圆二色谱仪操作规程培训ppt课件
圆二色谱仪使用
圆二色谱仪使用手册实验前请先阅读第一部分注意事项2011年4月6日整编河北大学理化中心目录一、注意事项二、光源的选择三、MOS 450波长的校正四、电压的调节五、MOS-450 圆二色光谱扫描操作规程六、MOS 450-SFM 300动力学操作方法一、注意事项1、滴定及变温实验时，需要磁子搅拌。
实验结束时首先拔掉搅拌电源。
在样品池内无磁子的情况下搅拌器空转会烧毁控温元件。
2、光源(也就是氙灯或汞氙灯)不可频繁开关。
举例而言，如果马上不用仪器，但半个小时后需要使用仪器，就不要为了节约光源寿命而将光源关闭。
短时间内频繁开关光源反而会缩短光源寿命。
3、光电倍增管移动时(比如从圆二色模式换为荧光模式)，注意用软件将Hv （高压）关闭。
4、扫描速度在0.5-5s/nm。
使用手册上写的扫描速度有误，特别注意不要低于0.5秒/nm,过快的扫描速度易造成calibration移位。
5、如需用到emission单色器，就是那个需要用光纤连接的单色器，扫描速度要大于1s/nm,连0.5s/nm都不能用。
6、PMT的HV不要超过1000V.7、使用控温附件进行变温实验时，一定要将地上的那个水浴恒温槽打开，水槽温度设为20度以下即可。
8、TCU上设置为remote; Power supply设置为ARC.9、仪器运行过程中，更换样品时，shutter最好关闭。
二、光源的选择1、电源：图1中的Lamp power supply处有Xe（红色）、Xe(Hg)（红色）、零线（黑色）三个插孔。
零线插头为黑色，直接插到黑色的零线插孔中。
火线插头为红色，在做圆二色、紫外、荧光的光谱扫描时插在Xe（红色）插孔中，在做快速动力学测量的时候插在Xe(Hg)插孔中。
2、光源选择：图2中的Vertical setting部位下方的底座上有Xe、Xe(Hg)两个标示前后排列。
手动松开中间的大圆头Screws(图2中)，可以拉出或推进Vertical setting。
圆二色谱原理-PPT
Far UV CD spectra of poly-L-Lys
1、100% α-螺旋 2、100% β-折叠 3、100%无规卷曲
Main CD features of protein 2ndary structures
α-helix β-sheet β-turn polypro II helix Random coil
从统计规律上说,自然光得光振动: 在垂直于光速得平面上遍布所有方向, 沿各方向振动得光矢量呈对称分布, 相应光矢量得振幅(光强度)相等。
超高压短弧氙灯: 在高压纯净氙气中放电发光。
(1)高亮度得点光源; (2)日光色。色温接近6000K; (3)在可见光区连续光谱; (4)高显色性,显色指数＞95; (5)在整个寿命期内维持光色特性; (6)高电弧稳定性; (7)热重启能力; (8)启动后即能达到接近最大光输出; (9)电弧光斑小、易聚光。
PMT得输出信号由正比于IA得直流分量与正比于S得交流分量所组成。
圆二色光谱仪工作原理
• 用相同强度,相同频率得左、右旋圆偏光交替照射样 品测得透过样品后得强度IR与IL
• 由于IR与IL十分接近,令IA=(IL+IR)/2,S= IR – IL
• 只放大相应于S得PMT输出电压Es(交流信号),而不放大相应 IA得输出电压EA。(适当选取放大倍数G值,使ESG与EA可比)。
或℃ ·cm2/dmol。
圆二色性得表示
吸收(率)差 = L - R A = AL – AR
椭圆度,摩尔椭圆度[] = 2、303(AL – AR)/4
[] = 3298(L - R) 3300 (L - R)
在蛋白质研究中,常用平均残基摩尔椭圆度
园二色＋双折射
圆二色谱和旋光谱 ppt课件
+ ORD
理想情况下，UV吸收峰λmax、CD的△ε
[φ ]
绝对值最大(呈峰或谷)及ORD的λK三者应
圆二色光谱(CD)和旋光谱(ORD)
• 旋光光谱(Optical Rotatory Dispersion，ORD)和圆二色
谱(Circular Dichroism，CD)分别于20世纪50年代和60 年代发展起来的仪器分析方法，原理都是利用电磁波和手性 物质相互作用的信息来研究化合物立体结构及其它有关问题。
HOOC NO 2
COOH
O 2N
A
B
(2)原发色团是对称的，但处于手性环境中而被歪曲。
如手性环酮中的羰基有邻位手性中心时是不对称的，手性烯烃(+)-3蒈烯(Carene)中的双键也一样。
