微生物发酵生产达托霉素的研究进展

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达托霉素菌种选育研究

达托霉素菌种选育研究达托霉素是由玫瑰链霉菌经发酵提取得到。

它能杀死临床上分离的绝大多数革兰阳性菌，具有广阔的应用前景。

本实验确定了玫瑰链霉菌紫外诱变的处理时间为45s，链霉素对其的最低抑制浓度为2.1 μg/mL。

通过对筛选得到的链霉素抗性菌株进行初筛和复筛，获得了一株达托霉素高产菌株NO. 201，其效价达到7652μg/mL，较对照组提高了90%。

稳定性验证表明，该高产菌株传代5次仍然稳定，为后续生产提供了可能。

标签：达托霉素，玫瑰链霉菌，链霉素1前言达托霉素是由玫瑰链霉菌经发酵提取得到的脂肽类抗生素[1]。

达托霉素在临床上表现出广谱、药效快、给药小、副反应小等优点[2]。

本文以紫外线诱变达托霉素生产菌株孢子悬浮液，筛选链霉素抗性菌株，获得了达托霉素高产菌株，并对获得的高产菌株的遗传特性及稳定性进行考察。

2实验方法2.1 菌种原始菌株由新昌制药厂菌种保藏中心保藏，作为诱变育种的出发菌株。

2.2 培养方法取1 mL浓度为106个/ mL的孢子悬浮液接种种子培养基（30 mL/250 mL 摇瓶），30°C 250 r/min培养24 h至对数生长期；取2 mL种子液接种发酵培养基（50 mL/500 mL 摇瓶）30°C 250 r/min培养120 h，检测单位。

2.3 达托霉素的检测采用Agilent 1200高效液相色谱仪测定。

采用峰面积计算含量。

2.4 菌种诱变及筛选2.4.1 单孢子悬浮液的制备冷冻孢子移种于斜面，培养成熟后用灭过菌的0.85%LiCl溶液（做助变剂）制成孢子悬浮液，再用无菌玻璃珠将孢子充分打散，滤纸过滤，即得单孢子悬浮液。

2.4.2 紫外诱变处理用吸管吸取5 mL孢子悬浮液于无菌平板中，置功率为30W，波长253.7nm 的紫外灯下30 cm处开盖振荡照射一定时间，避光放置过夜，取样经梯度稀释后涂平板。

2.4.3链霉素耐受性突变株的筛选2.4.3.1含链霉素的分离平板培养基的制备在已灭菌的分离培养基中加入一定量的链霉素溶液，摇匀，倒平板，使成含一定浓度的链霉素平板。

达托霉素的作用机制和药物来源的研究进展

达托霉素的作用机制和药物来源的研究进展洪娟;刘佳佳【摘要】Daptomycin was a novel lipopeptide antibiotic used in the treatment of certain infections caused by multi - resistant organisms which were Gram - positive. The mechanism of actions of daptomycin and its drug source were summe- rized, and the virous synthesis methods of daptomycin, such as precursor induce, biosynthesis, solid and two methods for its analogues -solid synthesis and chemical enzyme synthesis were reviewed and compared synthesis%达托霉素是一种环脂肽类抗生素，对耐药性革兰氏阳性细菌具有强大杀灭作用。

本文详细介绍了达托霉素的作用机制，总结了其药物来源，分别对达托霉素的各种合成方法——前体诱导法、生物合成、固液相合成法及其类似物的全固相合成法和化学酶法进行了概述和比较。

