大肠杆菌高密度发酵
基因工程重组大肠杆菌BL21-FMDV-B4高密度发酵的优化研究
基因工程重组大肠杆菌BL21-FMDV-B4高密度发酵的优化研究基因工程重组大肠杆菌BL21-FMDV-B4高密度发酵的优化研究摘要：基因工程技术在现代生物学研究中扮演着重要角色，其中重组大肠杆菌的高密度发酵是生产重组蛋白的关键步骤之一。
本研究旨在优化基因工程重组大肠杆菌BL21-FMDV-B4的高密度发酵过程，从而提高目标蛋白的产量和纯度。
通过优化分析发酵条件、培养基组成以及流程设计，实现了对目标蛋白高效表达的优化。
引言：口蹄疫是一种传染性疾病，严重威胁到了畜牧业的健康发展。
基因工程技术提供了一种制备和表达相关病毒蛋白的方法，为疫苗研发和疫病防控提供了有力支持。
本研究以口蹄疫病毒血清型B4为目标蛋白，通过利用基因工程重组大肠杆菌BL21系统来高效表达和纯化目标蛋白，从而为口蹄疫疫苗的研究和生产奠定基础。
材料与方法：1. 介绍BL21-FMDV-B4菌株的构建及质粒的转化；2. 优化培养基配方和条件：通过改变碳源、氮源、金属盐和抗生素浓度等因素来寻找最佳表达条件；3. 优化发酵过程：调整发酵时间、发酵温度以及pH值等因素来提高目标蛋白的表达水平；4. 实时监测目标蛋白的表达量和纯度：采用SDS-PAGE和Western blotting进行蛋白质分析。
结果与讨论：经过优化后，我们成功获得高密度表达口蹄疫血清型B4的重组大肠杆菌BL21菌株。
最佳培养基组成为：碳源为葡萄糖，氮源为酵母浸出物，抗生素为氨苄青霉素。
在最佳培养条件下，重组菌株BL21-FMDV-B4在37℃下发酵12小时，初始pH设定为7.0。
通过实时监测发酵过程中菌体密度、发酵液酸度和宏观形态等指标，得到了最佳发酵时间和条件。
经过优化后的发酵过程，我们的研究结果发现，相比于常规条件，目标蛋白的表达量和纯度显著提高。
通过SDS-PAGE和Western blotting分析，我们证实目标蛋白在重组大肠杆菌中得到成功表达和高效纯化。
结论：通过针对基因工程重组大肠杆菌BL21-FMDV-B4高密度发酵的优化研究，本研究成功提高了目标蛋白的产量和纯度。
猪致病性大肠杆菌高密度发酵条件优化的研究的开题报告
猪致病性大肠杆菌高密度发酵条件优化的研究的开
题报告
猪致病性大肠杆菌是一种常见的细菌性病原体，可能引起猪群的腹泻、呕吐以及其他消化系统疾病。
在猪肉业中，这种病菌会严重影响养
猪效益，因此针对其高效防治是关键的技术研究方向。
发酵技术是一种生产高效的细菌量的重要手段，但是对猪致病性大
肠杆菌发酵过程的研究还需要进一步深入。
因此，本文旨在探究猪致病
性大肠杆菌高密度发酵条件的优化研究。
本文的研究内容包括：（1）采样筛选猪致病性大肠杆菌的优良菌株，（2）建立适宜猪致病性大肠杆菌高密度发酵的培养基成分以及培养条件，（3）研究不同发酵条件下的猪致病性大肠杆菌生长动力学及细菌数量变化规律，（4）分析猪致病性大肠杆菌发酵产物的主要营养成分及微生物安全性。
通过实验，我们将逐步探究不同培养条件对于猪致病性大肠杆菌高
密度生长的影响，家禽饲料、动物血浆以及葡萄糖、酵母粉和蛋白胨等
添加物作为基础培养成分，运用响应面试验方法，进行优化研究。
同时，我们将使用红外光谱分析法以及菌落计数法、凝胶过滤法等分别对发酵
