啤酒酵母菌的扩大培养
酵母菌扩大培养方法
酵母菌扩大培养方法一、酵母菌扩大培养的重要性。
1.1 酵母菌在很多领域都非常重要啊。
像做面包的时候，没有酵母菌，那面包就不会蓬松柔软，就像一块硬邦邦的石头，简直是“味同嚼蜡”。
酿酒的时候呢，酵母菌更是关键角色，没有它，哪来的美酒飘香啊。
所以，为了满足生产或者实验等需求，我们就得进行酵母菌的扩大培养。
1.2 扩大培养就好比是给酵母菌“扩充队伍”。
原本少量的酵母菌，经过扩大培养，数量增多了，就能更好地发挥它们的作用。
这就像盖房子，原本只有几个小工，慢慢扩充成一个大的建筑队，这样就能更快更好地把房子盖起来。
二、准备工作。
2.1 首先得有合适的培养基。
培养基就像是酵母菌的“食物”和“住所”。
一般来说，常用的有麦芽汁培养基。
这麦芽汁就像是酵母菌的“美味佳肴”，能让酵母菌茁壮成长。
根据不同的需求，也可以用合成培养基，就像给酵母菌定制的“营养套餐”。
2.2 容器也很关键。
要选择干净、无菌的容器。
这就好比我们住房子，肯定要选择干净整洁的房子一样。
如果容器不干净，有杂菌，那就像家里进了小偷，会影响酵母菌的正常生长。
小量培养的时候，可以用试管或者小锥形瓶；要是大量培养，那就得用大的发酵罐了。
2.3 还有接种的工具，像接种环之类的，也要提前消毒好。
这就像我们做饭前要把厨具洗干净一样，不能让脏东西影响了酵母菌的培养。
三、接种。
3.1 接种的时候要小心谨慎。
从保藏的酵母菌菌种中挑取少量的酵母菌，就像从宝藏中小心翼翼地取出一颗明珠一样。
把这少量的酵母菌接种到准备好的培养基中。
如果是液体培养基，接种的时候要尽量让酵母菌均匀地分布在培养基里，可不能让它们“挤成一团”。
3.2 在接种过程中，要严格遵守无菌操作的原则。
这就像我们在医院做手术一样，必须保证无菌环境。
一旦有杂菌混入，那可就“前功尽弃”了。
酵母菌就可能被杂菌“欺负”，长不好甚至死亡。
四、培养条件。
4.1 温度是个很重要的因素。
不同的酵母菌适合生长的温度不太一样，一般来说，在20 30摄氏度之间比较合适。
发酵——种子的扩大培养
孢子培养
母瓶：活化、纯化，使保藏菌种生长，并去处变异株。 所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落。
子瓶: 大量繁殖，得到大量孢子。 接种：①从母斜面上点接种，选取生长好的单 菌落 ②接种时密一点，得到大量的孢子。
孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月
三、生产车间阶段 1、培养物的选择原则 在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。 菌丝体比孢子要有利： 缩短发酵时间 有利于获得好的发酵结果
✓ 培养时间为5~14天。
对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产 链霉素的灰色链霉菌、产卡那霉素的卡那链霉菌 可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含液体培养 基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌 丝体，作为种子。
试管→三角瓶→摇床→种子罐
2，厌氧培养：对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等） 试管→三角瓶→卡式罐→种子罐
常用微生物发酵级数：
✓ 细菌：二级发酵 茄子瓶→种子罐→发酵罐
✓ 霉菌：如青霉菌，三级发酵 孢子悬浮液→一级种子罐（27˚C,40小时孢子发
芽）→二级种子罐（ 27˚C,10~24小时）→发酵罐 ✓ 放线菌：四级发酵
✓ 酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子
4、接种量的确定
移入种子的体积 接种量＝ —————————
2、培养基选择的原则
培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基 应该是有利于孢子的生长。
在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小， 因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较 精细。
3、起始接种物的传代问题 细菌 保藏斜面 → 活化斜面 产孢子 保藏 → 母斜面 → 子斜面
种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。
酵母扩大培养过程关键控制点
酵母扩大培养过程关键控制点金星集团信阳啤酒有限公司黄华龙465100 啤酒工厂从单细胞分离得到一个酵母细胞，经过鉴定确认、生产试验，得到优良菌株，然后经过若干次扩大培养，最后制备成107～108个细胞/ml后供发酵用，酵母扩大培养关键在于：第一，选择优良的单一细胞出芽菌株；第二，在整个扩大培养中保证酵母菌种的强壮、无污染。
近代由于发酵规模越来越大，对接种酵母要求越来越严。
各工厂扩大培养方式和顺序大致相同，而扩陪的结果得到种酵母的纯度、强壮情况、污染情况却差异很大，其原因在于是否有一个科学、无菌的扩培技术管理。
一、出芽菌株的选择作为扩大培养的出芽菌株，，无论是实验室保藏菌株还是生产现场（主酵或酵母泥）分离得到的菌株。
一般均需进行单细胞分离，并通过一系列生理特性和生产性能测定，包括酿酒口味鉴评后，确认是工厂生产需要的优良纯种后才允许投入生产扩大培养。
此单细胞分离和菌株鉴定，需要在有丰富微生物理论和实践经验的技术人员指导下进行。
二、扩陪过程的无菌操作扩大培养应严格建立在纯种的基础上，扩大培养过程的无菌技术是扩陪成败的关键。
它包括：培养器皿、设备的无菌，移种操作的无菌，培养过程中通风调节温度的无菌。
在汉生罐以后从麦汁进罐至移种结束，必须保证汉生罐处于正压状态，这是杜绝吸入有菌空气的先决条件。
三、优良的培养基麦汁是啤酒厂最方便的酵母培养基，但绝对不是“凡可以用来酿造啤酒的麦汁均是优良的培养基”。
许多工厂，常常从大生产麦汁中分割作为任何一级扩陪培养基，由于麦汁组成太差，会造成扩大培养失败。
无论是哪级扩陪，培养基均需要有特殊要求的麦芽汁。
实验室（从试管至大锥形瓶）培养用麦汁，一般应有实验室自己制备，可按以下方式制备成10°P全麦芽麦汁用于试管活化及菌种保藏。
1.麦汁制备:1)称取优级麦芽约200g，除去铁屑、石粒等坚硬杂质，采用EBC粉碎。
2)调EBC粉碎机的磨间距，使细粉颗粒直径为0.2㎜。
3)料水比例：1：3～3.54)称取细粉适量（准确至0.1g），于已知重量的糖化杯（500～600ml专用金属杯中），加入46℃水200ml,在不断搅拌下于45℃水浴中保温30min。
啤酒发酵工程系列实验
实验二啤酒发酵工程系列实验一、实验目的1、学习啤酒生产中麦芽汁的生产方法，掌握工艺流程；2、掌握菌种复壮纯化技术和实验室扩大培养技术；3、掌握啤酒发酵的主发酵和后发酵的工艺，了解发酵各阶段的变化特征。
