优选细胞的培养及转染
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优选细胞的培养及转染
Sf-9细胞的形态
培养细胞生长的条件
• 1、细胞的营养需要 • 2、细胞的生存环境
温度: 28℃ 氧 pH: 7.2-7.4 渗透压 • 3、无污染 • 4、无毒
实验材料：
• 实验用品： • 超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤
器，酸缸 • 生化培养箱 • 倒置显微镜 • 酶标仪、微孔板震荡器 • 液氮罐 • 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 • 耗材： • 培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板， 冻存管
Sf9传代的方法
• 3）接种在新的培养瓶皿内。一般接种两个或者多 个培养瓶皿内。
•
有时候，传代仅为了使培养物经历并适应传
代处理过程，在培养物细胞数量不大的情况下，
传代时还只是接种在一个培养瓶皿内。加入培养
液。（平时不做实验时，只需要传一瓶）。
• （以1：5或更多为宜，每2-3天传代一次） 28℃培养（不用CO2培养箱）。
• 化学
– 包括：①DEAE-葡聚糖法②磷酸钙法③人工脂 质体法
• 物理
– 包括：①显微注射②电穿孔③基因枪
• *Bacmid
Bawenku.baidu.com-to-Bac expression system
• 杆状病毒表达系统（Baculovirous Expression Vector System,BEVS）与细菌， 酵母，哺乳动物细胞一起被公认为当今世 界的基因工程的四大表达系统。
特点
• 能对高效表达的蛋白质进行较完善的翻译后加工，如糖基 化，磷酸化，酰基化，信号肽的切除等；
• 与其他真和细胞表达系统相比能获得重组蛋白的高水平表 达，最高甚至可达到细胞总蛋白的50%；
• 对脊椎动物无感染性，并且也已经证明它们的启动子在大 多数的哺乳动物细胞中也是没有活性的，因此这对于表达 一些致癌基因和潜在的毒蛋白比其他的表达系统更有优势；
– 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不 致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会 造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程 应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰 晶的重结晶。
慢冻程序
• 标准程序：
•
当温度在-25 ℃以上时， 1～2 ℃/min
•
当温度达-25 ℃以下时， 5～10 ℃/min
•
当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中细胞冻存
• 简易程序：
•
将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系
以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按
每分钟温度下降1～2 ℃的速度，在40分钟内降至 液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。
细胞复苏方法
• （1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～ 38 ℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。
• Sf9的分裂周期大概是27小时左右
Sf9传代的方法
• 1）吸取或者倾出旧培养液。 • 2）加入一定量的新培养基，用吸管吸取培养液，
反复吹打瓶皿底壁，使半贴壁的细胞脱离瓶皿底 壁。 • 吹打过程须有序进行，亦即要从一边开始到另 一边结束，尤其是器皿的边缘地带和四角处，确 保瓶皿底壁各处的细胞均被吹打脱离。吹打时动 作不宜过猛，吹出液体的力度要适中，否则会直 接损伤细胞并产生能伤害细胞的气泡。或者使细 胞碎片增多。 • 经吹打后，得到细胞悬液。
• 2）箱内灭菌蒸馏水3000ml蒸馏 水槽中以保持箱内湿度，避免培 养液蒸发。
培养瓶
拿培养瓶的正确姿势：拇指和食指夹住培养瓶， 瓶口向外，中指托住瓶底。保持瓶子的水平， 防止培养液倒向瓶口。
血球计数板
细胞冻存和复苏
• 冻存和复苏的原则：慢冻快融
– 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细 胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在 细胞内形成冰晶。
• （2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10 倍以上。
• （3）低速离心10分钟。 （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的 细胞。
Sf9细胞的传代
• 判断分离（散）细胞培养物是否需要传代 的主要指标就是观察培养物是否已基本长 满培养瓶皿的底壁。
• 一般来说，原代培养物未达到生长基质的 80%表面面积，不要急于传代，对于拟行 首次传代的培养物更如此。
• 能容纳大分子片段的插入和表达； • 能同时在一个细胞和载体上表达多个外源基因； • 能保证高表达的外源蛋白在细胞内进行正确的折叠，二硫
键的搭配等。
杆状病毒
• 现已知基因组全序列的杆状病毒仅有7 种:
– 苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒( AcMNPV ) – 家蚕核多角体病毒( BmNPV ) – 黄杉毒蛾多核衣壳核多角体病毒( OpMNPV ) – 舞毒蛾多核衣壳核多角体病毒( LdMNPV ) – 甜菜夜蛾多核衣壳核多角体病毒( SeMNPV) – 棉铃虫核型多角体病毒( HaNPV) – 斜纹夜蛾核型多角体病毒( SpltMNPV)
超净台
超净工作台的工作原 理是利用鼓风机驱动 空气遁过高效滤器除 去空气中的尘埃粒， 使空气得到净化。
净化空气徐徐通过工 作台面，使工作台内 构成无菌环境。
生化培养箱
• 生化培养箱设定的条件为28℃ 。 • 使用生化培养箱培养细胞时应注
意的问题：
• 1）保持培养箱内空气干净。定 期消毒（90 ℃ ，14 h)。
• 4）送入培养箱中继续培养。
细胞培养－换液
• 对于像Sf9这样的半贴壁的培养物，可按如 下步骤操作：
• 吸去或倾出（部分或全部）旧培养液。 • 加入新鲜的培养液。加入的量与换液前的
量相同。 • 放回原来的培养箱中继续培养。
转染