【期刊名称】《广州化工》【年(卷),期】2012(040)009【总页数】3页(P28-30)【关键词】达托霉素;抗生素;耐药性【作者】洪娟;刘佳佳【作者单位】中南大学化学化工学院,湖南长沙410083;中南大学化学化工学院,湖南长沙410083【正文语种】中文【中图分类】R978.1近年来,由于抗生素的滥用,细菌的耐药性日趋强大.临床上出现的耐甲西林金黄葡萄球菌(MRSA),耐万古霉素的肠球菌(VRE),糖肽类敏感的金葡菌(GISA)等是目前医院中传播率和致死率很高的病原体[1].其中的MRSA的强毒性、多重及高度耐药性、传播快等特征,一旦发生感染,病情就难以控制,某些发达国家已将其与烈性传染病对等[2].达托霉素是由美国Lilly公司最初研究,Cubist制药公司开发的一种环脂肽类抗生素,对革兰阳性耐药菌有活性且具更好抗菌谱和较低耐药性[3],能成功应对上述耐药菌且良好疗效、制剂简单、毒副作用小.本文对达托霉素的作用机制及其药物来源的研究进展进行了综述.达托霉素分子由连接到一个环状13-氨基酸肽的N-末端色氨酸上的癸酰基侧链构成[4].肽环由氨基酸和非蛋白质源氨基酸(如:Asn,OmAsp,3mGlu等)按照酰胺键或酯键构成肽环或羧酸肽环.环脂肽类抗生素分子结构中既含有亲水性氨基酸,又含有脂链以及疏水性氨基酸,这就决定了其两亲性的生物学特性.达托霉素偏酸性,在中性pH下分子带负电荷,因而具有极好的水溶性.同时,脂链和疏水性基团的存在,使得其有一定的脂溶性,容易与细菌磷脂层反应,因而有良好的抗菌效果[5].达托霉素的具体作用机制现在尚无定论,许多研究人员对其独特的作用机制行了研究.达托霉素为Ca2+浓度依赖型抗生素[6],在缺乏Ca2+时,达托霉素的抗菌活性很小或几乎没有.只有Ca2+浓度为1.25 mmol/L时抗菌活性才达到最大.圆二色谱和核磁共振研究结果显示,达托霉素与Ca2+结合后结构发生改变,增加其分子的两亲性减少带电荷,使其更有利于与细菌磷脂反应.Schriever CA[7]研究认为达托霉素使细胞膜去极化而使细菌细胞死亡:首先,达托霉素与Ca2+结合,而后其亲脂尾部插入细菌细胞质膜中;第二步,达托霉素寡聚化,使其亲脂尾部在细菌细胞膜上起"离子通道"的作用,破坏了细胞膜,使大量胞内离子的外流;第三步,K+的流失使细胞快速除极,破坏离子梯度.缺乏合适的离子梯度,细菌胞内的三磷酸腺苷合成受到阻遏,失去合成DNA、RNA及大分子蛋白质的能力,细胞死亡.Boarctti M[8]的研究表明,达托霉素的作用靶点不是青霉素结合蛋白,而是结合在细菌细胞膜上,通过扰乱细胞膜对氨基酸的转运,从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的磷壁(酸)脂质(LTA)的生物合成,干扰细胞的复制,导致细菌迅速死亡.卜一珊等[9]对经达托霉素处理的金葡菌进行电镜扫描,相片显示,达托霉素可以在细胞没有发生自溶的情况下迅速杀死细胞,这样就避免了因细胞磷壁酸、肽聚糖和DNA的释放而引起的炎症反应.综上,由于达托霉素的作用机制与现已上市的各类抗菌药物都不相同,这意味着达托霉素将不易受到来自其它抗生素所致交叉耐药性的影响.达托霉素的最早获得是在20世纪80年代它是玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)发酵产生的环十脂肽类物质经化学修饰的产物[3].在玫瑰孢链霉菌发酵过程中加入正癸酸,利用筛选的癸酸抗性突变株流加法发酵以及激光诱导突变株结合链霉素抗性筛选生产达托霉素的方法都将产量提高35%以上.采用广布多点的方法分散添加癸酸,产出的达托霉素为主要成分,并易于纯化.王玮等[3]研究表明,Streptomyces roseosporus的发酵产物通常是一组包含不同长度脂酰侧链的环十脂肽复合物.发酵产物中除了3种主要成分外,还含有许多杂质,如果在玫瑰孢链霉菌发酵时不优化发酵条件,达托霉素的产量很低,分离纯化难度大,采用前体诱导法,可以改善分离效果.达托霉素的生物合成基因是从Streptomyces roseosporus的Tn5099突变体中获得的,Baltz RH等[10]对得到的DNA片断做了分子克隆,部分序列测定以及插入诱变的操作.用10～20 kb长的编码区去干扰可能的糖肽的生物合成基因,从而确定了两个肽合成编码区.达托霉素是一种非核糖体合成的抗菌肽(多肽).合成酶基因每个模板都可识别、激活一个氨基酸残基,并且在必要的时候对其进行修饰,添加到正在合成的肽链上.Miao等[11]研究报道,达托霉素NRPS(non-ribosomal peptide synthetases非核糖体肽合成酶)的组织结构包含了dptA、dptB、dptC、dptD、dptH等部分.dptA内含五个模块(模块1～5),dptB内含三个(模块6～8)以及模块9的催化功能域,dptC内含模块9～11的酰化硫化功能域,dptD内含模块12～13,以及一个硫化功能域.Baltz RH等[10]对环肽基因簇的两个区域cspA和cspB作了DNA序列分析.他们将Hmγ基因插入到cpsA模块,从而得到了玫瑰孢链霉菌双向交叉阳性检测系统.达托霉素基因簇的CpsB模块包括了氨基酸激活,硫酯键的形成和异构化.利用基因手段对达托霉素分子进行生物合成,可以有效的控制多肽链的合成及其结构修饰,从而得到目标分子.基因工程在医学领域的研究和应用有待于更多学者的参与和发掘.徐红岩等[12]根据多年大量多肽合成工作的经验积累,巧妙地设计了达托霉素的固液相合成策略,该方法被证明可快速合成目标分子.另外运用该方法可对这类环肽主骨架进行修饰或改造,根据组合化学的基本原理,快速合成出一系列大量天然环肽的类似物,以期找到结构相对简单而具有达托霉素相似或更强生物活性的化合物,供临床前的筛选.可是,固液相合成方法中采用的液相环合后再剪切的方法使得产物产率和纯度低,无法满足临床需求,且作为单体的犬尿氨酸和3-甲基谷氨酸自然来源稀少,其化学合成又非常困难,因此,要将该合成方法工业化仍需要进一步研究和完善.目前在合成上取得的最大进展是利用化学酶合成法得到了达托霉素类似物.天蓝色链霉菌中钙依赖性抗生素(cDA)生物合成途径中的硫酯环化酶A3(2)(CdaPS3 Te)被用于合成达托霉素类似物(12位Glu代替3 mGlu,2位L-Asn代替D-Asn).由于缺少Glu-12上的β-甲基,且Asn一2为D型,此类似物比达托霉素MIC高7倍.使用这种方法又合成了许多类似物来研究其构效关系.如Trp替换Kyn-13,MIC升高.Asn取代7, 9位的Asp,则完全丧失活性,用其他酸性残基取代3和12位则可保留大部分活性.在内酯环中额入酸性残基则破坏其活性.采用cdaPS3 Te可以建立一个达托霉素类似物的组合库来进一步筛选抗菌活性更好的分子[3].钦传光等[13]发明出一种达托霉素类似物及其全固相合成制备方法,希望通过达托霉素的主骨架设计出一系列结构相对简单的衍生物,以期找到与达托霉素相似或更强生物活性的化合物,供临床筛选.该方法是将第一个侧链带有羧基的Fmoc氨基酸(其α-羧基被选定的基团保护)连接到固相树脂载体上,再继续依次连接七个Fmoc 氨基酸,期间依次脱Fmoc;连接第九个侧链带有羟基(巯基或氨基)并被选择性基团保护的Fmoc氨基酸并脱Fmoc;再继续依次连接后面的三个Fmoc氨基酸并脱Fmoc;连接脂肪酸后,再选择性的脱去第九个氨基酸侧链羟基(巯基或氨基)上的保护基团,然后将其与最后一个Fmoc氨基酸的羧基进行反应,脱Fmoc;再脱去第一个氨基酸α-羧基的保护基团后,直接在固相树脂上进行环合,随后将产物从树脂上剪切下来,经冷乙醚沉淀,收获产品.全固相合成制备方法解决了达托霉素固液相合成法中犬尿氨酸和3-甲基谷氨酸自然来源稀少的弊端,为临床药物筛选提供了更广的来源. 达托霉素作为应用到临床的首个环脂肽类抗生素,鲜有交叉耐药菌的报道,这在医院院内感染严重、高致病耐药菌肆虐的今天,显得尤为重要.自2003年起,达托霉素药物在美国、德国、英国和荷兰陆续上市[14].2010年,中国SFDA也批准阿斯利康公司对克必信(注射用达托霉素)产品在国内免注册临床试验并授予上市许可.但是由于专利保护等原因,玫胞链霉菌不易得,且发酵过程需要精密控制,下游纯化过程对设备级别及技术的要求都很高,目前在国内还未见药厂对达托霉素开始工业化生产.因此,开发扩大达托霉素的药物来源,使国内拥有该药物的自主研发生产能力,有待众多学者的进一步努力.【相关文献】[1] 崔玉彬.处于临床试验研究阶段的抗生素候选药物总览[J].国外医药:抗生素分册,2011,32(2):79-82.[2] 顾觉奋,戴君.新一代抗MRSA抗生素的临床研究进展[J].抗感染药学,2009,6(4):223-228.[3] 王玮,穆青.从天然产物到药物-达托霉素的发展历程[J].国外医药:抗生素分册,2009,3(2):59-62.[4] Baltz RH,Miao V,wrigley SK.Natural products to drug daptomycin and relatedlipopepride antibiotics[J].Nat Prod Rep,2005,22(6):717-741.[5] 史丽娟,石磊.新型抗革兰阳性菌药物---达托霉素[J].中国医药导刊,2008,10(7):1100-1102.[6] 张石革.糖肽和环脂肽抗生素的进展与临床评价[J].中国医院用药评价与分析,2009,9(2):88-89.[7] Schriever CA,Fernandez C,Rodvold KA.Daptomycin:A novel cyclic lipopeptide antimicrobial[J].Clinical Review,2005,62(11):1145-1158.[8] Boaretti M,Canepari P.Purification of daptomycin binding proteins(DBPs)from the membrane of enterococcushirae[J].New Microbiol,2000, 23(3):305-317.[9] 卜一珊,崔蓉.新的抗革兰阳性菌药物---达托霉素[J].中国药师,2005,8(7):594-595.[10] Baltz RH,McHenney MA,Cantwell CA,et al.Applications of transposition mutagenesis in antibiotic producing streptomycetes[J].Kluwer Academic Publishers,1997,71(1-2):179-187.[11] Miao V,Coëffet-LeGal MF,Brian P,et al.Daptomycin biosynthesis in Streptomyces roseosporus:cloning and analysis of the gene cluster and revision of peptide stereochemistry[J].Microbiology,2005,151(5): 1507-1523.[12] 徐红岩,陆婷婷.一种达托霉素的合成方法:CN,101235080A[P]. 2008-08-06.[13]钦传光,任锦,牛卫宁,等.达托霉素类似物及其全固相合成制备方法:CN,101696235A[P].2010-04-21.[14] 韩培,陈继业,王岩,等.达托霉素生物合成研究进展及临床研究[J].中国医药工业杂志,2011,42(6):466-471.。

从发酵液中提取达托霉素的工艺优化

达托霉素是一种新型的环脂肽类抗菌素，具有独特的抗菌机制。达托霉素由连接到一个环状１３一氨基酸肽的Ｎ－末端色氨酸上的癸酰基侧链构成，其中肽环
或羧酸肽环是由氨基酸和非蛋白质源氨基酸通过酰胺键或酯键构成的［１］。由于脂链和疏水性基团的存在，
摘要：通过对迭托霉素发酵液预处理、溶剂萃取、结晶、干燥得到达托霉素粗品。确定了以ｐＨ值６．５～７．５的缓．文章编号：１６７２ —５４２５（２０１３）０７－００８６ —０２
通讯作者：仲伟潭，高级工程师，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｏｎｇｗｅｉｔａｎ＠１６３．ｃｏｍ。
常亮等：从发酵液中提取达托霉素的工艺优化／２０１３年第７期
特性，采用微生物发酵法生产达托霉素，将达托霉素富
浸提效果；同时对达托霉素的结晶条件进行研究，以优化适合工业化的提取工艺路线。
２结果与讨论
２．１溶剂对浸提效果的影响 ‘
２．１。１溶剂的选择
富含达托霉素的菌丝体；对菌丝体进行浸泡，加入正丁
醇萃取转相；收集正丁醇萃取溶液，加入丙酮，结晶、干
燥，制得达托霉素粗品。对比不同溶剂、不同ｐＨ值缓冲溶液对菌丝体的
质提纯达托霉素瞳］，国内中科院上海有机化学研究所