二、实验原理麦芽汁浸出物中糖类占90%，其中葡萄糖和果糖占糖类的10%，蔗糖占5%，麦芽糖占40~50%，麦芽三糖占10~15% 低聚寡糖20~30%，少量的戊糖、戊聚糖等3~5%。
啤酒酵母的可发酵糖和发酵顺序：葡萄糖＞果糖＞蔗糖＞麦芽糖＞麦芽三糖。
啤酒酵母发酵可发酵糖类经EMP途径生成丙酮酸，丙酮酸无氧酵解产生酒精和CO2、同时还形成高级醇、挥发酯、醛类和酸类、连二酮类(VDK)、含硫化合物等一系列代谢产物，构成啤酒特有的香味和口味。
三、实验材料、仪器与试剂材料：麦芽，麦芽汁、啤酒酵母发酵菌液、酵母培养物等；仪器：水浴锅、烧杯、糖化槽、温度计、滤纸、漏斗、电炉、显微镜、血球计数板、盖玻片、恒温培养箱、生化培养箱、显微镜、麦芽汁平板、玻璃棒、糖度仪、滴定管、滴定管架、电炉、三角瓶、pH试纸等；试剂：碘、碘化钾、美蓝、亚甲基蓝、酒石酸钾钠、氢氧化钠、亚铁氢化钾、葡萄糖、盐酸等。
四、实验步骤1、协定法糖化试验1.1 实验室糖化器的准备由水浴锅和大烧杯组成糖化仪器，杯内用玻璃棒搅拌。
实验时杯内页面应始终低于水浴液面。
1.2 碘溶液（0.02mol/L）配制2.5g碘和5g碘化钾溶于水中，稀释到1000ml。
1.3 协定法糖化麦芽汁的制备和糖化时间的测定：取75克麦芽，粉碎，放入1000ml烧杯，加300ml46°到47°水，在45°水浴中保温1小时，加150ml70°的水保温3到4小时，2小时之后，每隔十分钟测淀粉，直到蓝色消失，加水使糖化杯内容物准确称量为675ml。
2、啤酒酵母的计数取清洁的血球计数板一块，在计数室上方加盖一张盖玻片，取稀释后的菌液一小滴，滴至盖玻片边缘，让菌液浸入计数室内，静置，先用低倍镜找到计数室的方格网，并移至视野中间，找到计数室位置，并看清中方格及小方格，有代表性的选择左上，左下，右上，右下，中间五个中方格计数。
酵母菌在酒发酵中的应用
酵母菌在酒发酵中的应⽤酵母菌在酿酒⼯业中的应⽤2071454103 程瑜摘要：酵母最早⽤于⼯业⽣产就是⽤于酿酒业。
酵母菌在各种粮⾷酒、果酒的酿造中有⼴泛的应⽤。
酒的酿造原料⼤多采⽤各种⾕物，植物的块茎等原料，在酿制前期，各种原料中的淀粉发⽣糊化反应及在淀粉酶的作⽤下转化为糖，这时就要加⼊酵母菌种进⼊酒精发酵阶段了，在酵母菌的作⽤下，使发酵液中的糖类转化成⼄醇和其他代谢产物。
关键词：酵母菌啤酒果酒⽩酒发酵利⽤微⽣物的作⽤⽽制得的⾷品都可称之为发酵⾷品。
我国传统发酵⾷品历史悠久，曾影响着⽇本、朝鲜等国家。
近年来，我国发酵⾷品⼯业化⽔平逐年提⾼，⽩酒、啤酒、葡萄酒、酸奶等产品的⼯业化⽣产发展迅速，其它产品如腐乳、⾖豉、酱油、发酵肠等，⼯业化程度相对较低。
因此必须提⾼我国传统发酵⾷品⼯业化⽔平，参与国际竞争。
1.酵母菌的性质酵母是⼀种单细胞⽣物，有着天然丰富的营养体系。
酵母细胞中含有⼤量的有机物、矿物质和⽔分。
有机物占细胞⼲重的90％~94％，其中蛋⽩质的含量占细胞⼲重的35％~60％，碳⽔化合物的含量在35％~60％，脂类物质的含量在1％~5％。
酵母细胞中还富含多种维⽣素、矿物质和多种酶类，能促进其被消化吸收。
此外它还含有多种鲜为⼈知的活性物质，如麦⾓固醇、⾕胱⽢肽、超氧化物歧化酶、辅酶A等。
酵母由于具有很⾼的营养成分，不仅直接被开发为营养⾷品，还可进⼀步制成多种营养活性物质，作为营养⾷品的载体，进⼀步深加⼯则成为更具营养和保健价值的⾷品。
2.酵母菌在酒⼯业中的应⽤2.1（⼀）啤酒酿造啤酒酿造是以⼤麦、⽔为主要原料，以⼤⽶或其它未发芽的⾕物、酒花为辅助原料；⼤麦经过发芽产⽣多种⽔解酶类制成麦芽；借助麦芽本⾝多种⽔解酶类将淀粉和蛋⽩质等⼤分⼦物质分解为可溶性糖类、糊精以及氨基酸、肽、胨等低分⼦物质制成麦芽汁；麦芽汁通过酵母菌的发酵作⽤⽣成酒精和CO2以及多种营养和风味物质；最后经过过滤、包装、杀菌等⼯艺制成CO2含量丰富、酒精含量仅3%～4%、富含多种营养成份、酒花芳⾹、苦味爽⼝的饮料酒即成品啤酒。
啤酒发酵
◎（B）通风 ◎通风不足是影响酵母增殖促进细胞衰退的主
要因素，但我们培养啤酒的目的是为了酵母 进行后面的厌氧发酵，如果一味追求细胞数， 过度通氧，也会造成酵母细胞呼吸酶活性太 强，而酵母酶活性不足，影响以后的发酵。
◎在实验室培养阶段：一般4~8h振荡一次。 ◎汉生罐、繁殖罐：溶氧控制水平从
6.0~3.0mg/L逐级降低。
③巴氏灭菌前的a-乙酰乳酸含量
★若啤酒杀菌前的a-乙酰乳酸含量高，高温时 遇到氧气将形成较多的双乙酰。
④生产过程的染菌情况
★若发酵生产中污染杂菌，双乙酰含量明显会升 高。
⑤酵母自溶情况
★若酵母细胞自溶后的a-乙酰乳酸进入啤酒， 经氧化转化为双乙酰。
◎降低双乙酰的措施
①改善麦汁成分，提高麦汁中缬氨酸的含量 ★通过反馈作用，抑制从丙酮酸合成缬氨酸 的支路代谢作用； ★一般，12%的麦汁的a-氨基酸含量应控制在 180ml/L以上。 ②加速a-乙酰乳酸的分解速度 ★提高发酵温度 ★通风搅拌 ★降低接种麦汁的PH值至4.4左右
●麦汁含氮物质的转化
■啤酒发酵初期，接种啤酒酵母必须通过吸收麦
汁中的含氮化合物，用于合成酵母细胞蛋白质、 核酸和其他含氮化合物，繁殖细胞。
■活的啤酒酵母只能分泌很少的蛋白酶，只能从
麦汁中吸收氨基酸、二肽、三肽等低肽氮化合 物，而且二肽、三肽吸收能力很低。
■啤酒酵母不能全部吸收麦汁中氨基酸，对a-氨
◎发酵度——表示麦芽汁接种酵母后浸出物被发 酵的程度。（用F表示）
（麦芽汁浸出物含量 发酵后浸出物含量） F 100% 麦芽汁浸出物含量
■（3） 絮凝性酵母 ◎介于粉末型酵母和凝聚性酵母之间，发酵减
弱后，酵母开始形成并不紧密的絮状沉淀，发 酵结束时，器底形成较多沉淀，经振荡，酵母 较快分散，静置一段时间，又能重新沉降。
啤酒酵母扩大培养的研究
培养过程应根据工厂的实际情况及麦汁生产的节奏合 理安排 ， 其酵母扩 大培养的关键在于 ： 第一选择优 良
的单细 胞 出发 菌株 ， 第一 在扩 大培 养 中要保 证酵 母 纯 种 、 壮 、 污 染 ， 用 的 扩大 培 养 方 法应 达 到 无 菌 强 无 选
４１ 时 间估计 法 ．
在酵母扩大培养过程中， 通常饱和期的酵母细胞
数可达９ ～ ｌ ７ ｍｌ移种期控制在７ ｍ ． ２ １ 个／ ， Ｏ ｘ ０ ．Ｘ１ 个／ｌ ０ ０ 为最佳 。 据相 关 资 料报 道 ， 酒酵 母 的倍 增 时间与 根 啤
温度 的关系如下 ：
培养温度（ ３ ３ ２ ｌ ｌ １ ８ ℃） ６ ３ ８ ８ ２ ０ ６
一
生产 中提 供优 良、 强壮 的酵 母 ， 以保 证 正 常 生产 的进 行 和 良好 的 啤酒 质 量 。 能决 定 啤酒 品质 的是酵 母 ， 最 最 能影 响酿造 工艺 的和控 制 的也 是酵 母 ， 母 的扩 大 酵
温度与主发酵温度吻合， 整个培养过程在显微镜下
进行 ， 通过显微镜跟踪观察每株酵母细胞不同生长阶 段 的生长情况 ， 由此挑选 出优 良的、 强壮的菌株， 啤 酒酵母在显微镜下的形态特征大致如下图：