产物进行分析，最终确定一种针对猪致病性大肠杆菌高密度发酵的优化
发酵工艺。
本文研究成果不仅对猪肉业的可持续发展提供了技术支持，对于研
究动物肠道菌群 also 有重要的借鉴价值。
提高大肠杆菌高密度发酵可溶性表达量研究
提高大肠杆菌高密度发酵可溶性表达量研究目的：提高外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量。
方法：采用大肠杆菌K12菌株，含有表达某种抗体类蛋白的表达质粒，通过在发酵过程中加入甲硫氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的方式，检测不同发酵时间表达量变化情况，评估每种物质对于目的蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的影响。
结果：同时加入甲硫氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的发酵批次可溶性蛋白表达量最高。
结论：说明在大肠杆菌高密度发酵过程中加入甲硫氨酸、亮氨酸和异亮氨酸有助于提高目的蛋白的可溶性表达。
标签：大肠杆菌；高密度发酵；甲硫氨酸；亮氨酸；异亮氨酸；可溶性表达大肠杆菌是目前常用的蛋白发酵菌体，采用高密度发酵技术（High cell density cultivation，HCDC）不仅可以减少培养体积、提高目的蛋白产量，还可以缩短生产周期，减少设备投资从而降低生产成本，能极大地提高在市场上的竞争力[1]。
但外源蛋白在获得高水平表达的同时，容易形成包涵体，包涵体中的多肽链折叠错误，没有活性，必须通过复杂的复性过程才能获得功能正常的蛋白，但成功率低[2]，特别是含二硫键较多的包涵体蛋白，在复性过程中容易发生二硫键的错配，从而使蛋白质失去生物学活性。
蛋白的可溶性表达则可避免变、复性过程，明显简化后续纯化工艺，保证功能蛋白的功能。
因此，探索外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达具有较高的学术价值和广泛的应用前景。
目前针对于高密度发酵过程中蛋白可溶性表达的研究主要停留在对大肠杆菌宿主细胞[3]、比生长速率、诱导时机[4]、诱导温度[5]、培养基成分[6]、碳源种类[7]、表达载体启动子[8]、融合标签[9]等。
关于发酵过程中补入氨基酸对可溶性蛋白表达的影响，国内目前的相关研究报道偏少。
国外研究表明，在大肠杆菌表达蛋白期间，正亮氨酸残基的引入会导致正常合成的蛋白结构或功能改变[10]，引起可溶性蛋白表达量的降低。
在发酵过程中，补入甲硫氨酸，可以确保细胞获得过量的甲硫氨酸，从而减少了甲硫氨酰tRNA不正确的加载正亮氨酸的概率。
重组大肠杆菌高密度发酵工艺流程
重组大肠杆菌是一种重要的工业微生物，具有广泛的应用价值。
在大肠杆菌高密度发酵过程中，流程的设计和优化对产品的质量和产量具有重要影响。
本文将围绕重组大肠杆菌高密度发酵工艺流程展开讨论，探讨其流程设计、优化及相关技术。
通过对该工艺流程的深入研究，不仅可以提高重组蛋白的产量和纯度，还可以降低生产成本，为工业生产提供可靠的技术支持。
一、高密度发酵工艺流程概述1.1 菌种培养和预处理重组大肠杆菌菌种的培养是整个发酵过程的基础。
首先需要进行菌种的接种培养，培养基的选择、发酵条件的控制对于菌种的生长和繁殖至关重要。