环脂肽类抗生素达托霉素的研究进展

环脂肽类抗生素达托霉素的研究进展作者：章艳玲来源：《中国化工贸易·下旬刊》2018年第08期摘要：达托霉素是一种具有新型作用机理的能有效抑制耐药性病原菌的环脂肽类新型抗生素。

本文主要对达托霉素的作用机制、合成方法和临床应用进行综述，以期为达托霉素的研究提供一定思路。

关键词：达托霉素；作用机制；合成方法；临床应用达托霉素是玫瑰孢链霉菌发酵产物脂肽类化合物A21978C的N-癸酰基衍生物，是由玫瑰孢链霉中通过非核糖体蛋白合成酶（NRPS）机制合成的由13个氨基酸和一个正癸酸脂肪酸尾组成的环脂肽类新型抗生素[1]，其在体外对大多数革兰氏阳性菌均有抑制作用，而且对许多耐药菌，如耐万古霉素的肠球菌（VRE）、耐甲氧西林的金黄色葡萄球（MRSA）和凝固酶阴性的葡萄球菌（CNS），仍具有较强的活性[1-2]，被公认为万古霉素的最佳替代品。

近年来，达托霉素的有关研究报告有很多[3-8]，本文从达托霉素的作用机制、合成方法和临床应用方面进行报道。

1 达托霉素的作用机制达托霉素通过钙离子（Ca2+）依赖的方式靶向革兰氏阳性菌细胞膜。

最新的研究表明在枯草芽孢杆菌中，达托霉素优先插入到富含液脂的部位，造成细胞膜双分子层的扭曲，导致液脂聚集到插入位点补偿细胞膜流动性受到的影响。

催化细胞壁和细胞膜磷脂合成的关键酶定位于细胞膜中富含液脂的位置，如负责催化脂质II（lipidII）最后一步合成的MurG，催化磷脂合成的PlsX等。

达托霉素阻碍了MurG和PlsX 等重要蛋白与液脂的结合，导致蛋白定位异常和功能受损[8]。

通过干扰细胞膜磷脂的结构，扰乱细胞膜对氨基酸的转运，从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的生物合成，细胞壁的破损最终导致细胞裂解和细菌死亡。

另外，它还能通过破坏细菌的细胞膜，改变细胞质膜的性质，使其内容物外泄而达到杀菌的目的，因此细菌对达托霉素产生耐药性可能会比较困难[8]。

2 达托霉素的合成方法2.1 酶法半合成达托霉素达托霉素及A-21978C相关衍生物的最初制备是采用酶法半合成工艺。

达托霉素产生菌前体物耐受选育及其流加补料发酵

ＲｅｓｕｌｔｓＡｍｕｔａｎｔｓｔｒａｉｎｎａｍｅｄＦＩＭ —Ｄ１５６８ｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄａｎｄｔｈｅｙｉｅｌｄｏｆｄａｐｔｏｍｙｃｉｎｒｅａｃｈｅｄ３８０ｍｇ／Ｌｗｈｉｃｈｗａｓ３５．７％ｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅｏｒｉｇｉｎａｌｏｎｅ．Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ，ｔｈｅｙｉｅｌｄｏｆｄａｐｔｏｍｙｃｉｎｒｅａｃｈｅｄ２２７６ｍｇ／Ｌｉｎａ１００Ｌｆｅｒｍｅｎｔｏｒｂｙｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｆｅｅｄｉｎｇａｍｍｏｎｉｕｍｄｅｃａｎｏａｔｅ．ＣｏｎｅｌｕｓｉｏｎＡＲＴＰｉｎｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｗｉｔｈａｍｍｏｎｉｕｍｄｅｃａｎｏａｔｅａｎｄｇｌｙｃｉｎｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇｃａｎｅｆｅｃｔｉｖｅｌｙｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｄａｐｔｏｍｙｃｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｓｔｒａｉｎｓ．
摘要：目的通过对达托霉素产生菌进行诱变选育，以及前体物补料发酵方式提高达托霉素的产量。方法采用常压室温等离子体（ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃａｎｄｒｏｏｍｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｐｌａｓｍａ，ＡＲＴＰ）技术对玫瑰孢链霉菌进行诱变，以癸酸铵和甘氨酸耐受作为选择压力进行菌株筛选，在摇瓶和ＩＯＯＬ发酵罐上进行癸酸铵流加补料试验确定最佳的发酵工艺。结果经诱变选育获得１株突变株ＦＩＭ—Ｄ１５６８摇瓶效价达￣ｌＪ３８０ｍｇ／Ｌ，发酵单位较出发菌株提高了３５．７％；通过优化ＩＯＯＬ发酵罐流加补料癸酸铵溶液工艺，使达托霉素发酵效价达￣Ｏ２２７６ｍｇ／Ｌ。结论以ＡＲＴＰ为诱变源，甘氨酸及癸酸铵耐受性为选择性压力，可以快速筛选获得达托霉素高产菌；高产突变菌株在流加补料发酵工艺上优良性状得以发挥，发酵效价大幅提高。

响应面法优化达托霉素发酵培养基的研究

１３个氨基酸的大环脂肽类抗生素，在玫瑰孢链霉菌中
以非核糖体蛋白合成酶（ｎｒｏｏｌｅｔｅｓｎＮｏ —ｉｓｍａｐｐｉｙ－ｂｄ
ｔｅａｅＮＲＰ）ｈｔｓ，Ｓ机制合成，有依赖于Ｃ破坏病菌具ａ
细胞膜的新型作用，此对许多耐药病菌具有显著的广泛应用于工程设计、因生物医药等领域，取得了良好并治疗作用口。达托霉素具有在体外抗绝大多数临床 ’ 的效果。叫］。。革兰氏阳性菌的作用，于一些可选择的抗生素很少对的耐药菌，耐万古霉素的肠球菌（如ＶＲＥ、甲氧西）耐林的金黄色葡萄球菌（Ｓ、肽类敏感的金黄色ＭＲＡ）糖葡萄球菌（ＩＡ）凝固酶阴性的葡萄球菌（ＮＳ和耐ＧＳ、Ｃ）
突变株，自行保藏。高氏一号培养基（面固体培养基，斜ｇ・Ｌ）可：溶性淀粉２，０ＫＮＯ，Ｓ０５ＫＨＰ０５３１ＭｇＯ．，２Ｏ．，
产物产量］。近年来培养基优化方法已经由传统的
１５３ｍｇ・Ｌ＿，８．。较优化前提高了７．。３７
关键词：ｌｋｔＢｒｎ设计；陡爬坡设计；应面设计；托霉素；酵培养基Ｐａｅｔｕｍａｃ — 最响达发
中图分类号：Ｑ２．Ｔ９Ｏ１文献标识码：Ａ文章编号：６２４５２１）０００５１７ —５２（０２１ —０４ —０