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口 『 像 品 与 簋 谚 ． １
Ｓ ｅ ｍｍ ｏ ｄ ａ ｄ Ｆ ｎｎ ｎ － ｏ， ｉｈ Ｆ ｏ ｎ ｅ ｅ ．ｄ ，
பைடு நூலகம்啤酒酵母扩大培养的研究
李 勤
（ 川工商 职业技 术学 院，都江堰 ６ ｌ ３ ） 四 ｌ ８ ０
摘要 ： 啤酒酵母的好坏直接影响啤酒的质量， 而啤酒酵母的扩大培养又是微生物工作的核心， 本文从酵母茵株的选择
兰州大学发酵实验啤酒发酵实验
系列实验Ⅱ---啤酒发酵实验一啤酒酵母的扩大培养一、实验目的学习酵母菌种的扩大培养方法，为啤酒发酵准备菌种。
二、实验原理在进行啤酒发酵之前，必须准备好足够量的发酵菌种。
在啤酒发酵中，接种量一般应为麦芽汁量的10%<使发酵液中的酵母量达1×107个酵母/mL），因此，要进行大规模的发酵，首先必须进行酵母菌种的扩大培养。
扩大培养的目的一方面是获得足量的酵母，另一方面是使酵母由最适生长温度<28℃）逐步适应为发酵温度<10℃）。
三、实验器材恒温培养箱，生化培养箱，显微镜等。
四、实验步骤本次实验每个小组大约用3.5升麦芽汁，因此应制备50 mL麦芽汁三角瓶、550ml麦芽汁三角瓶，含1×108个酵母/mL的菌种，以每次实验4个组计算，每个组应制备约500 mL菌种。
建议流程如下：1. 培养基的制备取协定法制备的麦芽汁滤液加水定容至糖度为10BX，取50 mL装入250 mL 三角瓶中，每个小组三瓶，包上瓶口布后，0.05 Mpa灭菌30分钟。
取550ml麦芽汁装入1000ml三角瓶，每个小组6瓶，0.05 Mpa灭菌30分钟。
2. 菌种扩大培养按上面流程扩大培养菌种<斜面活化菌种由教师提供）。
注意无菌操作。
五、注意事项灭菌后的培养基会有不少沉淀，这不影响酵母菌的繁殖。
若要减少沉淀，可在灭菌前将培养基充分煮沸并过滤。
实验二麦芽汁糖度测定一、实验目的：学习用糖锤度计测定糖度的方法。
二、实验原理麦汁的好坏，将直接关系到啤酒的质量。
工业上一般根据啤酒品种的不同来制造不同类型的麦芽汁，因此及时分析麦芽汁的质量，调整麦芽汁制造工艺显得尤为重要。
麦汁的主要分析项目有：麦汁浓度、总还原糖含量、氨基氮含量、酸度、色度、苦味质含量等。
一般分析项目应在麦汁冷却30分钟后取样。
样品冷却后，以滤纸过滤，滤液放于灭菌的三角瓶中，低温保藏。
全部分析应在24小时内完成。
为了调整啤酒酿制时的原麦汁浓度，控制发酵的进程，常常在麦汁过滤后、发酵过程中用简易的糖锤度计法测定麦汁的浓度。
生产现场酵母扩培技术
１ 分钟后 ， ５ 冷却至设定温度 １￣备用 。保持罐 ４（ ２
压 ０ ０ Ｍ ａ ．５ Ｐ 。
２２ 汉生罐接种 ． 接种前 ， 卡氏罐备压 阀连接 口、 卡氏罐备压 口、 汉生罐取样 阀的下 口、 氏罐 压培养液 阀的 卡 出口分别用酒精棉球火燃杀菌 ， 已杀菌的软管 用 分别连接卡氏罐备压 阀连接 口与卡 氏罐备压 口，
１５ 无 菌 风系 统蒸 汽杀菌 ． 在汉 生 罐 和一 级 扩 培 罐 进 行 蒸 汽 杀 菌 的 同 时完成 无 菌 风 管路 的杀 菌 。培 养 期 间无 菌 风 管 路每 ７天 杀 菌一 次 ， 菌 时 间 ３ 杀 ～５分 钟 ， 菌 结 杀
进行倒罐 。将培养液全部压入一级扩培罐 ， 倒罐
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・
５ ８・
康 迪 日用 化 工 有 限 公 司
孙 宝文
青岛啤酒第五有 限公司 ２ ６ ２ ６１ ０
公司酵母扩培设备是从丹麦引进， 这套 系统 由卡氏罐 、 汉生罐 、 一级扩培罐 、 二级扩培罐 、Ｉ Ｃ Ｐ 清洗系统组成 ， 温度 、 充氧、 清洗、 杀菌、 冷却实现 了全 自控。尤其实现 了对扩 培管线清洗杀菌 的 自动化 ， 避免 了扩培液倒 罐过 程带来 的细菌 污 染。几年的生产实践表明 ， 使用这套系统并规范 操作对稳定酵母扩培质量有着重要 意义。本文
后， 冷却至设定温度 １％备用。 ２
３２ 一级 扩培罐 培养 ．
倒入汉生罐扩培液后 ，２ １％进行培养 ， 每小时
通 风 ５分 钟 ， 一级 扩 培 罐 充 氧 前 将 无 菌风 流量 调 节 阀设定 刻 度 ４ ０～５ 。汉 生 罐 到 一 级 扩 培Βιβλιοθήκη 罐 扩 ０５ 发酵罐培养
接入 二级 扩培 罐 培 养 液 后 ， 入 １锅 麦 汁培 接 养 ２ 时 。再 入 ２锅麦 汁培 养 ２ 时 。最 后再 ４小 ４小 入 ３锅 麦 汁 。满 罐 温度 控 制 在 ８ ０～９ ０ ． ．℃。满 罐 后 自然升 温 至 发 酵 温 度 ９ １℃ ， 罐 后 ３ ０ 满 ６～ ３ 小 时 开 始 回收 Ｃ ２ ８ ０ 。发 酵 液 糖 度 降 至 ３ ２～ ． ３６ｐ时 封 罐 ， 力 控 制 在 ０ １ ．￣ 压 ． ６～ ０ ０Ｍ ａ ３ ． ８ Ｐ，
家酿啤酒基础知识分享之三：酵母的活化与扩培
家酿啤酒基础知识分享之三：酵母的活化与扩培时间：3⽉27⽇晚9点，期待更多的爱好者分享知识。
还有免费的啤酒可以喝昂！如果⼤家感兴趣，可扫描⼆维码（⼆维码见⽂末）进群参与分享课介绍。
讲课之前⾸先告诉⼤家，酵母活化和酵母扩培不是⼀个概念，后⾯的分享会有详细的介绍。
讲课之前⾸先告诉⼤家，酵母活化和酵母扩培不是⼀个概念，后⾯的分享会有详细的：活化酵母的操作（双准备）活化酵母的操作（双准备）：1第⼀步上⾯啤酒酵母（Ale）：提前将⼲净的⽔（不能是蒸馏⽔灭菌，调整⽔温⾄30～35℃，取出10倍酵母重量的⽔⾄⼲净⽆菌容器中，将所需酵母全部撒在⽔⾯上。
不得搅拌，静置15分钟（期间会有泡沫产⽣，有时没有，这些都不影响酵母质量）2第⼆步15分钟后，轻轻搅拌，使所有酵母都浸没在⽔中，再静置5分钟。
3第三步静置后，每五分钟向酵母浆中加⼊少量冷麦汁，轻轻搅拌，直⾄调整⾄酵母浆温度和冷麦汁的温差在10℃以内。
可每次去酵母浆⼗分之⼀体积的冷麦汁加⼊到酵母浆中，混匀后⽴即记录温度，直⾄酵母浆温度降⾄理想的接种温度。
4第四步调温后须⽴即接种。
在不损害酵母的情况下，麦汁可以不需要充氧。
以上均为产品截图上扒下来的，可以作为酵母活化的参考操作1、酵母的添加量（双准备）通过哪⼏个⽅⾯来确定酵母添加量? 添加过多过少会有什么影响 ?答：可通过酵母数量（每克⼲酵母的数量X克数）、酵母活性、麦汁量、麦汁浓度，来确定酵母添加量。
麦汁浓度⾼，麦汁量多，添加的酵母就多。
具体的加⼊酵母数量，在之前的《基础知识分享（⼆）》中有涉及，希望了解具体数值的可以参考之前的⽂章。
添加量：适宜的酵母添加量对保证发酵满⾜啤酒的风味要求⾮常重要。
添加量过多会减少酵母的增长，导致主酵⽣成较少的风味物质；同时形成的新酵母少，易造成酵母过早的衰⽼。
过低则可能使酵母的增殖倍数加⼤，起酵慢，时间长，易染菌。
酵母添加量以麦汁酵母数作为标准，不同麦汁浓度的酵母数可参考每种酵母的使⽤说明。
发酵微生物的扩大培养