*
O Cl
C
Me
3 H1 21
Me
4 *6 5 H D Me
(3)由分子轨道不互相交叠的发色团偶极相互作用产生的。
（2）手性介质对两种圆偏振光的吸光强度不 同，由它们合成的出射光不再是一个平面的偏 振光，而是一个右旋或左旋的椭圆偏振光。
旋光光谱(Optical Rotatory Dispersion, ORD)
假如有机分子是具有手性的，即分子和它的镜像互相不能重 叠，当平面偏振光通过它时，偏振面便发生旋转，即所谓该物 质具有“旋光性”。 偏振面所旋转的角度称之为旋光度，可用旋转检偏镜进行测定。 定义比旋光度[α]D为：
圆二色谱仪使用
圆二色谱仪使用手册实验前请先阅读第一部分注意事项20RR年4月6日整编河北大学理化中心目录一、注意事项二、光源的选择三、MOS450波长的校正四、电压的调节五、M OS-450圆二色光谱扫描操作规程六、MOS450-SFM300动力学操作方法一、注意事项1、滴定及变温实验时，需要磁子搅拌。
实验结束时首先拔掉搅拌电源。
在样品池内无磁子的情况下搅拌器空转会烧毁控温元件。
2、光源（也就是氙灯或汞氙灯）不可频繁开关。
举例而言，如果马上不用仪器，但半个小时后需要使用仪器，就不要为了节约光源寿命而将光源关闭。
短时间内频繁开关光源反而会缩短光源寿命。
3、光电倍增管移动时（比如从圆二色模式换为荧光模式），注意用软件将Hv （高压）关闭。
6P MT HV1000V.7、使用控温附件进行变温实验时，一定要将地上的那个水浴恒温槽打开，水槽温度设为20度以下即可。
8、TCU 上设置为remote;PowersupplR设置为ARC.9、仪器运行过程中，更换样品时，shutter最好关闭。
二、光源的选择1电源:图1中的LamppowersuppIR处有Re （红色）、Re（Hg）（红色）、零线（黑色）三个插孔。
零线插头为黑色，直接插到黑色的零线插孔中。
火线插头为红色，在做圆二色、紫外、荧光的光谱扫描时插在Re （红色）插孔中，在做快速动力学测量的时候插在Re（Hg）插孔中。
2、光源选择：图2中的Verticalsetting部位下方的底座上有Re、Re（Hg）两个标示前后排列。
手动松开中间的大圆头Screws（图2中），可以拉出或推进Verticalsetting。
当Verticalsetting的金属头通过前后移动到下方的哪个标示位置上，也就是那个标示所示的灯正对着光路，为测试用光源。
做快速动力学测量的时候选Re（Hg），做圆二色、紫外、荧光的光谱扫描时选Re,最后再旋紧中间的大圆头Screws。
注：Re（Hg）灯中的Hg元素有一些很强的特征谱线，加强了Re元素发光的强度，对于动力学测量要求一个波长的光源能量要强，才能测量较为精确的谱图。
圆二色谱原理与应用PPT参考课件
圆二色谱仪器刨面图M为镜子,p为起偏器 ls代表等和水晶
17
CD特点
• 测量的θ非常小 • CD测量的为2.32*(AL-AR) 弧度 • 以样品有圆二信号一定要有紫外吸收但有
紫外吸收不一定由远而信号
18
CD谱在蛋白质研究中的应用
19
蛋白质分子的固有不对称性决定了蛋白质的光学活性 蛋白质的结构的不同表现出其对圆二色性特征的差异 所以我们可以通过圆二信号来测量蛋白质的结构信息
φ为初始相位 t为时间
5
我们平时看到的光为自然光具有: 1.方向随机性 自然光源向外发射方向性是随机的光量子
2. 不连续性
z 传播方向 360度旋转的轨迹 会产生无数初始相位不同的光量子
糖葫芦
这两个性质决定自然光具有如图所示的性质,既自然光可以看作圆柱形向
前传播的光
6
两束光的合成: 物理力学力的矢量合成:
On Line Circular Dichroism Analysis /cdweb/html/
下载软件分析: /cdrwjweb/#Instructions
Cca分析 http://www2.chem.elte.hu/cgi-bin/ccaform 061122-5lyxPGDxoLsM6-00
2
粒子性：光是某种粒子即光量子，具有粒子的性质 如 反射，散射等现象。 墨子和他的学生做了世界上最早的“小孔成像”实验， 并对实验结果作出了光沿直线传播的科学解释， 并用此原理解释了物体和投影的关系。
波动性：即光具有波动性，有衍射、干涉等性质
爱因斯坦提出了光量子论，解释了光电现象， 揭示了微观客体的波粒二重性
圆二色谱Circular Dichroism (CD) 原理与应用
圆二色谱仪使用.