达托霉素的研究进展

４．２环脂肽类抗生素的ＮＲＰＳｓ生物合成
环脂肽类抗生素属于微生物次级代谢产物，主要经细胞的非核糖体肽合成酶（ＮＲＰＳ）合成途径合成，此过程不需要ｍＲＮＡ为模板，也不以ｔＲＮＡ为载体，而是通过ＮＲＰＳｓ识别特定的氨基酸并连接成多肽链，ＮＲＰＳｓ同时具有酶和模板的特性。ＮＲＰＳｓ由一系列顺次排列的组件构成，每个组件又由不同的结构域构成。达托霉素的合成酶的合成基因簇已经基本确定，主要包括ＤｐｔＡ、ＤｐｔＢＣ、ＤｐｔＤ等亚基，这些亚基由一系列顺次排列的组件构成，每个组件又包括不同的结构域，每个组件都可识别、激活一个氨基酸残基，并且在必要时对其进行修饰，添加到正在合成的肽链上，通过硫酯酶（Ｔｅ）环
分子具有两亲性的生物学特性。其主要是由玫瑰孢链霉菌发酵产生，典型的化合物结构。２作用机理达托霉素的抗菌作用机制还没有彻底阐明。最新研究的作用机制模型认为，达托霉素可以与游离Ｃａ２＋以１：１的比例结合，达托霉素构象发生改变，同时脂肪酸尾链插入到磷脂双分子层中，使磷脂双分子层形成孔洞，起到离子通道的作用，最终导致钾离子（可能包括其他离子）外流，细胞膜去极化，失去合成生长所必须的各类大分子物质的能力，最终导致细胞死亡。另有研究表明，它还能通过破坏细菌的细胞膜，使其内容物外泄而达到杀灭细菌的目的。达托霉素的作用机制完全不同于Ｂ一内酞胺类、氨基糖苷类和大环内酯类等相对较为传统的抗生素，正是由于其作用机制的特殊性，使得达托霉素耐药菌的产生较难，在临床上具有较高的应用价值。３抗菌活性３．１抗菌谱各项研究表明环脂肽类抗生素对于革兰阳性菌有很好的抗菌效果，对革兰氏阴性菌无作用，其抗菌活性与Ｃａ２＋浓度有较大的关系。研究表明，对葡萄球菌（包括甲氧西林敏感的金葡球菌、表皮葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌）、链球菌（包括青霉素敏感和耐药的肺炎链球菌、化脓性链球菌、无乳链球菌和草绿色链球菌）、肠球菌（包括万古霉素敏感和耐药的菌株）等都具有比较好抑菌的效果。达托霉素也具有抗生素后效应（ＰＡＥ），在低于ＭＩＣ浓度下，仍可以较好表现

达托霉素发酵液大孔树脂吸附分离的研究

ＡＳＲＣＴＢＴＡ０ｂｅｔｅＥｔｃｏｒｃｓｏａｔｙｉｒｅｔｉｒｔｂａｒｏｏｓｒｓａｔ — ｊｃｉｘｒｔｎｐｏｅｓｆｐｏｃｆｍｎａｏｂｏｈｙｍｃｏｒｕｉｗｓｓｄｖａｉｄｍｎｅｔｎｐｅｎｕ
ｏｏｈＣｉｈｒａｅｔａＧｏｐＣＬｄＳｉａｈａｇ００１；ｆｒｈｎＰａｍｃｕｃｌｒｕｏ．ｔ，ｈｉｕｎ５０５Ｎｔａｉｊｚ２ＴｅｈｒｏｐｔｆｈｉｈａｇＳｉａｈａｇ５０）ｈｉＨｓｉｌｉａｕｎ，ｈｉｕｎ０ＴｄａｏＳｊｚｊｚ０１１
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维普资讯
中国抗生素杂志２００８年２月第３３卷第２期
文章编号：ｏ１８８２０）２０８－３ｌ０．６９（０８０，０４０
达托霉素发酵液大孔树脂吸附分离的研究
ｃｓ．ｅｅａａｉｎｅｃｅｃｓｖｌａｅｂＨＰｅｓＴｈｓｐｒｔｆｉｎｙｗａｅａｕｔｄｙｏｉＬＣ．ＲｅｕｔＤｙａｃｓｔｒｔｄｄｏｔｎｃｐｃｔｆＨＺ８ｓｌｓｎｍｉａｕａｅａｓｒｉａａｉｙｏ８１ｐｏｒｓｎｆｒｄｐｔｍｙｉｎｆｒｅｔｔｎｂｏｈｗａｅｉｏａｏｃｎｉｅｍｎａｉｒｔｓ３，５０ｔｇ／ｍｌａｄｄａｔｍｙｉｄｏｂｄｏｈｏ５ｘｎｐｏｃｎａｓｒｅｎｔｅＨＺ８１ｅｉｓｅ・８ｒｓｎｗａｆｉ

液态发酵法生产达托霉素的培养条件优化研究

２０４
中国抗生素杂志２０１３年３月第３８卷第３期
文章编号：１００１ — ８６８９（２０１３）０３ — ０２０４．０４
液态发酵法生产达托霉素的培养条件优化研究
王蓓谢详茂陈俊勇朱健陈晓霞
（浙江杭州华东医药集团生物工程研究所有限公司，杭州３１００１１）
初始ｐＨ８．５、接种量０．５％、转速２５０ｒ／ｍｉｎ、装液量８０ｍＬ／５００ｍＬ、发酵温度３２ ℃ ，优化后罐上效价较以前配方提高了近５０％。结论新工艺为达托霉素的工业化大生产打下了良好的基础。关键词：达托霉素；液态发酵；优化中图分类号：Ｒ９７８文献标识码：Ａ
Ｃｏｍｏｓｉｔｉｏｎｓｏｆｃｕｌｕｒｔｅｍｅｄｉｕｍａｎｄ，１ｉｑｕｉｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
摘要：目的研究液态发酵法生产达托霉素的发酵工艺，提高达托霉素的产量。方法通过用玫瑰孢链霉菌液态发酵法生产达托霉素的优化实验，对发酵的主要影响因素进行了单因素的试验，并用正交试验对发酵温度、前体量、接种量进行了优
化，确定了最佳培养基组成和培养豆粉３％、豆粕２％、补前体量５０ｐＬ、
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｐｒｅｃｕｒｓｏｒａｎｄｉｎｏｃｕｌｕｍｖｏｌｕｍｅｗｅｒｅａｌｓｏｏｐｔｉｍｉｚｅｄｔｈｒｏｕｇｈｏｔｒｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｍｅｄｉａｍａｎｄｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅａｓｆｃ｝ｌｌｏｗｓ：３％ｓｏｙｂｅａｎｌｆｏｒ，ｕ２％ｓｏｙｂｅａｎｍｅａｌ，ｉｎｉｔｉａｌｐＨ８．５，３２ ℃，ｌｉｑｕｉｄｖｏｌｕｍｅ８０ｍＬ／５００ｍＬｂａｆｌｅｄｌａｆｓｋ，２５０ｒ／ｍｉｎｏｆｒｏｔａｔｉｏｎｓｐｅｅｄ，０．５％ｉｎｏｃｕｌｕｍｖｏｌｕｍｅ，５０ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｖｏｌｕｍｅ，

达托霉素生物合成过程的调控机制研究进展

2020年第1卷第6期|Syn thetic Bio logy J ournal2020，1（6）：722-731达托霉素生物合成过程的调控机制研究进展方教乐1，2，吕中原1，2，孙晨番1，2，刘一帆1，2，徐炜锋1，2，毛旭明1，2，李永泉1，2（1浙江大学药物生物技术研究所，浙江杭州310058；2浙江省微生物生化与代谢工程重点实验室，浙江杭州310058）摘要：微生物是天然产物类药物的重要来源之一，其中许多链霉菌来源的抗生素类药物一直活跃在对付细菌感染的前沿阵地。

然而随着“超级细菌”的陆续发现，以及新药研发速度的滞缓，人类尚缺乏“超级细菌”的最终治疗手段。

达托霉素是由玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus ）经发酵产生的一种新型环脂肽类抗生素，由于其独特的结构及特殊的药物机制，被视为多重耐药革兰阳性细菌引起的重症感染的最后一道防线。

然而在工业发酵过程中，达托霉素的生物合成水平很低，有极高的提升潜力。

本文总结了近年来国内外相关达托霉素合成的调控机制研究，包括调控蛋白的挖掘、途径特异性调控机制、级联调控途径、脂酰前体合成途径、GBL 信号途径与磷酸双组分系统及其协同调控机制等，揭示了次级代谢调控网络的复杂性，并阐述了通过调控通路重构实现达托霉素优质高产的策略。