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2，厌氧培养：对于酵母菌（啤酒，葡萄 酒，清酒等） 试管→三角瓶→卡式 罐→种子罐
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二、生产车间种子制备
• 实验室制备的孢子或液体种子移种至种 子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不 同菌种而异，但其原则为采用易被菌利 用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等 ，如果是需氧菌，同时还需供给足够的 无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体 在培养液中均匀分布，获得相同的培养 条件。
第四章
发酵微生物的扩大培养
1
本章内容
第一节 发酵工业微生物菌种
第二节 工业微生物菌种的分离和选育
第三节 发酵微生物扩大培养技术
第四节 发酵微生物菌种质量
第五节 发酵微生物菌种的保藏
2
第一节 发酵工业微生物菌种 一、工业发酵对微生物菌种的要求
我们把用于发酵工业的微生物也叫做工业微生物。 工业微生物具备个体小、种类多、繁殖快、分布广、代谢 强和易变异等特点。 发酵工程是以微生物的生命活动为中心的，各种发酵生产 都必须有相应的微生物。 所以微生物对于发酵过程就十分 重要。 微生物菌种能否满足工业生产的实际需求，是否有工业生 产价值是极为重要的。
相对湿度（%） 斜面外观 16.5-19 上部稀薄,下部略黄 25-36 上部薄,中部均匀发白 40-45 一片白,孢子丰富
活孢子计数(亿/支) 1.2 2.3 5.7
22
25
3，培养时间和冷藏时间
（1）培养时间 • 一般来说，衰老的孢子不如年轻的孢子 ，因为衰老的孢子已在逐步进入发芽阶 段，核物质趋于分化状态。过于衰老的 孢子会导致生产能力的下降。 • 措施：孢子培养的时间应该控制在孢子 量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段 终止培养。
3
啤酒发酵实验分析
实验室啤酒发酵一、实验目的：熟悉静止培养操作，观察啤酒发酵过程，掌握发酵过程中一些指标的分析操作技能。
二、实验原理：啤酒酵母将麦芽汁发酵，产生酒精等发酵产物（啤酒）。
三、实验器材：⑴. 100升发酵罐。
⑵. 0~10O BX糖度表。
(3).10℃-30℃可调生化培养箱。
培养基：⑴.麦芽汁发酵培养基10Plato, 50升，糖化制取。
⑵.麦芽汁琼脂培养基：麦芽汁加2％琼脂，自然pH。
⑶.麦芽汁液体培养基：酵母扩大培养用。
菌种：啤酒生产用酵母菌株。
四、实验步骤：（1）麦汁制备（2）酵母菌种分离纯化与质量鉴定（3）菌种扩大培养（4）啤酒主发酵：麦汁50升，10O BX ，11℃→接种量1.5×107个细胞/mL →主发酵，11℃，5~7天→至4.0O BX时结束（嫩啤酒）。
在主发酵过程中，每天测定下列项目：糖度、细胞浓度、出芽率、染色率、酸度、α-氨基氮、还原糖、酒精度、pH、双乙酰。
然后以时间为横坐标，这些指标为纵坐标，叠画于方格纸上。
（5）后发酵五、作业要求（1）. 画出发酵周期中上述上述指标的曲线图，并解释它们的变化。
（2）. 记下操作体会与注意点。
实验一协定法糖化试验一、实验目的：协定法糖化试验是欧洲啤酒酿造协会（EBC）推荐的评价麦芽质量的标准方法，我们用该法进行小量麦芽汁制备，并借此评价所用麦芽的质量。
二、实验原理：利用麦芽所含的各种酶类将麦芽中的淀粉分解为可发酵性糖类，蛋白质分解为氨基酸（具体参见理论部分第二节）。
三、实验器材和试剂：1 实验室糖化器：由水浴和500~600 mL的烧杯组成糖化仪器，杯内用玻棒搅拌或用100℃温度计作搅拌器（此时搅拌应十分小心，以免敲碎水银头）。
实验时杯内液面应始终低于水浴液面。
最好采用专用糖化器：该仪器有一水浴，水浴本身有电热器加热和机械搅拌装置。
水浴上有4~8个孔，每个孔内可放一糖化杯，糖化杯由紫铜或不锈钢制成，每一杯内都带有搅拌器，转速为80~100转/分，搅拌器的螺旋桨直径几乎与糖化杯同，但又不碰杯壁，它离杯底距离只有1~2 mm。
微生物菌种的扩大培养技术！
微⽣物菌种的扩⼤培养技术！微⽣物菌种的扩⼤培养技术！⼀、种⼦扩⼤培养的任务⼯业⽣产规模越⼤，每次发酵所需的种⼦就越多。
要使⼩⼩的微⽣物在⼏⼗⼩时的较短时间内，完成如此巨⼤的发酵转化任务，那就必须具备数量巨⼤的微⽣物细胞才⾏。
菌种扩⼤培养的⽬的就是要为每次发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种⼦。
因为发酵时间的长短和接种量的⼤⼩有关，接种量⼤，发酵时间则短。
将较多数量的成熟菌体接⼊发酵罐中，就有利于缩短发酵时间，提⾼发酵罐的利⽤率，并且也有利于减少染菌的机会。
因此，种⼦扩⼤培养的任务，不但要得到纯⽽壮的菌体，⽽且还要获得活⼒旺盛的、接种数量⾜够的菌体。
对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种⽣长繁殖速度快慢决定种⼦扩⼤培养的级数，抗⽣素⽣产中，放线菌的细胞⽣长繁殖较慢，常常采⽤三级种⼦扩⼤培养。
⼀般50 t发酵罐多采⽤三级发酵，有的甚⾄采⽤四级发酵，如链霉素⽣产。
有些酶制剂发酵⽣产也采⽤三级发酵。
⽽⾕氨酸及其他氨基酸的发酵所采⽤的菌种是细菌，⽣长繁殖速度很快，⼀般采⽤⼆级发酵。
⼆、种⼦制备的过程1、孢⼦制备孢⼦制备是种⼦制备的开始，是发酵⽣产的⼀个重要环节。
孢⼦的质量、数量对以后菌丝的⽣长、繁殖和发酵产量都有明显的影响。
不同菌种的孢⼦制备⼯艺有其不同的特点。
放线菌孢⼦的制备 放线菌的孢⼦培养⼀般采⽤琼脂斜⾯培养基，培养基中含有⼀些适合产孢⼦的营养成分，如麸⽪、豌⾖浸汁、蛋⽩胨和⼀些⽆机盐等。
碳源和氮源不要太丰富(碳源约为1％，氮源不超过0.5％)，碳源丰富容易造成⽣理酸性的营养环境，不利于放线菌孢⼦的形成，氮源丰富则有利于菌丝繁殖⽽不利于孢⼦形成。
⼀般情况下，⼲燥和限制营养可直接或间接诱导孢⼦形成。
放线菌斜⾯的培养温度⼤多数为28 ，少数为37 ，培养时间为5～14天。
采⽤哪⼀代的斜⾯孢⼦接⼊液体培养，视菌种特性⽽定。
采⽤母斜⾯孢⼦接⼊液体培养基有利于防⽌菌种变异，采⽤⼦斜⾯孢⼦接⼊液体培养基可节约菌种⽤量。
菌种扩大培养技术
谷氨酸菌斜面
赖氨酸菌斜面
与
三角瓶培养
三角瓶培养
菌
种
特
30m3种子罐培养
3m3种子罐培养
性
有 关
300m3发酵罐发酵
30m3种子罐培养
300m3发酵罐发酵
（三）种子扩大培养的阶段
实验室种子制备阶段
生产车间种子制备阶段
实验室种子制备阶段一般包括斜面种子的培养、实验室内 进行的固体或液体培养基的种子扩大培养。 在无菌操作条件下，将试管斜面接种到摇瓶中，经恒温振 荡培养形成大量菌体的过程，称为摇瓶培养。
