实验一35二硝基水杨酸比色法还原糖和总糖的测定

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实验一还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法

一、实验目的

掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。

二、实验原理

还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。

还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以。

三、实验材料、主要仪器和试剂

1．实验材料

小麦面粉；广范pH试纸。

2．主要仪器

（1）大试管：2×20cm×14

（2）烧杯：100mL×3

（3）三角瓶：100mL×1

（4）容量瓶：100mL×3

（5）移液管：1mL×3；2mL×2；10mL×4

（6）吸耳球、玻璃棒

（7）恒温水浴锅

（8）漏斗、滤纸

（9）白瓷缸、电炉

（10）精度天平

（11）分光光度计

3．试剂（已制备）

（1）1mg/mL葡萄糖标准液

准确称取90℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。

（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂

将3,5-二硝基水杨酸（DNS）和2mol\L NaOH溶液262mL，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中，7-10天后才能使用。

（3）6mol/L HCl和6mol/L NaOH 。

四、操作步骤

1．制作葡萄糖标准曲线

取7支2×20cm大试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。

表1 葡萄糖标准曲线制作

管号葡萄糖含量

（mg）

1mg/mL葡萄糖标准液

（mL）

蒸馏水

（mL）

DNS

（mL）

吸光度值

（A540）

0 0 0 2

1

2

3

4

5

6

将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，用流动水冷却至室温，用蒸馏水补充至20mL （即各加入蒸馏水），震荡混匀，在分光光度计上进行比色。调波长540nm，用0号管调零点，测出1~6号管的吸光度值。以吸光度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。

2．样品中还原糖和总糖的测定

（1）还原糖的提取

准确称取食用面粉，放入100mL烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入50mL蒸馏水，搅匀，置于50℃恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。将浸出液用100mL容量瓶定容，混匀，过滤，滤液作为还原糖提取液，待测。

（2）总糖的水解和提取

准确称取食用面粉，放入100mL三角瓶中，加15mL蒸馏水及10mL 6mol/L HCl，置沸水浴中加热水解30min。待三角瓶中的水解液冷却后，用6mol/L NaOH中和（大约10mL左右），用广范pH试纸测试中和到pH=7，用蒸馏水定容在100mL容量瓶中，混匀。将定容后的水解液过滤，取滤液1 mL，移入另一9mL水的试管中，混匀，稀释10倍作为总糖待测液。

（3）显色和比色

取7支2×20cm大试管，编号，按表2所示分别加入待测液和显色剂，用7号管进行空白调零。加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。

表2 样品还原糖测定

管 号 还原糖待测液

（mL ） 总糖待测液

（mL ） 蒸馏水 （mL ） DNS （mL ） 吸光度值 （A 540） 查曲线葡萄糖量

（mg ）

7

8 9 10 11 12 13

五、结果与计算：

利用8、9、10号管吸光度值和11、12、13管吸光度值，在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，分别计算出还原糖和总糖的平均值，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。

六、注意事项

1． 试管、烧杯和三角瓶事先要洗净烘干。 2． 试管要提前标号。

3． 移液管使用前要润洗。 4． 移液管要专管专用。

5． 分光光度计要预热30分钟。

6． 比色皿要用擦镜纸擦干，尤其是光滑面，更不能用手碰。 7． 保持环境干净，废液倒在废液缸中，废纸放入垃圾桶中。

8． 标准曲线制作与样品测定尽量同时进行显色，并使用同一参比溶液调零点和比色。

9． 用分光光度计比色时，应注意每次都应该把比色皿用蒸馏水洗两遍，再用待测液润洗，之后再

装待测液。

七、思考题

1．3,5-二硝基水杨酸比色法是如何对总糖进行测定的? 2．比色测定时为什么要设计空白管？

八、预习题

1. 什么是还原性糖

2. 高中学过测定还原性糖的方法是什么？其原理和操作又是什么？

3. 操作注意：注意事项中要求，用分光光度计比色时，每次都应该把比色皿用蒸馏水洗两遍，这

是为什么？如果不洗会造成什么影响？ 还原糖（%）= 查曲线所得还原糖毫克数×稀释倍数

×100

样品毫克数

总糖（%）= 查曲线所得总糖水解后毫克数×稀释倍数

××100

样品毫克数