关键词：达托霉素；生物合成；调控网络；A 因子级联调控途径；磷酸双组分系统中图分类号：Q939.97文献标志码：AAn overview on regulatory mechanism of daptomycin biosynthesisFANG Jiaole 1，2，LYU Zhongyuan 1，2，SUN Chenfan 1，2，LIU Yifan 1，2，XU Weifeng 1，2，MAO Xuming 1，2，LI Yongquan 1，2（1Institute of Pharmaceutical Biotechnology ，Zhejiang University ，Hangzhou 310058，Zhejiang ，China ；2Zhejiang ProvincialKey Laboratory for Microbial Biochemistry and Metabolic Engineering ，Hangzhou 310058，Zhejiang ，China ）Abstract:Daptomycin is a new cyclic lipopeptide antibiotic,produced by Streptomyces roseosporus ,with strong resistance to Gram-positive bacteria.Due to its special manner to block the biosynthesis of peptidoglycan,it is difficult for bacteria to develop resistance to daptomycin.Therefore,daptomycin is also known as the ‘last line of defense ’after vancomycin.After approval of daptomycin for injection (brand name cubicin)used to treat infections caused by some sensitive Gram-positive strains,domestic daptomycin products still mainly rely on imports to keep up with demand.In response to this urgent need,there have been many studies on the structure,收稿日期：2020-03-10修回日期：2020-11-05基金项目：国家新药创制重大专项（2018ZX09711001-006-013）；国家自然科学基金（3173002和31520103901）引用本文：方教乐，吕中原，孙晨番，刘一帆，徐炜锋，毛旭明，李永泉.达托霉素生物合成过程的调控机制研究进展［J ］.合成生物学，2020，1（6）：722-731Citation：FANG Jiaole，LY U Zhongyuan，SUN Chenfan，LIU Yifan，XU Weifeng，MAO Xuming，LI Yongquan.An overview on regulatory mechanism of daptomycin biosynthesis ［J ］.Synthetic Biology Journal，2020，1（6）：722-731DOI :10.12211/2096-8280.2020-020特约评述第1卷physicochemical properties,functional mechanisms and synthesis of daptomycin.The biosynthetic pathway of daptomycin has no typical pathway-specific regulators,suggesting that its synthetic regulation may have a unique mechanism.Based on analysis of daptomycin biosynthetic gene cluster,this article mainly summarizes researches on the regulatory mechanism during daptomycin biosynthesis.Screening and identifying regulatory pathways for daptomycin biosynthesis is of great significance for enriching the secondary metabolic regulation of streptomyces, and will also provide important candidate targets for improving daptomycin production.This review aims to give directions for the targeted transformation to obtain high-yield strains more efficiently,and to provide a theoretical reference for the improved biosynthesis of daptomycin.The regulation of microbial secondary metabolism can be divided into three levels,namely global regulation,pleiotropic regulation and pathway-specific regulation. Through analyzing and constructing a regulatory network for the synthesis of secondary metabolites,we can see the key targets of genetic transformation and provide an entry point for high-yield strategies for secondary metabolism,thereby helping us to more effectively carry out targeted high-yield transformation of bacteria and increase the yield of metabolites.With the identifications of gene functions in the daptomycin synthesis gene cluster and the clarification of the daptomycin biosynthesis regulatory network,more genetically targeted transformation and breeding optimization methods have emerged.At the same time,with the development and optimization of the fermentation process,the goal of greatly increasing production of daptomycin biosynthesis in China can be achieved.Keywords:daptomycin;biosynthesis;regulatory network;A-factor;PhoR-PhoP20世纪70年代青霉素的发现，以及之后不断研发出来的抗生素，成为对付病菌感染的有效武器；但抗生素的过度使用，导致了致病菌特别是革兰阳性菌产生耐药性，形势日益严峻。

达托霉素产生菌前体物耐受选育及其流加补料发酵

达托霉素产生菌前体物耐受选育及其流加补料发酵周剑;张引【摘要】目的通过对达托霉素产生菌进行诱变选育,以及前体物补料发酵方式提高达托霉素的产量.方法采用常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)技术对玫瑰孢链霉菌进行诱变,以癸酸铵和甘氨酸耐受作为选择压力进行菌株筛选,在摇瓶和100L发酵罐上进行癸酸铵流加补料试验确定最佳的发酵工艺.结果经诱变选育获得1株突变株FIM-D1568摇瓶效价达到380mg/L,发酵单位较出发菌株提高了35.7％;通过优化100L发酵罐流加补料癸酸铵溶液工艺,使达托霉素发酵效价达到2276mg/L.结论以ARTP为诱变源,甘氨酸及癸酸铵耐受性为选择性压力,可以快速筛选获得达托霉素高产菌;高产突变菌株在流加补料发酵工艺上优良性状得以发挥,发酵效价大幅提高.【期刊名称】《中国抗生素杂志》【年(卷),期】2018(043)007【总页数】7页(P817-823)【关键词】达托霉素;菌种选育;常温等离子体;癸酸铵;补料;发酵【作者】周剑;张引【作者单位】福建省微生物研究所,福建省新药(微生物)筛选重点实验室,福州350007;福建省微生物研究所,福建省新药(微生物)筛选重点实验室,福州350007【正文语种】中文【中图分类】Q939.92;Q937;Q691达托霉素是从玫瑰孢链霉菌发酵液中提取得到的一个环脂肽类物质，它由连接到一个环状13-氨基酸肽的N-末端色氨酸上的癸酰基侧链构成[1]。

达托霉素具有新颖的化学结构，其作用模式独特：可扰乱细胞膜对氨基酸的转运，从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的生物合成，改变细胞质膜的性质；另外，它还能通过破坏细菌的细胞膜，使其内容物外泄而达到杀灭细菌的目的[2-4]。

达托霉素微生物生产主要有两个途径：一是化学半合成法，首先经玫瑰孢链霉菌发酵获得达托霉素原形药然后经微生物转化、化学半合成最终形成达托霉素。

达托霉素新杂质及其来源研究

Aglient 1100液相系统（美国Aglient）；质谱仪： ACQUITY™ UPLC & Q-TOF MS Premier（美国Waters）；核磁共振仪：Bruker Avance III 400MHz（德国Bruker）； GC-MS：安捷伦7890A-5975C（美国Aglient）。
Key words Daptomycin; Impurity; MS-MS; NMR
达托霉素是一种由13个氨基酸组成的新型脂肽类抗生素，是一种钙离子依赖型的抗生素。在钙离子存在的条件下，它将以非共价键的形式与细胞膜
பைடு நூலகம்
等耐药菌，且主要用于耐药菌，如耐万古霉素的肠
球菌(VRE),耐甲氧西林金葡菌(MRSA)等，在医学方面具有广阔的应用前景
达托霉素新杂质及其来源研究夏兴等
.575 .
的安全性、杂质的生物学影响，必须对相关杂质的结构进行确证。同时，在进行达托霉素申报注册时也需要说明相关杂质的来源，因此对相关杂质的研究十分重要。本文在研究达托霉素相关杂质过程中⑼，发现了一个未知杂质。通过高效液相分离纯化了该杂质，并进行UPLC-MS和NMR测定，推定了其结构。根据其化学结构，检测了生产原料，推测了其可能的来源。 1仪器和试剂
Abstract Daptomycin is a new antibiotic that is being used in clinic. Due to its structural characteristics, it has many impurities with similar structures. In the sample of daptomycin, a new impurity was found through HPLC analysis, with a relative retention time of 0.82. After separation and purification, a new impurity was obtained. The