实例二： 葡萄糖 45g/L，MgSO4·7H2O 0.7 g/L ， 磷酸二氢钾 1.5 g/L ，糖蜜 125g/L ， 玉米浆 250g/L，纯生物素18.8 μg/L， 硫酸亚铁、硫酸锰 各2ppm ，实消， 121℃保温10min，实消前不需调节pH， 实消降温后用液氨调节至pH7.0。
2. 培养条件
接种量 培养温度
0.03~0.5% 32~34℃
种子罐有夹套或盘管或列管等装置。 采用循环冷却水进行降温。
搅拌转速
150~200 r/min
根据种子罐容积和搅拌叶径而定，通常容积大的种子罐 设计搅拌速度会小一些。
通气比
0.15~0.44 vvm
vvm ：1m3液体1min通入空气的体积。
OD 650 值
1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4
1
3
5
7
9 11 13
培养时间（小时）
流加液氨培养 添加尿素培养
实例一与实例二的培养结果， 说明了什么问题？
无菌空气
5. 二级种子接入发酵罐的操作
啤酒发酵实验
实验室啤酒发酵一、实验目的：熟悉静止培养操作,观察啤酒发酵过程,掌握发酵过程中一些指标的分析操作技能;二、实验原理：啤酒酵母将麦芽汁发酵,产生酒精等发酵产物啤酒;三、实验器材：⑴. 100升发酵罐;⑵. 0~10O BX糖度表;3.10℃-30℃可调生化培养箱;培养基：⑴. 麦芽汁发酵培养基10Plato, 50升,糖化制取;⑵. 麦芽汁琼脂培养基：麦芽汁加2％琼脂,自然pH;⑶. 麦芽汁液体培养基：酵母扩大培养用;菌种：啤酒生产用酵母菌株;四、实验步骤：1麦汁制备2酵母菌种分离纯化与质量鉴定3菌种扩大培养4啤酒主发酵：麦汁50升,10O BX ,11℃→接种量×107个细胞/mL →主发酵,11℃,5~7天→至时结束嫩啤酒;在主发酵过程中,每天测定下列项目：糖度、细胞浓度、出芽率、染色率、酸度、α-氨基氮、还原糖、酒精度、pH、双乙酰;然后以时间为横坐标,这些指标为纵坐标,叠画于方格纸上;5后发酵五、作业要求1. 画出发酵周期中上述上述指标的曲线图,并解释它们的变化;2. 记下操作体会与注意点;实验一协定法糖化试验一、实验目的：协定法糖化试验是欧洲啤酒酿造协会EBC推荐的评价麦芽质量的标准方法,我们用该法进行小量麦芽汁制备,并借此评价所用麦芽的质量;二、实验原理：利用麦芽所含的各种酶类将麦芽中的淀粉分解为可发酵性糖类,蛋白质分解为氨基酸具体参见理论部分第二节;三、实验器材和试剂：1 实验室糖化器：由水浴和500~600 mL的烧杯组成糖化仪器,杯内用玻棒搅拌或用100℃温度计作搅拌器此时搅拌应十分小心,以免敲碎水银头;实验时杯内液面应始终低于水浴液面;最好采用专用糖化器：该仪器有一水浴,水浴本身有电热器加热和机械搅拌装置;水浴上有4~8个孔,每个孔内可放一糖化杯,糖化杯由紫铜或不锈钢制成,每一杯内都带有搅拌器,转速为80~100转/分,搅拌器的螺旋桨直径几乎与糖化杯同,但又不碰杯壁,它离杯底距离只有1~2 mm;2 白色滴板或瓷板,玻棒或温度计;3滤纸,漏斗,电炉;4碘溶液,：克碘和5克碘化钾溶于水中,稀释到1000毫升;四、实验步骤1. 协定法糖化麦汁的制备1取50g麦芽,用植物粉碎机将其粉碎;2在已知重量的糖化杯500~600 mL烧杯或专用金属杯中,放入50g麦芽粉,加200mL 46~47℃的水,于不断搅拌下在45℃水浴中保温30分钟;3使醪液以每分钟升温1℃的速度,升温加热水浴,在25分钟内升至70℃;此时于杯内加入100 mL 70℃的水;470℃保温1小时后,在10~15分钟内急速冷却到室温;5冲洗搅拌器;擦干糖化杯外壁,加水使其内容物准确称量为450g;6用玻棒搅动糖化醪 ,并注于干漏斗中进行过滤,漏斗内装有直径20厘米的折叠滤纸,滤纸的边沿不得超出漏斗的上沿;7收集约100mL滤液后,将滤液返回重滤;过30分钟后,为加速过滤可用一玻棒稍稍搅碎麦槽层;将整个滤液收集于一干烧杯中;在进行各项试验前,需将滤液搅匀;2.糖化时间的测定⑴在协定法糖化过程中,糖化醪温度达70℃时记录时间,5分钟后用玻棒或温度计取麦芽汁1滴,置于白滴板或瓷板上,再加碘液1滴,混合,观察颜色变化;⑵每隔5分钟重复上述操作,直至碘液呈黄色不变色为止,记录此时间;由糖化醪温度达到70℃开始至糖化完全无淀粉反应时止,所需时间为糖化时间;报告以每5分钟计算：如 <10分钟10~15分钟15~20分钟等正常范围值浅色麦芽：15分钟内深色麦芽：35分钟内3.过滤速度的测定以从麦汁返回重滤开始至全部麦芽汁滤完为止所需的时间来计算,以快、正常和慢等来表示,1小时内完成过滤的规定为“正常”,过滤时间超过1小时的报告为“慢”;4.气味的检查糖化过程中注意糖化醪的气味;具有相应麦芽类型的气味规定为“正常’,因此对深色麦芽若有芳香味,应报以“正常”；若样品缺乏此味,则以“不正常”表示,其它异味亦应注明;5.透明度的检查麦汁的透明度用透明、微雾、雾状和混浊表示;6.蛋白质凝固情况检查强烈煮沸麦芽汁5分钟,观察蛋白质凝固情况;在透亮麦芽汁中凝结有大块絮状蛋白质沉淀,记录为“好”；若蛋白质凝结细粒状,但麦汁仍透明清亮,则记录为“细小”；若虽有沉淀形成,但麦芽汁不清,可表示为“不完全”；若没有蛋白质凝固,则记录为“无”;五、注意事项：粉碎最好用EBC粉碎机,若用1号筛粉碎,细粉约占90%,用2号筛粉碎细粉约占25%;对溶解度好的麦芽,建议用2号筛;因为细粉太多影响过滤速度;一般要求粗粒与细粒包括细粉的比例达1：以上;麦皮在麦汁过滤时形成自然过滤层,因而要求破而不碎;如果麦皮粉碎过细,不但会造成麦汁过滤困难,而且麦皮中的多酚、色素等溶出量增加,会影响啤酒的色泽和口味;但麦皮粉碎过粗,难以形成致密的过滤层,会影响麦汁浊度和得率;麦芽胚乳是浸出物的主要部分,应粉碎得细些;为了使麦皮破而不碎,最好稍加回潮后进行粉碎;六、思考题：糖化过程中麦芽中各种酶的作用;实验二啤酒酵母的扩大培养一、实验目的：学习酵母菌种的扩大培养方法,为实验室啤酒发酵准备菌种;二、实验原理：在进行啤酒发酵之前,必须准备好足够量的发酵菌种;在啤酒发酵中,接种量一般应为麦芽汁量的10%使发酵液中的酵母量达1×107个酵母/mL,因此,要进行大规模的发酵,首先必须进行酵母菌种的扩大培养;扩大培养的目的一方面是获得足量的酵母,另一方面是使酵母由最适生长温度28℃逐步适应为发酵温度10℃;三、实验器材：恒温培养箱,生化培养箱,显微镜等;四、实验步骤：本次实验拟用60升麦芽汁,因此应制备6000 mL含1×108个酵母/mL的菌种,以每班10个组计算,每个组应制备约600 mL菌种;建议流程如下：28℃,2天菌种扩大: 麦汁斜面菌种→麦汁平板——→镜检,挑单菌落3个,接种50mL麦汁试管或三角瓶—20℃,2天→550mL麦汁三角瓶—15℃,2天→计数备用;每天摇动3次每天摇动3次1 培养基的制备取协定法制备的麦芽汁滤液约400 mL,加水定容至约600 mL,取50 mL装入250 mL 三角瓶中,另550 mL至1000 mL三角瓶中,包上瓶口布后, Mpa灭菌30分钟;2 菌种扩大培养按上面流程进行菌种的扩大培养斜面活化菌种由教师提供;注意无菌操作;五、注意事项：灭菌后的培养基会有不少沉淀,这不影响酵母菌的繁殖;若要减少沉淀,可在灭菌前将培养基充分煮沸并过滤;六、思考题：菌种扩大过程中为什么要慢慢扩大,培养温度为什么要逐级下降;实验三麦芽汁的制备一、实验目的：熟悉麦芽汁的制备流程,为啤酒发酵准备原料;二、实验原理：麦汁制备包括原料糖化、麦醪过滤和麦汁煮沸等几个过程;由于麦芽的价格相对较高,再加上发酵过程中需要较多的糖,因此目前大多数工厂都用大米做辅料; 三、实验器材：在糖化车间一般有四种设备：糊化锅、糖化锅、麦汁过滤槽和麦汁煮沸锅,本实验由于受条件限制,只能采用单式设备,即将糊化锅、糖化锅和麦汁煮沸锅合而为一;四、实验步骤：1. 