• 转染(transfection)指真核细胞由于外源DNA 掺入而获得新的遗传标志的过程。
Sf-9细胞的形态
培养细胞生长的条件
• 1、细胞的营养需要 • 2、细胞的生存环境
温度: 28℃ 氧 pH: 7.2-7.4 渗透压 • 3、无污染 • 4、无毒
实验材料：
• 实验用品： • 超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤
器，酸缸 • 生化培养箱 • 倒置显微镜 • 酶标仪、微孔板震荡器 • 液氮罐 • 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 • 耗材： • 培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板， 冻存管
Sf9传代的方法
• 3）接种在新的培养瓶皿内。一般接种两个或者多 个培养瓶皿内。
•
有时候，传代仅为了使培养物经历并适应传
代处理过程，在培养物细胞数量不大的情况下，
传代时还只是接种在一个培养瓶皿内。加入培养
液。（平时不做实验时，只需要传一瓶）。
• （以1：5或更多为宜，每2-3天传代一次） 28℃培养（不用CO2培养箱）。
• 化学
– 包括：①DEAE-葡聚糖法②磷酸钙法③人工脂 质体法
• 物理
– 包括：①显微注射②电穿孔③基因枪
• *Bacmid
Bawenku.baidu.com-to-Bac expression system
• 杆状病毒表达系统（Baculovirous Expression Vector System,BEVS）与细菌， 酵母，哺乳动物细胞一起被公认为当今世 界的基因工程的四大表达系统。
特点
• 能对高效表达的蛋白质进行较完善的翻译后加工，如糖基 化，磷酸化，酰基化，信号肽的切除等；
• 与其他真和细胞表达系统相比能获得重组蛋白的高水平表 达，最高甚至可达到细胞总蛋白的50%；
• 对脊椎动物无感染性，并且也已经证明它们的启动子在大 多数的哺乳动物细胞中也是没有活性的，因此这对于表达 一些致癌基因和潜在的毒蛋白比其他的表达系统更有优势；
– 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不 致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会 造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程 应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰 晶的重结晶。
慢冻程序
• 标准程序：
•
当温度在-25 ℃以上时， 1～2 ℃/min
•
当温度达-25 ℃以下时， 5～10 ℃/min
•
当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中细胞冻存
• 简易程序：
•
将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系
以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按
每分钟温度下降1～2 ℃的速度，在40分钟内降至 液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。
细胞复苏方法
• （1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～ 38 ℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。
• Sf9的分裂周期大概是27小时左右
Sf9传代的方法
• 1）吸取或者倾出旧培养液。 • 2）加入一定量的新培养基，用吸管吸取培养液，
反复吹打瓶皿底壁，使半贴壁的细胞脱离瓶皿底 壁。 • 吹打过程须有序进行，亦即要从一边开始到另 一边结束，尤其是器皿的边缘地带和四角处，确 保瓶皿底壁各处的细胞均被吹打脱离。吹打时动 作不宜过猛，吹出液体的力度要适中，否则会直 接损伤细胞并产生能伤害细胞的气泡。或者使细 胞碎片增多。 • 经吹打后，得到细胞悬液。
• 2）箱内灭菌蒸馏水3000ml蒸馏 水槽中以保持箱内湿度，避免培 养液蒸发。
培养瓶
拿培养瓶的正确姿势：拇指和食指夹住培养瓶， 瓶口向外，中指托住瓶底。保持瓶子的水平， 防止培养液倒向瓶口。
血球计数板
细胞冻存和复苏
• 冻存和复苏的原则：慢冻快融
– 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细 胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在 细胞内形成冰晶。
• （2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10 倍以上。
• （3）低速离心10分钟。 （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的 细胞。
Sf9细胞的传代
• 判断分离（散）细胞培养物是否需要传代 的主要指标就是观察培养物是否已基本长 满培养瓶皿的底壁。
• 一般来说，原代培养物未达到生长基质的 80%表面面积，不要急于传代，对于拟行 首次传代的培养物更如此。
• 能容纳大分子片段的插入和表达； • 能同时在一个细胞和载体上表达多个外源基因； • 能保证高表达的外源蛋白在细胞内进行正确的折叠，二硫
键的搭配等。
杆状病毒
• 现已知基因组全序列的杆状病毒仅有7 种:
– 苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒( AcMNPV ) – 家蚕核多角体病毒( BmNPV ) – 黄杉毒蛾多核衣壳核多角体病毒( OpMNPV ) – 舞毒蛾多核衣壳核多角体病毒( LdMNPV ) – 甜菜夜蛾多核衣壳核多角体病毒( SeMNPV) – 棉铃虫核型多角体病毒( HaNPV) – 斜纹夜蛾核型多角体病毒( SpltMNPV)
超净台
超净工作台的工作原 理是利用鼓风机驱动 空气遁过高效滤器除 去空气中的尘埃粒， 使空气得到净化。
净化空气徐徐通过工 作台面，使工作台内 构成无菌环境。
生化培养箱
• 生化培养箱设定的条件为28℃ 。 • 使用生化培养箱培养细胞时应注
意的问题：
• 1）保持培养箱内空气干净。定 期消毒（90 ℃ ，14 h)。
• 4）送入培养箱中继续培养。
细胞培养－换液
• 对于像Sf9这样的半贴壁的培养物，可按如 下步骤操作：
• 吸去或倾出（部分或全部）旧培养液。 • 加入新鲜的培养液。加入的量与换液前的
量相同。 • 放回原来的培养箱中继续培养。
转染
• 转染(transfection)指真核细胞由于外源DNA 掺入而获得新的遗传标志的过程。