达托霉素发酵工艺条件响应面优化研究

达托霉素发酵工艺条件响应面优化研究刘欣;周宋汇;孙科【摘要】为优化达托霉素发酵条件,通过单因素实验和响应面方法研究了达托霉素发酵条件温度、pH值、接种量、通风量和搅拌转速.结果表明:优化后的发酵工艺条件为温度27.74℃、pH值8.36、接种量8.48％、通风量6.13 L/min、搅拌转速242 r/min,在此条件下达托霉素的产量可达880.48 mg/L,比最新报道的达托霉素发酵效价提高了132％.本方法大幅度提高了达托霉素产量,对达托霉素工业化生产提供了可靠的研究基础.【期刊名称】《中南民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2019(038)001【总页数】5页(P76-80)【关键词】达托霉素;发酵工艺条件优化;单因素实验法;响应面法;方差分析【作者】刘欣;周宋汇;孙科【作者单位】江苏省肿瘤医院,江苏省肿瘤防治研究所,南京医科大学附属肿瘤医院,南京210009;江苏省肿瘤医院,江苏省肿瘤防治研究所,南京医科大学附属肿瘤医院,南京210009;徐州生物职业技术学院生物工程系,徐州221006【正文语种】中文【中图分类】Q815达托霉素(doxymycin)是一种环状脂肽类抗生素，可以由玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)发酵得到.达托霉素对绝大多数G+菌具有杀灭的功能，更主要的是它可以作用于耐药菌如耐甲氧西林金葡菌(MRSA)、耐万古霉素肠球菌(VRE)、耐万古霉素金葡菌(VRSA)等[1,2],近年来成为医药界的研究热点.达托霉素结构复杂，化学合成难度较大，通常采用生物发酵方法进行生产. 但是发酵法产量较低，一直限制其在我国的规模使用. 目前国内提高达托霉素发酵效价的研究多集中在对优良菌种的选育上，如采用联合抗性筛选法、紫外诱变方法、氦氖激光辐照-亚甲基胍复合诱变法来筛选优良菌种[3-5]. 最新的文献显示，周剑等[6]通过流加补料发酵方式最终使达托霉素产量达到380 mg/L. 本研究以本实验室筛选的诱变玫瑰孢链霉菌FN2015为发酵菌种，优化各项发酵条件，为大规模发酵生产达托霉素提供可供借鉴的理论基础.1 材料与方法1.1 材料与试剂玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus) FN2015，实验室保藏菌种.玉米浆试剂级；酵母浸膏、琼脂粉、葡萄糖、氯化钠、七水硫酸镁、三水磷酸氢二钾、七水硫酸亚铁、糊精等为国产分析纯试剂；消泡剂食品级.1.2 培养基斜面培养基：葡萄糖2.0%，酵母浸膏1.0%，氯化钠0.05%，七水硫酸镁0.1%，三水磷酸氢二钾0.05%，七水硫酸亚铁0.001%，琼脂粉1.8%.种子培养基：糊精2.5%，玉米浆0.5%，七水硫酸镁0.1%，三水磷酸氢二钾0.04%.发酵培养基：玉米淀粉水解糖3.5%，玉米浆0.5%，氯化钾0.05%，消泡剂0.01%.1.3 仪器与设备SHP-400智能生化培养箱(苏州威尔)；无菌超净工作台(JB-CJ-1500FX，苏州佳宝) ；多振幅轨道恒温摇床(ZWY-103B ，上海圣科)；机械搅拌式发酵罐(20 L，镇江东方)；台式高速冷冻离心机(H1650R，上海齐闵)；高效液相色谱仪(1260型，美国安捷伦).1.4 方法1.4.1 玫瑰孢链霉菌FN2015的培养取出保藏在超低温冰箱中的FN2015的孢子，接种到斜面培养基上，30 ℃、35%～55%的湿度下培养10～12 d，制备孢子悬液浓度为107 个/mL. 取1 mL孢子悬液接种到装100 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，于恒温摇床中培养，培养条件为：28 ℃、200 r/min. 培养42 h后按9%的接种量接种到5 L小型发酵罐，发酵条件为：温度(28±1) ℃、搅拌转速240～300 r/min、空气流量6～7L/min、罐压0.05 MPa.1.4.2 发酵条件确定方法选取对达托霉素发酵影响显著的5个因素温度、初始pH值、接种量、通风量和搅拌转速进行单因素实验. 以某个发酵条件为变量，其他条件固定不变，通过实验确定此发酵条件.1.4.3 发酵条件优化方法以单因素实验的5个因素作为影响因子进行响应面实验，通过Box-Behnken试验水平设计[7]，具体的实验设计如表1，其中温度为影响因子A、初始pH值为影响因子B、接种量为影响因子C、通风量为影响因子D、搅拌转速为影响因子E.表1 Box-Behnken实验因子水平设计Tab.1 Level design of Box-Behnken test factor因素水平温度/℃初始pH接种量/%通风量/(L/min)搅拌转速/(r/min)-1267.581.02000288.0101.22501308.5121.43001.4.4 达托霉素效价测定方法达托霉素的效价测定见文献[8].2 结果与分析2.1 单因素实验及结果2.1.1 发酵温度对达托霉素发酵结果的影响其他条件不变，选取不同发酵温度24、26、28、30和32 ℃，测定达托霉素的产量，从图1 可以看出当发酵温度为28 ℃时，达托霉素的产量最高为880.18mg/L，因此达托霉素发酵的最适温度为28 ℃.图1 发酵温度对达托霉素发酵的影响Fig.1 Effect of fermentation temperature on doxymycin fermentation2.1.2 初始pH值对达托霉素发酵结果的影响在不同的发酵初始pH值条件下，当发酵初始pH值为8.0时(图2)，达托霉素的产量最高为879.83 mg/L，所以选定达托霉素发酵初始pH值为8.0.图2 初始pH值对达托霉素发酵的影响Fig.2 Effect of initial pH value on the fermentation of doxymycin2.1.3 接种量对达托霉素发酵结果的影响选择不同的接种量 4%、6%、8%、10%和12%进行发酵，然后测定达托霉素的产量，从图3 可以看出当接种量为10%时，达托霉素的产量最高为881.52 mg/L，所以达托霉素发酵的最适接种量为10%.图3 接种量对达托霉素发酵影响Fig.3 Effect of inoculation volume on the fermentation of doxymycin2.1.4 通风量对达托霉素发酵结果的影响选取不同的通风量 3.0、4.0、5.0、6.0和7.0 L/min，测定达托霉素的产量，当通风量为6.0 L/min时(图4)，达托霉素的产量最高为883.57 mg/L，因此达托霉素发酵最适的通风量设为为1.2 L/min.2.1.5 搅拌转速对达托霉素发酵结果的影响其他条件不变，分别选取不同的搅拌转速 150、200、250、300和350 r/min，测定达托霉素的产量，从图5 可以看出当搅拌转速为250 r/min时，达托霉素的产量最高，为882.69 mg/L，因此选择250 r/min作为发酵搅拌速度.图4 通风量对达托霉素发酵影响Fig.4 Effect of ventilation on doxymycin fermentation图5 搅拌转速对达托霉素发酵影响Fig.5 Effect of stirring speed on the fermentation of doxymycin2.2 发酵条件的响应面优化2.2.1 回归模型建立以达托霉素产量为因变量Y，温度A、初始pH值B、接种量C、通风量D和搅拌转速E为自变量,利用Design-Expert 8.0.6软件对数据进行回归分析,建立多元回归模型[9-11]：Y=100.00+5.94A+16.58B+15.64C+8.37D+10.31E+10.75AB+4.69AC-3.38AD-5.47AE-8.05BC+14.38BD-3.06BE+0.93CD+7.27CE-12.52DE-17.49A2-13.51B2-18.94C2-27.28D2-15.27E2.以单因素结果为依据设计Box-Behnken试验的因素水平，响应面的实验结果见表2.表2 Box-Behnken试验结果Tab.2 Results of the Box-Behnken test序号ABCDE达托霉素产量/(mg/L)1-1-1000861.7921-1000863.633-11000865.59411000882.58500-1-10878.546001-10881.48700-110885.38800110876.6990-100-1864.72100100-1874.82110-1001873.571201001871.7313-10-100858.951410-100878.1515-10100853.691610100885.2817000-1-1877.63180001-1879.4019000-11875.292000011877.47210-1-100872.712201-100875.74230-1100868.372401100882.5025-100-10861.5426100-10864.9227-10010858.292810010879.482900-10-1872.62300010-1873.933100-101879.373200101872.7033-1000-1862.39341000-1869.4835-10001859.623610001869.49370-10-10870.5638010-10874.83390-1010869.0440********.684100000872.834200000872.834300000872.8344 00000872.834500000872.834600000872.832.2.2 达托霉素产量的方差分析对回归方程进行方差分析，分析结果见表3.表3 达托霉素产量回归模型方差分析Tab.3 Variance analysis of the yield regression model of doxymycin方差来源平方和自由度均方F值Pr>F模型18436.8220921.84113.32626<0.0001A3482.38513482.38528.49827<0.0001 B2548.747212548.747226.36289<0.0001C1327.648111327.648117.468350. 0126D1208.386811208.386813.658360.00002E896.43821896.43828.368257 40.0013AB368.58361368.58366.6754210.0021AC73.8753173.87530.586433 0.0467AD56.8393156.83930.6498210.0864AE264.98451264.98454.7832900. 0058BC149.63861149.63862.9078320.0026BD87.5938187.59380.9080620.0 012BE272.74321272.74324.0468360.0038CD63.0843163.08430.7063270.00 95CE83.7593183.75930.8979640.0012DE268.48761268.48764.5863250.004 7A23638.743813638.743827.876490<0.0001B23217.764313217.764324.58 7253<0.0001C24831.738214831.738237.849085<0.0001D22158.46841215 8.468414.4725840.0003E2947.35721947.35727.4638920.0015残差2642.764725105.7106失拟2642.764720132.1382标准误差050R2=0.9643从表3可以看出：模型的F值为13.33，Pr>F小于0.0001，表明自变量(A、B、C、D、E)和因变量Y之间线性关系极显著，所建立的回归方程可以对真实曲面模拟；相关系数R2=0.9643表明模型拟合程度高，置信度高[7]，可以利用建立的模型分析达托霉素产量的变化.利用Design Expert 8.0.6软件对回归方程进行一阶偏导求解[12,13]，曲面最大点对应A=0.42、B=1.35、C=0.32、D=0.45、E=0.21，所对应的达托霉素发酵的条件分别为：温度27.74 ℃、pH值8.36、接种量8.48%、通风量6.13 L/min、搅拌转速242 r/min.2.2.3 达托霉素发酵条件实验验证为了验证响应面结果的可靠性，采用响应面实验条件(温度27.74 ℃、pH值8.36、接种量 8.48%、通风量 6.13 L/min、搅拌转速 242 r/min)进行小型发酵罐发酵实验，4个平行，结果显示，达托霉素的产量达到880.48 mg/L.3 结语达托霉素是一种新型抗生素，主要通过发酵法进行生产，但发酵产量一直不高限制了达托霉素的大规模使用. 本研究在单因素实验的基础上，采用响应面法对达托霉素发酵工艺条件进行优化，优化后发酵工艺条件为温度27.74 ℃、pH值 8.36、接种量 8.48%、通风量 6.13 L/min、搅拌转速242 r/min，在此条件下达托霉素的效价可达880.48 mg/L，比最新文献[14-17]报导的结果高出50%～132%，发酵效价大幅度提高，此次研究对工业化发酵生产达托霉素具有重要的参考价值. 要进一步提高发酵的效价，在发酵过程中最好筛选出合适的前体，采用流加方式发酵，这将是本研究下一步的工作.参考文献【相关文献】[1] 何美儒，金志华，胡升，等．补加葡萄糖对玫瑰孢链霉菌发酵产述托霉素的影响[J].中国医药工业杂志，2012，43(8)：662-665.[2] 周剑，黄建峰，张引，等．低能离子注入诱变达托霉素高产菌株及其发酵的研究[J]．中国抗生素杂志，2012，37(8)：587-592.[3] PARTHIBAN K，VIGNESH V， THIRUMURUGAN R．Characterization and in vitro studies on anticancer activity of exopolymer of Bacillus thuringiensis S13[J]．African Journal of Biotechnology,2014，13(21)：37-44.[4] 于红，杨文菊，刘波，等．RRLC定性检测食用油中10种抗氧化剂的条件研究与应用[J]．新疆医科大学学报，2011,34(2)172 -174.[5] 余继叁，洪葵，林海鹏，等．玫瑰孢链霉菌NRRL11379产达托霉素前体物A21978C的发酵培养基优化[J]．安徽农业科学，2008，36(19)：7974-7976.[6] 周剑，张引. 达托霉素产生菌前体物耐受选育及其流加补料发酵[J].中国抗生素杂志，2018，7(43)：817-823.[8] 郭朝江，张兰，王成，等.缓释癸酸前体对玫瑰孢链霉菌发酵产达托霉素的影响[J].中国医药工业杂志，2013，44(3)：238-241.[7] ZHANG X，ZHANG X F，Li H P，et a1．Atmospheric room temperature plasma(ARTP) as a new powerful mutagenesis tool[J]．Appl Microbiol Biotechnol,2014，98(12)：5387—5396.[9] LU C Y，ZHANG X J，JIANG M，et al．Enhanced salinomycin production by adjusting the supply of polyketide extender units in Streptomyces albus[J]．Metab Eng，2016，8(35)：129-137．[10] 谷宇锋，王淑歌，郝海红，等. 亚抑菌浓度抗生素对细菌耐药性和毒力影响的研究进展[J].中国抗生素杂志， 2018，43(11): 1321-1331.[11] REN J，CUI Y Q，ZHANG F，et a1.Enhancement of nystatin production by redirecting precursor fluxes after disruption of the tetramycin gene from Streptomyces hygroscopicus[J]．Microbiol Res，2014，169(7-8)：602-608．[12] YIN C，ZHANG T,QU X，et al．In vivo excision of HIV1 provirus by saCas9 and multiplex single-guide RNAs in animal models[J]．Mol Ther,2017，25(5)：1168-1186．[13] 王世博，李平兰，张金兰，等. 二肽基肽酶-IV抑制活性酵母筛选与鉴别[J]. 中国酿造, 2018, 37(9): 48-51.[14] JIAO Z，WANG X，YIN Y，et a1．Preparation and evalua-tion of a chitosan-coated antioxidant liposome containing vitamin C and folic acid[J]．J Microencapsul,2018,6(9):1-9．[15] SUN H, YAN P, LU P,et a1．Effects of exogenous addition of vitamin C on ε-poly-L-lysine fermentation by Streptomyces[J]．Food and Fermentation Industries, 2018, 44(9):29-35.[16] 薛海萍，高婷婷，杨骏，等．红景天苷磷脂复合物的体外透皮试验[J]．中国实验方剂学杂志，2016，22(9)：9-11．[17] DAS M K，KALITA B，et al．Design and evaluation of phytophospholipid complexes (phytosomes)of rutin for transdermal application[J]．J Appl Pharm Sci，2014，4(10)：51-57．。