糖化用水量的计算糖化用水量一般按下式计算：W=A100—B/B式中B为过滤开始时的麦汁浓度第一麦汁浓度A为100Kg原料中含有的可溶性物质浸出物重量百分比W为100Kg原料麦芽粉所需的糖化用水量升;例：我们要制备60升10度的麦芽汁,如果麦芽的浸出物为75%,请问需要加入多少麦芽粉因为W=75100—10/10=675升即100Kg原料需675升水,则要制备60升麦芽汁,大约需要添加10Kg的麦芽和60升左右的水不计麦芽溶出后增加的体积;2. 糖化糖化是利用麦芽中所含的酶,将麦芽和辅助原料中的不溶性高分子物质,逐步分解为可溶性低分子物质的过程;制成的浸出物溶液就是麦芽汁;传统的糖化方法主要有两大类,1煮出糖化法：利用酶的生化作用及热的物理作用进行糖化的一种方法;2浸出糖化法：纯粹利用酶的生化作用进行糖化的方法;本实验采用浸出糖化法;推荐使用如下流程：35~37℃,保温30分钟--→50~52℃ 60分钟--→65℃ 30分钟至碘液反应基本完全--→76~78℃送入过滤槽;3. 麦汁过滤将糖化醪中的浸出物与不溶性麦糟分开,以得到澄清麦汁的过程;由于过滤槽底部是筛板,要借助麦糟形成的过滤层来达到过滤的目的,因此前30分钟的滤出物应返回重滤;头号麦汁滤完后,应用适量热水洗糟,得到洗涤麦汁;4. 麦汁煮沸将过滤后的麦汁加热煮沸以稳定麦汁成分的过程;此过程中可加入酒花一种含苦味和香味的蛇麻之花,每100升麦汁中添加约200克;煮沸的具体目的主要有：破坏酶的活性；使蛋白质沉淀；浓缩麦汁；浸出酒花成分；降低pH；蒸出恶味成分；杀死杂菌；形成一些还原物质;添加酒花的目的主要有：赋予啤酒特有的香味和爽快的苦味；增加啤酒的防腐能力；提高啤酒的非生物稳定性;将过滤的麦汁通蒸汽加热至沸腾,煮沸时间一般控制在~2小时,蒸发量达15~20%蒸发时尽量开口,煮沸结束时,为了防止空气中的杂菌进入,最好密闭;0.回旋沉淀及麦汁预冷却：将煮沸后的麦汁从切线方向泵入回旋沉淀槽,使麦汁沿槽壁回旋而下,借以增大蒸发表面积,使麦汁快速冷却,同时由于离心力的作用,使麦汁中的絮凝物快速沉淀的过程; 1.麦汁冷却将回旋沉淀后的预冷却麦汁通过薄板冷却器与冰水进行热交换,从而使麦汁冷却到发酵温度的过程;7.设备清洗由于麦芽汁营养丰富,各项设备及管阀件包括糖化煮沸锅、过滤槽、回旋沉淀槽及板式换热器使用完毕后,应及时用洗涤液和清水清洗,并蒸汽杀菌;五、注意事项：1. 若加热、煮沸过程中将蒸汽直接通入麦汁中,则由于蒸汽的冷凝;麦汁量会增加,因此最好用夹套加热的方法;2. 麦汁煮沸后的各步操作应尽可能无菌,特别是各管道及薄板冷却器应先进行杀菌处理;六、思考题：麦芽粉碎程度会对过滤产生怎样的影响实验四啤酒主发酵一、实验目的：学习啤酒主发酵的过程,掌握酵母发酵规律;二、实验原理：啤酒主发酵是静止培养的典型代表;是将酵母接种至盛有麦芽汁的容器中,在一定温度下培养的过程;由于酵母菌是一种兼性厌氧微生物,先利用麦芽汁中的溶解氧进行好氧生长,然后利用EMP途径进行厌氧发酵生成酒精;显然,同样体积的液体培养基用粗而短的容器盛放比细而长的容器氧更容易进入液体,因而前者降糖较快所以测试啤酒生产用酵母菌株的性能时,所用液体培养基至少要米深,才接近生产实际;定期摇动容器,既能增加溶氧,也能改善液体各成份的流动,最终加快菌体的生长过程;这种有酒精产生的静止培养比较容易进行,因为产生的酒精有抑制杂菌生长的能力,容许一定程度的粗与酒精的产生,比重不断下降,可用糖度表监视;若需放操作;由于培养基中糖的消耗,CO2分析其他指标,应从取样口取样测定;三、实验器材：带冷却装置的发酵罐50L,100L,若无发酵装置,可将玻璃缸放于生化培养箱中进行微型静止发酵;四、实验步骤：将糖化后冷却至10℃左右的麦芽汁送入发酵罐,接入酵母菌种实验四,共约5升,然后充氧,以利酵母菌生长,同时使酵母在麦汁中分散均匀充氧,即通入无菌空气,也可在麦汁冷却后进行,一般温度越低,氧在麦汁中的溶解度越大,待麦汁中的溶解氧饱和后,让酵母进入繁殖期,约20小时后,溶解氧被消耗,逐渐进入主发酵;由于发酵罐密闭,很难看清发酵的整个过程,建议一个组在1000 mL玻璃缸中进行啤酒主发酵小型试验;具体方法如下：1、洗标本缸,缸口用8层纱布包扎后,进行高压灭菌；2、将协定法糖化得到的麦汁,加水至600 mL,再加葡萄糖使糖度达到10 Bx,灭菌,冷却后摇动充氧,沉淀,将上清液以无菌操作方式到入已灭菌的标本缸中;3、将50mL酵母菌种接入,在10℃生化培养箱中发酵,每天观察发酵情况;4、主发酵： 10℃,7天→至 plato时结束嫩啤酒;一般主发酵整个过程分为酵母繁殖期,起泡期、高泡期、落泡期和泡盖形成期等五个时期;仔细观察各时期的区别;主发酵测定项目接种后取样作第一次测定,以后每过12或24h测1次直至结束;全部数据叠画在1张方格纸上,纵坐标为7个指标,横坐标为时间;共测定下列几个项目：a、糖度用糖度表测,并换算成plato；b、细胞浓度、出芽率、染色率；c、酸度d、α-氨基氮e、还原糖f、酒精度g、pHh、色度I、浸出物浓度J、双乙酰含量6、作业要求⑴. 画出发酵周期中上述10个指标的曲线图,并解释它们的变化;⑵. 记下操作体会与注意点附：发酵液的取样方法若在发酵罐中发酵,可从取样开关处直接取样先弃去少量发酵液;若无取样开关,可用一灭过菌的乳胶管,深入发酵池面下20cm处,用虹吸法使发酵液流出,,弃去少量先流出的发酵液,然后用一清洁干燥的三角瓶接取发酵液作样品;五、注意事项：除少数特殊的测定项目外,应将发酵液在两干净的大烧杯中来回倾到50次以上,以除去CO2,再经过滤后,滤液用于分析;分析工作应尽快完成;实验五α–氨基氮含量的测定一、实验目的：学习α–氨基氮含量的测定方法,控制麦汁或啤酒质量;二、实验原理：α–氨基氮为α–氨基酸分子上的氨基氮;水合茚三酮是一种氧化剂,可使氨基酸脱羧氧化,而本身被还原成还原型水合茚三酮;还原型水合茚三酮再与末还原的水合茚三酮及氨反应,生成蓝紫色缩合物,颜色深浅与游离α–氨基氮含量成正比,可在570nm下比色测定;三、实验器材与试剂：分光光度计,电炉等1显色剂称取10g Na2HPO4·12H2O ,6g KH2PO4,水合茚三酮,果糖,用水溶解并定容至100mLpH ~,棕色瓶低温保存,可用两周;2碘酸钾稀释液溶碘酸钾于60mL水中,加40mL 95％乙醇;3标准甘氨酸贮备溶液准确称取甘氨酸,用水溶解并定容至100 mL,0℃保存;用时100倍稀释;四、实验步骤1样品稀释适当稀释样品至含1~3μgα–氨基氮/mL麦汁一般稀释100倍,啤酒50倍,啤酒应先除气;2测定取9支10mL比色管,其中3支吸入2mL甘氨酸标准溶液,另3支各吸入2mL 试样稀释液,剩下3支吸入2mL蒸馏水;然后各加显色剂1 mL,盖玻塞,摇匀,在沸水浴中加热l 6分钟;取出,在20℃冷水中冷却20分钟,分别加5mL碘酸钾稀释液,摇匀;在30分钟内,以水样管为空白,在570nm波长下测各管的光密度;计算：α–氨基氮含量μg/mL=样品管平均./标准管平均.