Ion torrent De novo测序文库构建方法 De-novo library

De novo测序文库构建方法

一、De novo测序的原理

De novo测序不需要任何参考序列，即可对某个物种进行测序，用生物信息学分析方法进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。

利用全基因组从头测序技术，可以获得动物、植物、微生物的全基因组序列，从而推进该物种的研究。

De novo测序没有参考序列，需要建立不同片段大小及类型的测序文库，测序后的信息需要组装和拼接。

拟构建200bp和400bp Ion测序文库，以及Ion mate-pair测序文库。

二、文库构建技术路线

1. Ion 200 or 400-base-read library

Workflow

基因组DNA提取

↓

OD260/280检测，凝胶电泳检测，基因组大小评估，基因组定量

↓

超声波打断

↓

末端修复

↓片段纯化

接头连接

↓纯化

文库片段筛选（E-Gel胶回收）

↓

文库片段扩增

↓纯化

Agilent检测，Qubit定量

↓

OneTouch、ES

↓

上机测序

2. Ion mate-pair library

基因组DNA提取

↓

基因组定量检测

↓

DNA破碎（HydroShear DNA Shearing Device）（压力挤压破碎大片段DNA）

↓

末端修复

↓

文库片段选择（凝胶电泳，SOLiD凝胶回收试剂盒纯化）

↓

文库片段定量

↓

MP接头连接（SOLiD MP接头连接试剂盒）

↓纯化

Qubit定量

↓

确定DNA回收量，确定回收到的片段含量（含量不同，使用的试剂量不同）

↓

DNA片段环化

↓

分离纯化环状DNA

↓

定量

↓

环化DNA缺口修复及SOLiD文库试剂盒纯化

↓

T7核酸外切酶、S1核酸酶酶切

↓纯化

末端修复

↓

文库片段于链霉素亲和素微珠相连

↓

连接Ion接头

↓

缺口修复、与扩增凝胶条带检测（确定循环数）

↓

片段扩增

↓SOLiD试剂盒纯化

片段切胶回收

↓

Agilent检测

↓

Q-PCR定量

↓

文库构建完成

三、文库构建用到的试剂盒

Ion Library Adaptors and Primers and 5500 SOLiD Mate-Paired Library Kit Mate-Paired Library Enzyme Module

Mate-Paired Library Amplification Module

Mate-Paired Library Oligo module

Library Micro Column Purification Kit

Agencourt AMPure XP 60 mL Kit

Qubit 2.0 Fluorometer及相应的试剂

Agilent 2100 及相应的试剂

四、400bp测序文库构建步骤

1.细菌基因组DNA的提取

要求客户提供足量菌体。将培养至对数期的菌液分装到2-3支2mL离心管，采用适当的转速离心使菌体沉淀到管底，除去上清液，迅速放入液氮速冻后，放入装有干冰的保温盒内运送。

细菌DNA采用试剂盒提取法（如TianGen细菌基因组提取试剂盒）。

取对数生长期的菌液，按照细菌DNA提取试剂盒操作步骤进行操作。提取完成后，对基因组DNA进行纯度和浓度的检测。通过测定OD260/280，范围在1.8-2.0之间则DNA较纯，使用Qubit对提取的DNA进行定量，确定提取的DNA 浓度达到文库构建的量。

2.DNA片段化

采用Covaris System超声波打断仪（Covaris M220），将待测DNA打断

步骤：

1）对待打断的DNA进行定量，将含量控制在100ng或者1μg

2）打开Covaris M220安全盖，将Covaris AFA-grade Water充入水浴容器内，至液面到最高刻度线（约15mL），软件界面显示为绿色

3）将待打断DNA装入Ep LoBind管中，其中DNA为100ng或1μg，加入Low TE 至总体积为50mL

4）将稀释的DNA转移至旋钮盖的Covaris管中，转移过程中不能将气泡带入，完成后旋紧盖子

5）选择Ion_Torrent_400bp_50μL_ScrewCap_microTube，将对应的小管放入卡口，关上安全盖，点击软件界面“RUN”

6）打断结束后，将混合液转移至一支新的1.5mL离心管中

3.末端修复及接头连接

3.1 末端修复

使用Ion Plus Fragment Kit进行，以100ng DNA量为例，各组分使用前瞬时

离心2s

步骤：

1）加入核酸酶free水至装有DNA片段的1.5mL离心管中，至总体积为79μL 2）向体系中加入20μL 5×末端修复buffer，1μL末端修复酶，总体积为100μL 3）室温放置20min

3.2 片段纯化

片段纯化使用Agencourt AMpure XP Kit进行

步骤：

1）加入180μL Agencourt AMpure XP Reagent beads于经过末端修复的1.5mL离心管中，充分混匀，室温放置5min

2）瞬时离心后，将离心管放置于磁力架（如DynaMag-2磁力架）3min，至溶液澄清，小心去除上清，离心管保持放置在磁力架上

3）离心管放置于磁力架上不移动，配置新的500μL 70%乙醇，加入，30s后，盖上盖子颠倒混匀2次，使磁珠悬浮，放回磁力架至溶液澄清后，小心除去上清4）重复第三步

5）用20μL墙头小心吸去多余的液体

6）将离心管留在磁力架上，室温风干不超过5min

7）取下离心管，加入25μL Low TE缓冲液，盖上盖子，上下颠倒混匀5次，旋窝震荡10s，充分混合

8）瞬时离心后，将离心管放于磁力架上至少1min，溶液澄清后，将上清移入一支新的1.5mL EP管中（不可吸到磁珠）

9）纯化的DNA片段用于下一步的接头连接

4.接头连接、缺口修复和纯化

片段两端的接头分别为barcode接头和P1接头

4.1 接头连接

在0.2mL体系中加入（以100ngDNA为例）

DNA 25μL