从天然产物到药物——达托霉素的发展历程

从天然产物到药物——达托霉素的发展历程
王玮;穆青
【期刊名称】《国外医药（抗生素分册）》
【年(卷),期】2009(030)002
【摘要】达托霉素是微生物产生的环状脂肽抗生素,20世纪80年代末由美国礼来公司发现.1997年Cubist制药公司从礼来公司获得了达托霉素的全球独家开发、生产及销售权.经过6年的研发,2003年美国FDA相继批准了Cubicin(R)(达托霉素注射剂)用于治疗成年人由革兰阳性菌(包括耐甲氧西林金黄葡萄球菌与耐万古霉素肠球菌等)所致的复杂性皮肤和软组织感染(cSSSI),以及金葡菌引起的菌血症和右侧心内膜炎,目前尚未批准系统用药.本文总结了达托霉素的研发历程,包括其发现、抗菌活性、临床试验,结构修饰及合成方法等.
【总页数】4页(P59-62)
【作者】王玮;穆青
【作者单位】复旦大学药学院天然药化教研室,上海,200032;复旦大学药学院天然药化教研室,上海,200032
【正文语种】中文
【中图分类】Q939.92
【相关文献】
1.天然产物在新药发现中的地位与机会(Ⅲ)——有机合成化学扩大了天然产物作为药物先导化合物的可能性 [J], 王普善
2.天然产物在新药发现中的地位与机会(Ⅰ)--重新审视天然产物药物发现战略 [J], 王普善
3.在天然药物化学实验教学中增加海洋天然产物实验的探索 [J], 史大华;马卫兴;司鑫鑫
4.系统筛选与评价作为天然产物-药物相互作用药代动力学沉淀剂的天然产物的方法（英文） [J], Mary F PAINE
5.“全国天然药物及传统药物发展研讨会及CSNR天然产物专业学组成立大会”在西安召开 [J], 何筠
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达托霉素及其衍生物生物合成的研究进展

达托霉素及其衍生物生物合成的研究进展万涛;齐海山;陈云琳;闻建平【期刊名称】《化工进展》【年(卷),期】2012(031)007【摘要】With continuous appearance of highly pathogenic bacteria which are resistant to antibiotics,the need for new antibiotics becomes much pressing in clinical medicine.As the first production of cyclo-lipotpeptied antibiotics daptomycin has effective bactericidal effect to antibiotic resistant bacteria.Because of its convenience in preparation and treatment,as well as insignificant side effects,daptomycin is the perfect replacement of vancomycin recognized as the last line of defense to pathogen.On the basis of introducing physical and chemical characteristics,antimicrobial activity and research achievement of synthetic genetic cluster of daptomycin,this paper mainly summarizes research situation of daptomycin and its derivatives.And the paper also presents perspectives about production of daptomycin and development of its derivatives,including combining with system biology to provide guidance for daptomycin strains＇ further metabolic engineering improvement and utilizing synthetic biology to make derivatives of daptomycin new antibiotic.%随着高致病耐药菌的不断出现,临床上对新抗生素的需求十分迫切。