圆二色谱仪使用手册实验前请先阅读第一部分注意事项2011年4月6日整编河北大学理化中心目录一、注意事项二、光源的选择三、MOS 450波长的校正四、电压的调节五、MOS-450 圆二色光谱扫描操作规程六、MOS 450-SFM 300动力学操作方法一、注意事项1、滴定及变温实验时，需要磁子搅拌。
实验结束时首先拔掉搅拌电源。
在样品池内无磁子的情况下搅拌器空转会烧毁控温元件。
2、光源(也就是氙灯或汞氙灯)不可频繁开关。
举例而言，如果马上不用仪器，但半个小时后需要使用仪器，就不要为了节约光源寿命而将光源关闭。
短时间内频繁开关光源反而会缩短光源寿命。
3、光电倍增管移动时(比如从圆二色模式换为荧光模式)，注意用软件将Hv（高压）关闭。
4、扫描速度在0.5-5s/nm。
使用手册上写的扫描速度有误，特别注意不要低于0.5秒/nm,过快的扫描速度易造成calibration移位。
5、如需用到emission单色器，就是那个需要用光纤连接的单色器，扫描速度要大于1s/nm,连0.5s/nm都不能用。
6、PMT的HV不要超过1000V.7、使用控温附件进行变温实验时，一定要将地上的那个水浴恒温槽打开，水槽温度设为20度以下即可。
8、TCU上设置为remote; Power supply设置为ARC.9、仪器运行过程中，更换样品时，shutter最好关闭。
二、光源的选择1、电源：图1中的Lamp power supply处有Xe（红色）、Xe(Hg)（红色）、零线（黑色）三个插孔。
零线插头为黑色，直接插到黑色的零线插孔中。
火线插头为红色，在做圆二色、紫外、荧光的光谱扫描时插在Xe（红色）插孔中，在做快速动力学测量的时候插在Xe(Hg)插孔中。
2、光源选择：图2中的Vertical setting部位下方的底座上有Xe、Xe(Hg)两个标示前后排列。
手动松开中间的大圆头Screws(图2中)，可以拉出或推进Vertical setting。
圆二色光谱法用PPT课件
Beer-Lanmbert Law
A= lgI0/I
=(1/2.303)lnI0/I
=εCL
圆二色性
Optical active object
L ?
ΔA=AL- AR =Δε C L
=2.303 A/4 (弧度)
第9页/共51页
CD的Cotton effect
CD的Cotton effect曲线：
220-230 (weak) 180-190 (strong) 190
200
205
210-230 weak 212
第40页/共51页
CD signal of a protein depends on its 2ndary structure
—— chymotrypsin (all b) —— lysozyme ( + b) —— triosephosphate isomerase(/b) —— myoglobin (all )
• 朝光源看，偏振面按顺时针方向旋转的，称为 右旋，用“+”号表示；偏振面按逆时针方向旋 转的，称为左旋，用“-”号表示
第2页/共51页
旋光度
• = []lc
[]是旋光物质的比旋光率，单位是度•厘 米2 • 10克-1
• 对同一物质，[]值与波长有关
旋光率与波长的关系称为旋光色散 (Optical rotatory dispersion, ORD)
第41页/共51页
估算蛋白质螺旋含量
仅适合含量较高的蛋白质！
第42页/共51页
蛋白质二级结构含量计算
Fasman standards
t = x + xbb + xcc Vary x, xb and xc ， while x+ xb + xc = 1.0
《圆二色光谱》PPT课件备课讲稿
[ ] Mw [y] /100
平均残基椭圆率[ ]MRw
the mean residue ellipticity
[ ]MRw MRw [y] /100
C: 摩尔浓度 L : 光程 (dm)
[ ]: [deg • mol-1 • cm-1] or [deg • cm2 • dmol-1]
Beer-Lanmbert Law
A= lgI0/I
=(1/2,303)lnI0/I
=εCL
ΔA=AL- AR =Δε C L
Optical active object
L ?
