第十一章 动物细胞培养生物制药

▪ 培养瓶的形状主要是适合细胞贴壁生长和显微镜观察的扁平形状。
动物细胞培养方式
动物细胞培养可以分为贴壁培养、固定化培养、悬浮培养三大类。
1、贴壁培养：细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。
▪ 优点：容易更换培养液；容易采用灌注式培养、不需过滤系统； 同一设备可采用不同的培养液、适用于所有类型细胞。 ▪ 缺点：扩大培养比较困难、投资大；占地面积大；不能有效监测 细胞的生长。
第十一章 动物细胞培养生物制药
动物细胞特点
1、动物细胞比微生物细胞大，无细胞壁，对机械搅拌或剪切力敏
感。
2、动物细胞生长缓慢，易受污染。 3、正常细胞培养的世代数有限，只有癌细胞和发生转化的细胞才 能无限生长下去。 4、动物细胞间主要以聚集体形式存在，大多需要贴附在载体表面
才能生长。此外，动物细胞具有细胞接触性抑制、密度抑制的特
动物细胞培养的条件
1、严格的无菌技术:细菌\真菌\支原体\病毒\交叉污染 2、培养基 ▪ 对于营养要求非常苛刻，氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐 、辅酶、激素、生长因子等。包括：天然、合成、无血清培养基 三种。 （1）天然培养基
▪ 动物血清（胎牛血清、小牛血清）、组织提取液、鸡胚胎汁等。
▪ 优点：营养价值高
动物细胞小规模培养
4、转管培养法
1933-1934年，盖尔（Gey）和刘易斯（Lewis）建立了旋转管培
养方法，将培养物接种于一管状培养器皿中，再将其固定在一可以 旋转的装臵上旋转培养。 旋转管培养方法克服了静臵培养的不足，例如：细胞生长环境不均 匀、不利于营养的吸收等，培养物可以交替地接触培养液和气体环
（3）一般情况下，组织块贴壁后24小时细胞就从组织块四周长出，
2、细胞原代培养
▪ 酶解制备单细胞：根据不同的组织对象采用适当的酶消化液获得
动物细胞进行培养。
▪ 胚胎等组织细胞潜伏期短，第二天既可见生长，一周便可接连成 片；成体组织来源的细胞潜伏期长，一般要一周左右。 ▪ 最常用的酶解液有胰蛋白酶和胶原酶，链霉蛋白酶、粘蛋白酶、 蜗牛酶等也可用于动物细胞的消化。EDTA适合消化传代细胞，
▪ 悬浮生长的细胞可以采用加入新鲜培养基后直接吹打分散传代，
或者采用离心或沉降法加入新鲜培养基后再吹打分散进行传代。 ▪ 贴壁生长的细胞需要进行细胞分离重新接种培养。一般采用酶消 化法进行传代培养。
传代培养方法
酶消化法
1、吸出或者倒掉培养瓶内的旧培养液。 2、加入胰蛋白酶和EDTA混合液盖满瓶底，轻轻摇动培养瓶。 3、2-5分钟后检查，有细胞间隙变大、细胞质回缩现象时添 加培养液终止消化。 4、吸出消化液，加入Hanks液轻轻转动，洗去残留消化液。 5、加入培养液，用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬液。 6、计数，接种进行传代培养。
甚至破裂。BSS溶液。
▪ 气体：细胞的生长代谢离不开气体，主要包括O2和CO2，二氧化 碳培养箱很重要。
动物细胞培养的条件
5、培养工具
▪ 1923年卡雷尔（Carrel）（法国医学家、生物学家，1912年诺
贝尔生理医学奖）设计了用于动物细胞培养的卡式培养瓶，培养 鸡胚心肌组织获得成功。 培养瓶主要有高硼硅玻璃培养瓶与聚苯乙烯塑料培养瓶。
▪ 细胞在反应器中自由悬浮生长。
▪ 主要用于非贴壁依赖型细胞培养，杂交瘤细胞、血液白细胞、淋 巴细胞，某些肿瘤细胞等属于此类细胞。 ▪ 贴壁型细胞贴附在微载体上或者包裹在微囊中后可以接种在适当 生物反应器中实现悬浮培养。
动物细胞小规模培养
1、培养瓶培养法
▪ 1923年，卡雷尔（Carrel）设计成功卡氏瓶，可以保证动物细胞
（3）细胞消化液
▪ 从组织块消化分散得到单个细胞������
▪ 传代培养时分散细胞 ▪ 代表：胰蛋白酶溶液，水解细胞间的蛋白质，加血清终止反应。 增加效果。 （4）抗生素溶液 ▪ 防止微生物污染。
▪ 乙二胺四乙酸二钠（EDTA）消化液：解离细胞,两者常结合使用，
▪ 常用抗生素有青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌素等。
3、灌注小室培养法
1912年由伯罗设计了一种简单的
灌注小室培养模型。 基本要点：将细胞接种于一个由上 下两个盖玻片（分别构成上壁与下 壁）与一金属圈（构成侧壁）密封
围成的小室内，保持在一定条件下
培养。在小室的侧面分别有液体流 入和流出的开口，供新鲜培养液流 入和旧培养液排出。 显著特点：营养液可以循环供应
度上能反映体内的形态学特征。
2、在供体来源充分、生物学条件稳定的情况下，原代细胞是很好 的实验材料，例如药物测试、研究细胞分化等。
1、组织块原代培养
▪ 组织块原代培养是比较常用的简易的原代培养方法，也是早期动 物细胞培养方法。以培养瓶培养为例：
（1）剪刀剪碎组织形成1mm2的组织块，用吸管吸出组织块一一
▪ 接触性抑制(Contact inhibition) 是某些动物细胞体外培养的生 长特性之一。是指由于细胞相互接触而抑制细胞运动性的现象由 于这个特性，正常细胞并不会相互重叠，而是呈单层细胞生长。