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微生物发酵生产达托霉素的研究进展
摘要】达托霉素是从玫瑰孢链霉菌发酵液中提取出的具环脂肽结构复合物
A21978中的一种，是一种酸性脂肽类抗生素。

达托霉素属于钙离子依赖性抗生素，在钙离子的存在下它以独特的作用模式破坏细胞膜的完整性，进而扰乱细胞膜对
氨基酸的转运，从而阻碍细菌细胞壁肤聚糖的生物合成，最终导致细胞死亡。

由
于其不易产生交叉耐药的问题，因此主要用于治疗耐药菌引起的感染和疾病。

【关键词】达托霉素；玫瑰孢链霉菌；发酵
【中图分类号】R37 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）31-0007-02
The research progress of microbial fermentation production of supporting toxin
Lin Weiyue. Shenzhen Jiatai Pharmaceutical co., LTD., Guangdong Province, Shenzhen 518103, China
【Abstract】To Joe drug extracted from rose spore of Streptomyces fermented with ring lipid compounds in A21978, a peptide structure, fat is a kind of acidic peptide antibiotics. Dependence of tora toxin belongs to calcium ion antibiotics, in the presence of calcium ions it destroy the integrity of the cell membrane by the unique role model, and disrupt the cell membrane transport of amino acids, which hinder the biosynthesis of bacterial cell walls skin glycan, eventually leading to cell death. Because of its not easy to produce cross resistance problem, so it is mainly used for treatment
of drug-resistant bacteria infections and diseases.
【Key words】Toxin; Rose spore Streptomyces; Fermentation
1.简介
达托霉素是从玫瑰孢链霉菌发酵液中提取出的具环脂肽结构复合物A21978中的一种，由一个十碳烷侧链与一个环状β-氨基酸肽链N-末端的色氨酸连接组成，
是一种酸性脂肽类抗生素，分子式为C72H101N17O26，分子量1620.67。

达托霉
素属于钙离子依赖性抗生素，在钙离子的存在下它以独特的作用模式破坏细胞膜
的完整性，进而扰乱细胞膜对氨基酸的转运，从而阻碍细菌细胞壁肤聚糖的生物
合成，最终导致细胞死亡。

由于其不易产生交叉耐药的问题，因此主要用于治疗
耐药菌引起的感染和疾病[1]。

2.达托霉素微生物发酵生产方法的研究
玫瑰孢链霉菌发酵产物A21978C是达托霉素的先导物。

达托霉素可以通过半
合成法对A21978C经过脱酰和癸酸酰化获得，也可以通过在发酵液中加入癸酸或
癸酸钠等外源性前体，在生物酶的作用下引入癸酸侧链而形成。

微生物发酵方法
简单快速、产量较高且污染较小，是达托霉素大规模生产所用方法的主流。

2.1 达托霉素的前体导向法发酵生产
对达托霉素发酵培养基和发酵工艺进行优化是提高达托霉素生产水平的主要
方法之一。

刘省伟等[2]使用均匀设计优化了达托霉素的发酵培养基，筛选出了适
用于发酵的氮源和碳源。

优化后的发酵培养基可使达托霉素发酵单位提高30%以上。

何美儒等[3]考察了摇瓶及2.5L发酵罐中补加葡萄糖对达托霉素发酵的影响，并确定了分批补糖方法，为工业化生产提供了参考。

王蓓等[4]对达托霉素液态发酵的工艺进行了优化并申请专利，研究确立了最
佳培养基组成和培养优化条件，2吨发酵罐培养效价达到1080μg/ml，为规模化
生产奠定了基础。

郭朝江[5]等经过建立玫瑰孢链霉菌发酵生产达托霉素的补料分
批发酵动力学模型，为高效生产达托霉素提供了更深入的理论依据和更有效的调
控手段。

2.2 达托霉素高产菌株的筛选
菌种选育是抗生素发酵生产中非常重要的一环，通过诱变和筛选获得达托霉
素高产菌株是提高达托霉素发酵单位的主要方法之一。

张智翔等[6]使用链霉素和
达托霉素联合抗性筛选法，筛选出可高产达托霉素的玫瑰孢链霉菌株并。

与原始
菌株相比，筛选出的高产菌株达托霉素产量提高了63.8%，达到59mg/L。

刘体颜
等[7]使用紫外诱变45s，利福平14μg/ml和庆大霉素1.0μg/ml对玫瑰孢链霉菌进
行筛选，得到突变株的达托霉素最高产量为74.99mg/L，比原始菌株提高了42.2%。

段向东[8]采取紫外诱变、亚硝基胍NTG诱变、原生质体外紫外诱变和癸酸抗性处理诱变等方式对达托霉素生产菌进行诱变处理，所获得的高产菌株达托霉素摇瓶
发酵单位为428.1ml/L，比原始出发菌株提高了约15倍。

王秀琴等[9]使用氦氖激
光辐照-亚甲基胍复合诱变对达托霉素生产菌进行筛选，得到的高产菌株发酵单位
比出发菌株高35%。

2.3 微生物发酵法中达托霉素的提取工艺
达托霉素的提取是个多步纯化的过程，分离提纯达托霉素的主要方法包括大
孔树脂吸附法、离子交换法及HPLC制备提取法等等。

石磊等[10]利用大孔吸附树
脂HZ818对pH调至7.5的发酵预处理液进行提取，分离效果良好。

水洗树脂柱
之后使用75%乙醇溶液进行解吸，回收率达到90%，达托霉素纯度达到80%。

王
泽根等[11]使用阴离子交换树脂330对离心预处理的发酵液进行提取，在静态吸
附饱和后使用0.8mol/L的氯化钠溶液静态洗脱，回收率达到87.5%，达托霉素纯
度从2%提升到60%。

姜永慧[12]采用高速逆流色谱对预处理后的达托霉素发酵液
进行分离，收集液冷冻干燥后得到纯度大于94%的达托霉素。

相较而言，大孔树
脂吸附法和离子交换法耗资较少、工艺流程简单、污染较小，更适用于达托霉素
工业化的提纯过程。

3.结论与展望
达托霉素属于临床急需的的抗多重耐药细菌大品种药物，由于其的特殊性和
广阔的市场前景，目前在国内已有华东医药、华北制药集团等单位对达托霉素的
性质、生产等进行了多年开发与研究。

浙江医药和海正药业等企业已具备达托霉
素生产能力。

随着研究的深入，将会实现其工业化规模生产，造福患者。

【参考文献】
[1]赵增任，唐巍，赵晋.新型抗生素药物——达托霉素[J].教科文汇，2008，02，197.
[2]刘省伟，赵德.用均匀设计优化达托霉素发酵培养基[J].中国抗生素杂,2011,36,S4-S7.
[3]何美儒，金志华，胡升等.补加葡萄糖对玫瑰孢链霉菌发酵产达托霉素的影响[J].中国医药
工业杂志，2012,43，662-665.
[4]王蓓，谢详茂，陈俊勇等.液态发酵法生产达托霉素的培养条件优化研究[J].中国抗生素杂志,2013,38,204-207.
[5]郭朝江，王相金，王化民.玫瑰孢链霉菌补料分批发酵生产达托霉素的动力学模型[J].中国
抗生素杂志，2014，39，241-244.
[6]张智翔，段然，敬科举等.组合抗性筛选法选育达托霉素高产菌株[J].中国抗生素杂志，2012，37，202-205.
[7]刘体颜，邢玉华，戴素琴等.达托霉素生产菌（ATCC31568）的紫外诱变和抗生素抗性筛选[J].中国抗生素杂志，2013，38,64-669.
[8]段向东.达托霉素产生菌的菌种选育及发酵工艺研究[J].研究生学位论文，2014.
[9]王秀琴,娄忻,张雪霞等.复合诱变法筛选达托霉素高产菌株[J].化学与生物工程，2015，32.
[10]石磊，史丽娟，蒋沁等.达托霉素发酵液大孔树脂吸附分离的研究[J].2008，33，
[11]王泽根，王文轶，吴旻等.阴离子交换树脂对Streptomyces_roseosporus发酵液中达托霉素
的分离纯化研究[J].2011.
[12]姜永慧.利用高速逆流色谱分离制备达托霉素.科技论坛.。