中华鳖胚胎组织原代细胞培养技术的研究

曹　铮，林　锋，卢淑娟，等．中华鳖胚胎组织原代细胞培养技术的研究［Ｊ］．江苏农业科学，２０１９，４７（６）：１４１－１４３．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１９．０６．０３１

中华鳖胚胎组织原代细胞培养技术的研究

曹　铮，林　锋，卢淑娟，吕孙建，刘　莉

（农业部淡水渔业健康养殖重点实验室／浙江省鱼类健康与营养重点实验室／浙江省淡水水产研究所，浙江湖州３１３００１）

摘要：基于当前市场上中华鳖商业化细胞缺乏，不利于开展其病害防控研究的现状，以中华鳖胚胎为对象，采用组织块原代培养技术，从孵育１５～２０ｄ的受精卵中获得适宜的胚胎组织，经抗生素、乙醇消毒，通过无菌条件下将组织块均匀分散贴壁在细胞瓶中，然后于３０℃恒温培养箱中贴壁培养４ｈ后加入无血清Ｍ１９９培养基多次清洗，从而获得了中华鳖胚胎组织原代细胞；在此基础上分别对中华鳖胚胎细胞传代培养条件、冻存与复苏等进行系统性研究，初步确定中华鳖胚胎细胞培养温度为２６℃，Ｍ１９９或Ｌ－１５培养基，血清浓度为１５％（体积分数），通常７ｄ传代１次；二甲亚砜冻存保藏后，细胞复苏生长状况正常。 关键词：中华鳖；胚胎；原代细胞；培养

中图分类号：Ｓ９６６．５ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０１９）０６－０１４１－０３

收稿日期：２０１７－１１－０１

基金项目：浙江省科研院所扶持专项（编号：２０１７Ｆ５００１４）；浙江省自然科学基金（编号：ＬＹ１５Ｃ１９０００１）。

作者简介：曹　铮（１９６１—），男，浙江湖州人，工程师，主要从事水产病害与细胞培养研究。Ｔｅｌ：（０５７２）２０４１４０３；Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｚ０３０５＠１６３．ｃｏｍ。

通信作者：刘　莉，博士，研究员，主要从事水产病害防控研究。Ｔｅｌ：（０５７２）２０４５１３２；Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｕｌｉ６６５５＠Ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ。

中华鳖是一种名贵的、经济价值很高的水生动物。在动物分类上，中华鳖属脊索动物门、脊索动物亚门、爬行纲、无孔亚纲、龟鳖目、曲颈龟亚目、鳖科（Ｔｒｉｏｎｙｃｈｉｄａｅ）。鳖科现有７属２３种，我国仅有２属３种，其中鳖属有２个种，即中华鳖（

Ｃｈｉｎｅｓｅｓｏｆｔ－ｓｈｅｌｌｅｄｔｕｒｔｌｅ，Ｐｅｌｏｄｉｓｃｕｓｓｉｎｅｎｓｉｓ）和山瑞鳖（Ｐａｌｅａｓｔｅｉｎｄａｃｈｎｅｒｉ），其中以中华鳖最为常见。２０世纪６０年代日本开始进行中华鳖的人工养殖，我国的台湾、泰国等地随日本之后开始发展中华鳖的人工养殖，中国大陆大约于上世纪７

０年代中后期开始进行中华鳖工厂化人工养殖。随着我国人民生活水平的日益提高，对鳖的市场需求稳步增长，中华鳖养殖从２

０世纪９０年代初期至中期进入了高速发展期。养殖技术也由集约化程度较低的池塘养殖转化为集约化程度较高的室内控温温室养殖，养殖密度大大提高。然而，随着中华鳖规模化养殖的迅猛发展，品种退化、病害严重以及基础研究薄弱等问题逐步影响着中华鳖健康养殖的可持续发展，特别是中华鳖各种病害大规模暴发，养鳖业损失惨重［１］

。中华鳖

病害防治成为中华鳖养殖过程中的关键环节之一，它直接关

系到养殖者的经济效益。

近些年来，在广大科研人员的努力下，中华鳖病害防控研究取得了一定成果，譬如张奇亚等首次从有典型症状、濒于死亡的患病鳖样品检测到呈球形、大小直径约为３０ｎｍ的病毒样粒子

［２］

；１９９９年，Ｃｈｅｎ等从患“红脖子”病的中华鳖分离到

了直径１２０～１６０ｎｍ的鳖虹彩病毒［３］

；２００１年，范红结等从

患病的中华鳖中分离到雷氏普罗威登菌，可引起中华鳖的败血症，并造成肺脏、脾脏等内脏广泛形成干酪样结节

［４］

；２００２

年，孙红祥等从从患穿孔病、腐皮病、溶血性腹水病等濒死鳖

的肝、心血和腹水中分离到２

０株细菌［５］

；２００７年，沈锦玉等从患白底板病的中华鳖分离到嗜水气单胞菌和迟缓爱德华氏

菌［６］

；２００８年，Ｌｉ等从患白斑病的中华鳖中成功分离到淡紫拟青霉［

７］

；２０１５年，刘莉等从患出血症的中华鳖中分离到了直径约１００ｎｍ的ＲＮＡ病毒［８］

。然而，由于缺少来源于中华

鳖的细胞系，导致中华鳖生物学相关的基础研究相对滞后，加上养殖环境的复杂性、病原的多样性，导致无法对引起中华鳖发病的致病机制进行判定，进而也无法采取有效的措施来进行防治。因此，本研究采用组织原代培养技术，完成了中华鳖胚胎原代细胞培养，建立了可连续传代的细胞系，将为中华鳖细胞生物学及其病害防控研究等提供有力支撑。１　材料与方法１．１　材料

１．１．１　试验鳖卵　健康中华鳖卵（受精卵孵化期在１５～２５ｄ），来自浙江某中华鳖养殖场。

１．１．２　试剂与耗材　青霉素、链霉素、磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）、胰酶（Ｔｙｐｓｉｎ）、二甲基亚砜（ＤＭＳＯ），均购自Ｓｉｇｍａ公司；培养基Ｍ１９９、Ｌ－１５、胎牛血清（ｄｅｆｉｎｅｄｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ，ＤＦＢＳ），均为Ｇ

ｉｂｃｏ公司产品；细胞培养瓶、移液管、过滤器、移液辅助器等，均购自Ａｘｇｅｎ公司。

１．１．３　仪器　倒置显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ），Ⅱ级生物安全柜（Ｅｓｃｏ），低速冷冻离心机（Ｓｉｇｍａ），二氧化碳培养箱（Ｔｈｅｒｍｏｌ），恒温培养箱（Ｓａｎｙｏ），液氮罐（ＭＶＥ）。１．２　试验方法

１．２．１　原代培养　胚胎的收集：选取已受精孵化１５～２５ｄ的受精卵，先将卵体表用７０％～７５％乙醇喷洒，然后用眼科剪剪破卵壳，用眼科弯头镊子将胚胎从卵黄中取出，移入１×ＰＢＳ（ｐＨ值为７．４，５００Ｕ／ｍＬ青霉素，５００Ｕ／ｍＬ链霉素）中待用。

将分离出来的胚胎组织放在１×ＰＢＳ（ｐＨ值为７．４，５００Ｕ／ｍＬ青霉素，５００Ｕ／ｍＬ链霉素）中清洗２遍，然后置于

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１４１—江苏农业科学　２０１９年第４７卷第６期