▪ 密度抑制(Density inhibition) 细胞接触汇合成片后，只要营养 充分，细胞仍能进行增殖分裂。但是当细胞密度达到一定程度后， 营养相对缺乏，代谢产物增多，发生密度抑制现象
▪ 血清培养基缺点： （1）动物血清来源有限，价格高，不宜大量使用。 （2）动物血清成分复杂且成分不稳定，使生长过程不易检测控制。 （3）虽然血清对细胞生长有效，但会对后期培养产物的分离、提 纯以及检测造成一定困难。 ▪ 无血清培养基(Serum free medium,SFM)是不含血清的动物细胞
▪ 缺点：成分复杂、来源有限、成本较高
血清的生物功能
1、提供基本营养：氨基酸、微生物、无机盐、脂类、核酸等 2、提供激素及各种生长因子：胰岛素、肾上腺素、类固醇、成纤 维细胞生长因子、表皮生长因子等
3、提供结合蛋白：结合蛋白可以携带重要的低分子量物质，如白
蛋白携带微生物、脂肪和激素，转铁蛋白携带铁等 4、提供保护作用：如通过促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械
培养的无菌环境和生长空间。 ▪ 培养瓶培养法是目前动物细胞小规模培养的主要方法之一。
动物细胞小规模培养
2、培养板培养法（微量培养法）
现代体外培养技术最为常用的方法之一。
基本要点：将培养细胞接种在培养板的孔内，然后在CO2培养箱内 培养。常用的培养板有6孔、24孔、96孔培养板。
动物细胞小规模培养
游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其 他细胞相区别。 ▪ 代表有神经胶质细胞。
▪ 4、多形型细胞
▪ 多形型细胞是一些形态上不规则的细胞。多形型细胞不常见，只
有某些像神经组织细胞等难以确定其稳定形态的，才可归于多形 细胞。 ▪ 体外培养呈现多形型细胞的细胞最常见的是神经原细胞。
接触抑制与密度抑制
培养基，由基础培养基和添加组分组成。
▪ 基础培养基较常用的是DMEM、F12培养基。 ▪ 添加组分主要包括：细胞外基质、生长因子、结合蛋白与转运蛋 白、酶抑制剂等。
动物细胞培养的条件
3、其他溶液
（1）平衡盐溶液（Balanced salt solution，BSS）
▪ 主要由无机盐组成，具有维持细胞渗透压、调控培养液酸、碱度 平衡的功能。 中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。
体或半固体表面才能生长。贴壁依赖性细胞，大致分成四型：
1、成纤维细胞型细胞 2、上皮型细胞 3、游走型细胞 4、多形型细胞
▪ 1、成纤维细胞型细胞
多数细胞之间排列疏散，有较大的细胞间隙。 成纤维细胞存在于肌肉、皮肤和骨骼中，代表有心肌细胞，血管内 皮细胞等。
细胞大致呈梭形或不规则形。成群细胞呈现放射状、旋涡状等形式。
境，利于细胞或组织生长。
动物细胞原代培养
▪ 接种组织块直接长出单层细胞或将组织分散成单个细胞再进行培
养，在首次传代前的培养称为原代培养（Primary culture）。
▪ 一般持续1-4周。在这个阶段，细胞有分裂但不旺盛。细胞多呈二 倍体核型，这样的细胞称为原代细胞（Primary cell）。 ▪ 优点： 1、组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，在一定程
放入培养瓶内，一般每小块间隔为0.2-0.5厘米，使其均匀贴在培 养瓶的壁上。 （2）然后将贴有组织块的瓶壁朝上，加入培养液，塞上瓶塞，倾 斜臵于37℃的CO2培养箱内培养2-4小时后，将培养瓶缓慢翻转
平放，静臵培养。24小时后补充培养液，一般3-5天更换培养液。
5-7天组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落，组织块四周的贴壁细 胞也逐渐形成层片。
▪ 2、上皮型细胞
▪ 细胞特点是：扁平状，形态较为规则，细胞贴壁后呈三角形及不
规则扁平的多角形，中央有扁圆形核，生长时彼此紧密连接成单 层细胞。因为相互拥挤而呈现“铺路石状。 ▪ 代表有皮肤的表皮细胞、消化管与呼吸道的上皮细胞、肺泡上皮 细胞、消化腺上皮细胞、血管内皮细胞等。
▪ 3、游走型细胞
▪ 细胞特点是：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃
▪ 退化期：细胞长满培养瓶壁，随着营养物的消耗和代谢物的积累，
细胞贴壁过程
动物细胞培养方式
2、固定化培养
▪ 可以采用类似Байду номын сангаас物细胞固定化培养的方法对动物细胞进行固定化
培养。 ▪ 具有细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能力强等优点，细胞易 3、悬浮培养
于产物分开，有利于产物分离纯化。固定化方法与植物细胞类似。
▪ 例如：Hanks液，注：酚红在培养基中被用来作为pH值的指示剂：
（2）培养基pH调整液
7.4%的NaHCO3溶液、HEPES液等。 ▪ HEPES是一种非离子两性缓冲液，其在pH 7.2 - 7.4范围内具有 较好的缓冲能力。中文名：4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸。
▪ 大部分合成培养液都呈微酸性。常用pH调整液有：3.7%、5.6%、