对菌种的预处理也至关重要，包括对菌种进行筛选和培养基的调整等。
1.2 发酵过程控制发酵过程控制是重组大肠杆菌高密度发酵的关键环节，包括培养基的添加、通气量的控制、温度、pH值的调节等。
合理的发酵过程控制可以保证菌体的生长和代谢活性，从而提高产物的产量和纯度。
1.3 产物的回收和纯化重组大肠杆菌高密度发酵后，产物的回收和纯化也是至关重要的环节。
通过合理的回收和纯化工艺，可以获得高纯度的重组蛋白产品，满足不同应用领域的需求。
二、高密度发酵工艺流程优化2.1 发酵条件的优化在重组大肠杆菌高密度发酵过程中，发酵条件的优化对产品的产量和质量具有重要影响。
包括但不限于培养基配方的优化、发酵温度、通气量、pH值等参数的优化，通过优化发酵条件可以提高菌体的生长速率和产物的表达水平。
2.2 发酵过程监测与控制发酵过程的监测与控制是优化工艺流程的重要手段，包括对菌体生长情况的实时监测、代谢产物浓度的检测以及对发酵过程参数的实时调节等。
通过发酵过程的精准监测和控制，可以最大程度地发挥菌体的生长和代谢潜力。
2.3 产物回收与纯化工艺的改进产物的回收与纯化是影响产品质量的关键因素，通过改进产物回收与纯化工艺，可以提高产品的纯度和收率，降低生产成本，提高经济效益。
三、高密度发酵工艺流程相关技术3.1 培养基配方优化技术合理的培养基配方对于重组大肠杆菌的生长和表达具有重要影响，通过优化培养基配方，可以提高菌体的生长速率和产物的表达水平。
重组大肠杆菌 高密度发酵工艺流程
重组大肠杆菌高密度发酵工艺流程重组大肠杆菌是一种常用的工具菌株，被广泛应用于生物工程领域。
高密度发酵是指在发酵过程中，通过优化工艺条件，使菌体达到较高的生长速率和产物产量。
本文将介绍重组大肠杆菌高密度发酵的工艺流程。
一、菌种培养重组大肠杆菌菌种的培养是高密度发酵的第一步。
首先，选择合适的菌种，通常是具有高表达能力的重组菌株。
然后，将菌种接种到培养基中，并在适当的条件下培养。
培养基的组成要根据菌株的特性进行优化，以促进菌体的生长和表达目标蛋白的产量。
二、发酵过程控制高密度发酵的关键是精确控制发酵过程中的各个参数，以最大限度地提高菌体的生长速率和产物产量。
常见的控制参数包括温度、pH 值、溶解氧浓度和搅拌速度等。
1.温度控制：重组大肠杆菌的适宜生长温度通常在37℃左右。
在发酵过程中，保持恒定的温度可以促进菌体的生长和产物的积累。
2.pH值控制：重组大肠杆菌对pH值的敏感性较高，通常在发酵过程中需要控制pH值在6-7之间。
可以通过添加缓冲剂来维持合适的pH值。
3.溶解氧浓度控制：溶解氧浓度是影响菌体生长的重要因素之一。
通过调节搅拌速度和通气量等参数，可以控制发酵过程中的溶解氧浓度，从而提高菌体的生长速率。
4.搅拌速度控制：适当的搅拌速度可以提供充分的氧气和营养物质，促进菌体的生长和产物的积累。
但过高的搅拌速度可能会导致剪切力过大，对菌体造成伤害。
三、营养物质的供应在高密度发酵过程中，菌体需要大量的营养物质来支持生长和产物的合成。
常见的营养物质包括碳源、氮源、磷源和微量元素等。
在发酵过程中，需要根据菌株的特性和产物的需求，合理调整营养物质的浓度和比例。
四、产物的回收和纯化高密度发酵得到的产物通常以细胞外分泌形式存在，因此需要对发酵液进行回收和纯化。