×2×稀释倍数说明：式中样品管平均./标准管平均.：表示样品管与标准管之间的α–氨基氮之比；2：标准管的α–氨基氮浓度μg/mL,即×14/75×100；五、注意事项：1必须严防任何外界痕量氨基酸的引入,所用比色管必须仔细洗涤,洗净后的手只能接触管壁外部,移液管不可用嘴吸;2测定时加入果糖作为还原性发色剂,碘酸钾稀释液的作用是使茚三酮保持氧化态,以阻止进一步发生不希望的生色反应;3深色麦汁或深色啤酒应对吸光度作校正：取2mL样品稀释液,加1mL蒸馏水和5mL 碘酸钾稀释液在570n m波长下以空白做对照测吸光度,将此值从测定样品吸光度中减去;一、思考题：啤酒色泽是否会对结果产生影响附：分光光度计的使用：现以SP-2000UV紫外可见分光光度计为例介绍使用方法;a)接通电源,预热20分钟,使仪器进入热稳定状态,仪器开始自检；b)自检结束后,仪器自动停留在546nm处,并自动调100%T和0%T,当仪器显示“546”“100%T”,即进入测试状态；c)按方式键MODE,将测试方式设定为吸光度方式,仪器显示“XXXnm,”d)按波长设置键至所需要波长,如570nm；e)将参比溶液和被测溶液分别倒入比色杯中,插入比色槽中,盖上样品室盖；f)将参比溶液推入光路中,按“100%T”键调整“0Abs”；g)将被测溶液推入光路中,读取显示器上的吸光度值；h)搞好清洁卫生工作;注意：比色杯贵重,应格外小心;实验六酸度和pH的测定一、实验目的：掌握酸度和pH的测定方法,监测啤酒发酵的进程;二、实验原理：总酸是指样品中能与强碱NaOH作用的所有物质的总量,用中和每升样品滴定至pH 所消耗的1N NaOH的毫升数来表示,但在啤酒发酵液的测定过程中常用中和100mL除气发酵液所需的1N NaOH的毫升数来表示;啤酒中含有各种酸类约100种以上,生产原料、糖化方法、发酵条件、酵母菌种都会影响啤酒中的酸含量;其中包括挥发性的甲酸、乙酸,低挥发性的C3、C4、异C4、异C5、C6、C8、C10等脂肪酸和不挥发性的乳酸,柠檬酸,琥珀酸,苹果酸以及氨基酸,核酸,酚酸等各种酸类;适宜的pH和适量的可滴定总酸,能赋于啤酒以柔和清爽的口感；同时这些酸及其盐类也是酒中重要的缓冲物质,有利于各种酶的作用;由于样品有多种弱酸和弱酸盐,有较大的缓冲能力,滴定终点pH变化不明显,再加上样品有色泽,用酚酞做指示剂效果不是太好,最好采用电位滴定法;三、实验器材与试剂：自动电位滴定仪,或普通碱式滴定管,pH计;1 mol/L NaOH 标准溶液精确至 mol/L2％酚酞指示剂：酚酞溶于50%的中性酒精普通酒精常含有微量的酸,可用L NaOH溶液滴定至微红色即为中性酒精中,定容至100mL;四、实验步骤1．酸度测定取50mL除气发酵液,置于烧杯中,加入磁力搅拌棒,放于自动电位滴定仪上,插入pH 探头,逐滴滴入 mol/L NaOH 标准溶液,直至pH ,记下耗去的NaOH毫升数;若无自动电位滴定仪,可用下述酸碱滴定方法;取5mL除气发酵液,置于250mL三角瓶中,加50mL蒸馏水,再加1滴酚汰指示剂,用L 氢氧化钠标准溶液滴定至微红色不可过量经摇动后不消失为止,记下消耗的氢氧化钠溶液的体积VmL,计算总酸1 mol/L NaOH 毫升数／100mL样品= 20MV式中 M为 NaOH的实际摩尔浓度,V为消耗的氢氧化钠溶液的体积2．pH测定现以PHS-3C型精密pH计为例来说明pH的测定方法;PHS-3C型pH计是一种精密数字显示pH计,它采用3位半十进制LED数字显示;在使用前应在蒸馏水中浸泡24小时;接通电源后,先预热30分钟,然后进行标定;一般说来,仪器在连续使用时,每天要标定一次;（1）选择开关旋至pH档；2调节温度补偿至室温；3把斜率调节旋纽顺时针旋到底即调到100%位置4将洗净擦干的电极插入的缓冲液中,调节定位旋纽至；5用蒸馏水清洗电极,擦干,再插入的标准缓冲液中,调节斜率至；6重复4,5,直至不用再调节定位和斜率两旋纽为止;7清洗电极,擦干,将电极插入发酵液中,摇动烧杯,使均匀接触,在显示屏中读出被测溶液的pH值;8关闭电源,清洗电极,并将电极保护套套上,套内应放少量补充液以保持电极球泡的湿润,切忌浸泡于蒸馏水中;五、注意事项发酵液中的二氧化碳必须彻底去除;L NaOH必须经过标定,保留4位有效数;六、思考题：酸碱滴定时为什么要用水稀释水的酸碱度对滴定结果有什么影响实验七色度的测定一、实验目的：了解用目视比色法测定啤酒色度的方法,监测发酵液的质量;二、实验原理：色泽与啤酒的清亮程度有关,是啤酒的感官指标之一;啤酒依色泽可分为淡色、浓色和黑色等几种类型,每种类型又有深浅之分;淡色啤酒以浅黄色稍带绿色为好,给入以愉快的感觉;形成啤酒颜色的物质主要是类黑精、酒花色素、多酚、黄色素以及各种氧化物,浓黑啤酒中还有多量的焦糖;淡色啤酒的色素主要取决于原料麦芽和酿造工艺,深色啤酒的色泽来源于麦芽,另外也需添加部分着色麦芽或糖色；黑啤酒的色泽则主要依靠焦香麦芽、黑麦芽或糖色所形成;造成啤酒色深的因素有如下几种：1麦芽煮沸色度深,2糖化用水pH偏高,3糖化、煮沸时间过长4洗糟时间过长,5酒花添加量大、单宁多,酒花陈旧,6啤酒含氧量高．7啤酒中铁离子偏高;对淡色啤酒来说,其颜色与稀碘液的颜色比较接近,因此可用稀碘液的浓度来表示;色度的Brand单位就是指滴定到与啤酒颜色相同时100mL蒸馏水中需添加的L碘液的毫升数;淡色啤酒的色度最好在5~,要控制好啤酒的色度,应注意以下几点：1选择麦汁煮沸色度低的优质麦芽,适当增加大米用量,使用新鲜酒花,选用软水,对暂硬高的水应预先处理;2糖化时适当添加甲醛,调酸控制pH,尤其煮沸时应控制;3严格控制糖化、过滤、麦汁煮沸时间,不得延长,冷却时间宜在60分钟;4防止啤酒吸氧过多,严格控制瓶颈空气含量,巴氏灭菌时间不能太长;三、实验器材：100mL比色管,白瓷板,吸管等碘标准溶液：经标定,精确至;四、实验步骤：1 取2支比色管,一支中加入100mL蒸馏水,另一支中加入100mL除气啤酒发酵液或麦芽汁,或啤酒,面向光亮处,立于白瓷板上;2 用1mL移液管吸取碘液,逐滴滴入装水比色管中,并不断用玻棒搅拌均匀,直至从轴线方向观察其颜色与样品比色管相同为止,记下所消耗的碘液毫升数准确至小数后第二位V;3 样品的色度=10NV;五、注意事项：1若用50mL比色管,结果乘以2；（1）不同样品须在同等光强下测定,最好用日光灯或北部光线,不可在阳光下测定;（2）麦汁应澄清,可经过滤或离心后测定;六、思考题：对色泽较深的麦汁,应怎样处理附表：EBC法与Brand法色度单位的比较部分实验八苦味质的测定一、实验目的：了解用分光光度计测定苦味质的方法,监测发酵液的质量;二、实验原理：发酵液或啤酒中苦味物质的主要成分是异α-酸,在酸性条件下可被异辛烷萃取,在275 nm波长下有最大吸收值,可用紫外分光光度计测定;三、实验器材：紫外分光光度计,离心机,回旋振荡器等试剂：6N HCl：270mL HCl用重蒸馏水稀释至500mL.