及时测定，可采用95%乙醇固定2分钟后，可保存数天。

亦可使用某些抗凝血（肝素、EDTA）。

3.样本在未染色前切勿沾有甲醇和氧化剂类试剂，以免细胞内的过氧化物被抑制和破坏。

4.溶血样本不宜使用，因涂片中大量游离血红蛋白易使背景产生难以去除的杂质颗粒。

2.患者准备成人一般取骼后、骼前上棘，其次为胸骨、棘突部位。

2岁以下小儿可穿刺胫骨。

3.容器、添加剂类型骨髓液量不宜过多，不需抗凝，迅速置于载玻片上，必要时可用EDTA2K抗凝。

4仪器设备捷达骨髓成像系统，OLYMPUS显微镜5.实验试剂1.快速染液A （ A液）：曙红2.快速染液B （ B液）：天青3.碘化钾溶液（C液）：碘化钾4.WG溶液（D液）：瑞姬氏染料4.【测定原理】细胞中的过氧化物酶分解过氧化物产生新生态氧，后者与KI （碘化钾）作用产生碘，碘与WG等显色剂中的有效成分结合，形成有色颗粒定位于细胞浆中。

5.【程序性操作步骤】本法采用滴染法，滴染工作液配制（1份滴染工作液为2.4ml）使用器材：一次性塑料试管、微量移量液器、一次性吸嘴、滴管。

操作：取C液2.0ml，D液4ul，混匀，2小时内使用。

染色步骤：1.快速染色（核染色）：干燥的骨髓涂片滴加A液（覆盖标本）后，再滴加B液（A液：B液=1:1至1:2）混匀，染色20-30秒，流水冲洗，甩干或滤纸吸干；2.滴加工作液于涂片上，染色40-60秒后倾去（不用水冲洗），滤纸吸干，镜检。

6.【结果计算与判断】呈阳性反应时，可见胞浆中有红棕色至蓝黑色颗粒。