=2.303 A/4 (弧度)
比椭圆率[y] the specific ellipticity
[y] = /CL
摩尔椭圆率[ ] , [ ]
effect
-
Negative cotton +
effect
-
0
λ
0
λ
0
λ
Instrument
/
CD application
Secondary structure of macromolecule
[] x E-3
-helix: 19x nm (+) 208nm, 222nm (-)
基本原理( principle )
Plane (linearly) polarized light
Right and Left hand circularly polarized light
Optically Active Sample
Chiral
Preferential absorption of left hand polarized
旋光光谱和圆二色谱课件
行后续的数据处理和分析。
数据处理
02 利用软件对数据进行平滑处理、基线校正等操作，以
提高数据的质量和可靠性。
结果输出
03
将处理后的数据以图表形式输出，便于分析和解读实
验结果。
06
CATALOGUE
总结回顾与拓展延伸
关键知识点总结回顾
旋光光谱和圆二色谱基本 原理
回顾两种光谱技术的物理原理、数学表达式 及实验方法。
手性分子与圆二色现象
只有手性分子才具有圆二色性，其左、右旋圆偏振光吸收不同。
立体化学环境与圆二色性
分子的立体化学环境，如构型、构象等，会影响圆二色性表现。
圆二色性参数定义及计算方法
圆二色性参数
描述圆二色性强弱的参数，如椭圆率、旋转角等。
计算方法
通过测量左、右旋圆偏振光的吸收差值，并利用相关公式进行计算得出。
药物与DNA/RNA相互作用
通过圆二色谱可以研究药物与DNA/RNA的相互作用， 了解药物对DNA/RNA构象的影响，为药物设计提供依 据。
生物膜脂质组成分析
要点一
脂质组成
圆二色谱可以检测生物膜中不同脂质组分的含量和分布， 从而了解生物膜的结构和功能。
要点二
膜蛋白与脂质相互作用
通过圆二色谱可以研究膜蛋白与脂质之间的相互作用，揭 示膜蛋白在生物膜中的功能和作用机制。
旋光度测定
通过测量旋光度，可以确定有机化合物的旋 光性质和旋光度大小，从而进行化合物鉴定 。
纯度检查
比较实际测量值与理论计算值，可以判断样 品纯度，如旋光度与浓度关系是否符合比尔 定律。
药物开发中活性成分筛选
活性成分筛选
利用旋光光谱技术，可以快速筛选具有特定 旋光性质的活性成分，提高药物开发效率。
拉曼光谱及圆二色谱 ppt课件
1332 1580
Relative intensities -> degree of
20000
14000
disorder in graphite structure
800 1800
1750
1700
1650
1600
wavenumber (cm-1)
1550
27
二、拉曼光谱的应用
• 2、在生
物学中
的应用
螺旋 结构
折叠 结构
28 高分子科学系周平
3、在无机化学上的应用
20000 15000 10000 5000
0 1000
Elemental Carbon
The material from Nanotubes are Derived
15 高分子科学系周平
3）相互禁阻规则：有少数分子的振动在红外和拉曼中 都是非活性的。 如乙烯的扭曲振动既无偶极矩变化，也无极化率变化， 故在红外及拉曼中皆为非活性。
H
H
CC
H
H
16 高分子科学系周平
6、拉曼光谱的一些基本特征：
(1) 对称取代的S-S 、C=C 、N=N 、C≡C振动产生强拉曼谱带，由 单键、双键到三键，因可变形的电子逐渐增加，故谱带也增强。
(CN)
2255~2220
(CC) (C=O)
2250~2100 1820~1680
(C=C) (N-N),脂肪族取代基 (N-N),芳香族取代基
1900~1500 1580~1550 1440~1410
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根据Beer-Lambert law 有： θ = [θ]. l.c 或 [θ]=mdeg/(l.c ) (c-摩尔浓度)
计算出的值最后再乘以1000即可转换为deg.cm2.dmol-1
蛋白质： 氨基酸的圆二色性： 在可见光区没有吸收，紫外区只有芳
香族色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。
2、 JASCO J-1500 基本组成与附件
配置：
1）检测器： UV-VIS 163-950nm NIR 400-1250nm 2) 光源：氙灯 3)气体：高纯N2 4)多通道测定 （CD/HT/Abs…），
制样工具
3) 停流附件
注射器：10ml
单管路死体积：46ul
注射器Flow rateMax :5ml/min
反应动力学检测
Mixing Ratio:整数倍