异辛烷：光谱级,要求在275nm下的吸光度低于,否则应按下法提纯后再用：在异辛烷中加入1%w/v氢氧化钠颗粒,静置过夜,而后在通风柜中蒸馏,注意防火;四、实验步骤：1取 20℃麦汁或除气啤酒混浊样品须先通过离心澄清,放入35mL离心管中；2加入 6N HCl和20mL异辛烷,防入2-3个玻璃珠,盖上盖子,在20℃回旋振荡器130转/分钟中振荡15分钟；33000转/分钟离心3分钟4以异辛烷作对照,在275nm下用1cm石英比色杯测上层清液的吸光度;计算：苦味质=A27550 个单位五、注意事项：1异辛烷提纯时,要在通风柜中蒸馏,注意防火,切勿蒸干；2啤酒或发酵液应将气除尽;六、思考题：对浑浊样品是否可通过过滤来澄清实验九二氧化碳含量的测定一、实验目的：熟悉测定啤酒及发酵液中CO2含量的方法;二、实验原理：二氧化碳是赋予啤酒起泡性和杀口力的重要物质,发酵液或啤酒中CO2含量的测定方法有压力表法、水银测压计法及电位滴定法等几种;电位滴定法是利用CO2可被 NaOH吸收生成NaCO3这一原理,用HCl来滴定生成的NaCO3;滴定至pH 时,NaCO3转变成NaHCO3:NaCO3 + HCl →NaHCO3+ NaCl。
啤酒酵母扩培和回收使用要点
息机ｌ １ ￣ ３ ． ３ １ ７ ８ Ｗ０ 、３ １ ６ ｔ ． １ ４ ７＇ Ｒ ＊ ｉ Ｘ，３ １ ７ ￣６ １ １ Ｈ ｍ ａ － 棚 怕 ｏ ｒ Ｉ 由ｇ 豫 １ ∞
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４ ９ ・
温度控制系统没有调节好 ；加热器 内部加热管
（ ２ ） 酵 母 收 量 ：一 般 来 说 ，酵母 回收 比例
（ ３ ） 显微镜检查 回收酵母形态应与原来的菌种形态一致 ，
如果 出现 拉长 ，小 细胞是 非 正常现 象 。另外 注
意细胞质内容物，细胞壁状态等 ，以判断酵母
是 否处 在 生长 旺盛 的强壮 时期 。
６ ）喷水管喷水量小
原因 ： 水 管入 各连 接处 漏水 ，压入 接 头 处 脱 开或 损 坏而 漏水 ；水 箱 内水位 太低 使水 泵 压
力不足造成喷水量时大时小 ：吸滤管的孔被污
物塞 住 ，使泵 吸不 够水 。
１ ）操作人员润滑部分 ，润滑后在 岗位记 录中填写，设备维修人员进行监督检查。
３ ）半年 维 护和保 养 拆下 喷水 管进行 清 洗 ：检 查塑 料板 的磨 损 情 况 ：检 查辊 子轴承 座 间 隙 ：￣ Ｊ ｔ ｔ ， ｂ地清洗 箱 上
的全部过滤器 ，更换损坏的过滤器。 ４ ）每年维护与保养 检查辊轮和斜楔块表面 ：检查各加热器是
否有 污垢 ，如 有结 石现 象则 要除 垢 。 ４设 备润 滑管 理制 度
发酵过程中，每天检测悬浮酵母数 ，画出
酵 母 数 变 化 曲线 。高 泡 期酵 母 数 在 （ ５～ ８ ） ×１ ０ 个 ／ｍＬ以 上 ，随着 温 度 较 低 ，悬 浮 酵 母数 逐 渐减 少 ，可 降至 １ ×１ ０ 个 ／ｍＬ以下 ， 这 样 回收酵 母一 定不 会 少 。如果 酵母 数 降不 下
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发酵时生理现象 发酵终了，大量细胞悬浮在液面
能将棉子糖分解蜜二糖和果糖， 能全部发酵棉子糖 只 含有蜜二糖酶，能发酵蜜二糖 不能生长 不能
凝聚性酵母与粉状酵母的区别
表 5-2 区别内容 发酵时情况 发酵终了 发酵液澄清情况 发酵度 凝聚性酵母与粉状酵母的区别 凝集酵母 酵母易于凝集沉淀(下面酵母)或凝集 后浮于液面(上面酵母) 很快凝集，沉淀密致，或于液面形成密 致的厚层 较快 较低 长时间地悬浮在发酵液中， 很难沉淀 不易 较高 粉状酵母 不易凝集
麦汁浓度（%） 8~10 酒花 无
培养温度（℃） 25~27 培养时间（d） 扩大倍数 2~3 －
六、啤酒酵母的检查
啤酒酵母的检查
形态观察 凝聚性
生理特性试验
酵母死亡及自溶 发酵度
发酵速度 死来温度 产孢子能力
死来温度 对维生素的需要 酒的风味
影响酵母死亡或自溶的因素
麦芽组成 溶解氧 酵母添加量 温度 压力 杂菌 冲洗时间
啤酒酵母
发酵类型
凝聚性上面酵母Fra bibliotek下面酵母
凝聚性酵母
粉状酵母
上面酵母与下面酵母主要区别
表 5-1
区别内容 细胞形态 发酵温度 对棉子糖发酵 对蜜二糖发酵 37℃培养 利用酒精生长
上面酵母与下面酵母的区别
上面酵母 下面酵母 多呈卵圆形，细胞较分散 发酵终了，大部分酵母凝集而沉淀器底 5～12℃
多呈圆形，多数细胞集结在一起 15～25℃ 能发酵 1/3 果糖部分 缺乏蜜二糖酶，不能发酵蜜二糖 能生长 能
汉生罐保藏
压榨酵母保藏
泥状酵母保藏
发酵液保藏
五、啤酒酵母菌的扩大培养
斜面试管→富氏瓶培养→ 巴氏瓶培养→ 大三角瓶培养→卡氏罐培养→汉森罐培养 →酵母扩大培养罐 →酵母繁殖槽→ 主发酵池
2.啤酒酵母的扩大培养条件
扩培过程 容量 装麦汁量 富氏瓶 20 ml 10 ml 巴氏瓶 500~1000ml 250~500ml 8~10 无 20~25 2~3 25 卡氏罐 10~20L 5~10L 10~12 有 15~20 4~6 20 汉森罐 150~250L 100~200L 10~12 有 10~15 4~6 20
三、啤酒酵母的选育
（一）、优良啤酒酵母菌的基本要求
1、能有效地从麦汁中摄取所需要的各种营养物质，发酵速度
快
2、能代谢产生CO2、乙醇及能赋予啤酒良好风味的物质
3、发酵完毕后，分离容易，使发酵液澄清快
（二）、啤酒酵母性能的影响因素
啤酒酵母性能 影响因素
环境条件
遗传因子
麦汁的组成
发酵温度
发酵容器的 结构形状
课后小结
酵母菌的生物学特性 酵母菌的分类 酵母菌的菌种选育和保藏 酵母菌的扩大培养 酵母菌的品质检查
作业
课外阅读：啤酒酵母的扩大培养
教学目的：
了解啤酒酵母的分类 熟悉啤酒酵母的生长规律 掌握啤酒酵母的扩培步骤及技术要求 掌握啤酒酵母的质量评价及保藏方法
教学重难点： 啤酒酵母的扩培及质量评价
一、啤酒酵母的基本生物学特性
酵母菌的生长规律
细活 胞酵 数母 延 滞 期 对 数 生 长 期
减 速 期
稳 定 期
衰 亡 期
二、啤酒酵母及分类
通风量
（三）啤酒酵母选育主要途径
菌种筛选时应考虑因素： 发酵速度 发酵度 酵母的凝聚性 酵母的生长速度 酵母的稳定性 产生的风味物质
啤酒酵母的选育 主要途径
从自然界中直接 筛选目的菌株
诱变育种
原生质体融合
基因工程方法
四、啤酒酵母的保藏
保藏法
纯种原菌 的保藏
生产用菌 的保藏
固体斜面保藏
液体试管保藏