4) N2吹扫装置
只能用于标准样品支架，用于190nm以下样品测试
3、开机与基本操作规程
1）开气：打开氮气，调节分压在0.02mPa左右，依据测定波 长范围在仪器右侧的流量控制器中调节所需的气体流量。 (>190nm 2L/min; 185-190nm 5-10L/min; <185nm 25L/min) 2）开机：打开主机电源，使用变温时，需打开水循环电源。 或使用停流附件需开启停流附件控制器电源。 3) 软件：打开电脑主机，双击“spectra manager”图标，进入 操作界面，显示J-1500处于Idle状态则表示联机成功。
二级结构分析：
打开protein Secondary structure estimation软件，打开转换单位后 另存的文件数据。
3D数据分析：
需进行2D数据提取后方可进行有关分析。点击Interval
Data Analysis软件，打开.jwb格式3D数据文件。
5、关机与测试注意事项
圆二色谱仪操 作规程培训
目
录
1、圆二色谱仪基本原理与应用
2、 JASCO J-1500 基本组成与附件 3、开机与基本操作规程 4、数据分析 5、关机与试验注意事项
1、圆二色谱仪基本原理
圆二色性(CD)：活性物质对左、右旋圆偏振光的吸收率差值，将传播 的左右圆偏振光变成椭圆偏振光。
两束互相垂直，振幅相等的平面偏振光，其位相相差1/4波长时，合成圆偏振光 。
旋光性(ORD)：光学活性分子对左、右圆偏光的折射率不同，透 射光仍然为平面偏振光，但其旋转了一定的角度（旋光度）。
CD光谱与ORD光谱： 同时产生，包括同样的分子结构信息，光学活性物质分子中的不 对称生色团。CD反应光与分子间能量的转换，旋光性则是与分子 中电子的运动有关。
差异：CD比ORD容易辨别重叠峰，易检测弱吸收带、更容易拟 合、能够提供较多意义明确的信息。
圆二色谱仪应用：
通过CD光谱可用于分析诸如核酸、蛋白质、多糖等生物大分 子光活性物质的空间结构。
*蛋白质折叠研究 *蛋白质构象研究 *DNA/RNA相互作用 *酶动力学研究 *有机立体化学研究 *光化学物质纯度检测 *药物量的分析
• • • • • • •
天然有机化学 生化和大分子 金属复合物化学 医学 农业化学 物理化学 快速扫描实验
宽太大，HT<170可损坏PMT检测器。
4、数据分析
1）数据类型：
2D数据：.jws格式，光谱分析软件以及二级结构分析软件
都是需要这种格式数据文件。 3D数据：.jwb格式，需根据需要提取2D数据后进行相关分 析。 2）蛋白质二级结构软件分析：CD单位需为摩尔浓度，故需已
知蛋白浓度（mg/ml），氨基酸残基平均分子量（未知时，
4) 测定模式选择：
软件界面
参数设置：
Example: Spectra measurement 参数设置
样品测试：
Specifying Monitoring Parameters: 对于3D扫描
样品测试技巧：
a) 预先紫外扫描，A>2时，测试不准确。适宜的A范围0.6-1。
b)控制HT范围在170-700之间，降低HT方法：降低样品浓度、 使用短光程长比色皿、增加带宽、注意溶剂效应。 HT>700时没有足够的光到达检测器，测试结果不准确。狭缝
一般取110）。
“蛋白质中20中氨基酸的平均分子质量约为138，但在多数蛋白质中较小的氨基酸占优势，因此平
均相对分子质量约为128。又因每形成一个肽键将除去一分子水（相对分子质量18），所以氨基酸
残基的平均相对分子质量约为128-18=110。”---王镜岩版《生物化学》第三版上册 p160
2D数据分析：
自然光的 电向量E
起偏振器
平面偏振光 的电向量E 椭圆偏振光：两束偏振光的振幅(强度) 不相同
பைடு நூலகம்
圆二色性(CD)的表示：
CD单位转换方法：/blog/post/circular-dichroism-units-conversion.html
Ellipticity（椭圆率θ ）：mdeg，定义单位，仪器测定直接显示CD图y坐标。
CD测定范围：±20, 200, 2000,10000 mdeg
5) 蛋白质二级结构分析软件
6)其他附件：变温支架、停流附件等
附件
1)变温样品支架（-40~130℃）
石英比色皿:1、10mm 石英比色皿:1、2、5、10mm
附件
2) 固体样品支架与积分球检测器
可做透射法或反射法， 压片制样或直接上样
对于蛋白质，使用的是mean residue ellipticity。由于mean residue molecular weight= protein formula weight/number of residues. 摩尔圆二色性为摩尔消光系数的差值（delta epsilon），即：Δε = εLCP- εRCP 在分子模拟中通过高斯理论计算CD光谱时，得到的结果通常是以摩尔圆二色性 Δε 表示。Δε 与摩尔椭圆率（molar ellipticity）[θ]之间的转换：[θ]=3298.2 Δε