常用的方法包括离心、过滤、超滤和层析等技术。
通过这些步骤，可以将目标产物从发酵液中分离出来，并得到较高纯度的产物。
总结起来，重组大肠杆菌高密度发酵的工艺流程包括菌种培养、发酵过程控制、营养物质的供应和产物的回收和纯化等步骤。
表羰基还原酶的大肠杆菌高密度发酵的培养基优化设计
表羰基还原酶的大肠杆菌高密度发酵的培养基优化设计表羰基还原酶是一种重要的酶类，能够催化醛或酮化合物的还原反应。
大肠杆菌是常用的表羰基还原酶生产菌株之一。
在高密度发酵过程中，培养基的优化设计对于提高表羰基还原酶产量至关重要。
培养基的优化设计包括以下几个方面：基础培养基成分的选择、碳源和氮源的调节、微量元素和辅助因子的添加、pH和温度的控制以及培养条件的优化等。
首先，基础培养基成分的选择是培养基优化的基础。
常用的基础培养基成分包括碳源、氮源、无机盐和缓冲剂等。
在设计培养基时，需要考虑到大肠杆菌对碳源和氮源的需求，选择适宜的成分进行配比。
其次，碳源和氮源的调节对于表羰基还原酶产量的调控至关重要。
碳源的选择应考虑其对大肠杆菌生长和表羰基还原酶产量的影响。
常用的碳源包括葡萄糖、甘油等。
氮源的选择也要考虑其对表羰基还原酶产量的影响，常用的氮源包括酵母提取物、胰蛋白胨等。
此外，微量元素和辅助因子的添加对于培养基的优化也是十分重要的。
微量元素如铁、锌、铜等能够促进表羰基还原酶的合成和活性，辅助因子如维生素等能够提高大肠杆菌的生长和代谢能力。
调控培养基的pH和温度也是重要的因素。
pH的控制可以通过添加缓冲剂来实现，一般大肠杆菌的生长适宜的pH范围为6.5-7.5。
温度的控制需要根据大肠杆菌的生长特性和表羰基还原酶的最适工作温度来确定。
最后，优化培养条件也是提高表羰基还原酶产量的关键。
包括摇床转速、氧气供应、培养时间等因素的调控，以及对产酶菌株的预处理等。
通过以上的培养基优化设计，可以提高大肠杆菌表羰基还原酶的产量，并为进一步应用提供了可靠的基础。
大肠杆菌高密度发酵研究
的目的。
万方数据
２８
Ａｎｉｍａｌ
ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉ耻Ｖ０１．１８
Ｎｏ．１（Ｔｏｔａｌ№．７３）
菌ｗｓＨ—ＫＥ发酵２４ ｈ，细胞干重达最大，细胞内 ＧｓＨ含量也高于其它糖浓度ｏ］。对高密度发酵大肠 杆菌生产重组人骨形成蛋白一２Ａ的研究也表明：基质 中初糖浓度为１０ ｇ／Ｌ时细胞浓度和产物表达量均获 得了较好的效果”］。上述研究表明：当培养基中糖初 始浓度为１０ ｇ／Ｌ时，可获得理想的发酵效果。如果培 养基中糖浓度过高，超过菌体生长需要量，则会导致 乙酸生成。糖浓度超过５０ ｇ／Ｌ时大肠杆菌的生长将 受到抑制…。以甘油代替葡萄糖作为碳源则可减少代 谢剐产物——乙酸的积累，而且更易达到重组苗的高 密度和外源蛋白的表达［５］。 除碳源外．培养基中的氮源、微量元素和各种无 机盐含量对大肠杆菌发酵也有较大影响。一般而言， 大肠杆菌培养时营养的抑制浓度为：葡萄糖（５０ ｇ／ Ｌ）、氟（３ ｇ／Ｌ）、Ｆｅ２＋（１．１５ ｇ／Ｌ）、Ｍ９２＋（８．７ ｇ／Ｌ）、
●幸文■
１ Ｌｅｅ．Ｓ Ｙ
对于重组大肠杆菌，要达到重组产物的最大产 率，还要考虑合适的诱导时问和诱导强度。一般在对 敷生长中期进行升温诱导表达。在利用温度诱导型的 重组质粒生成ＢＭＰ一２Ａ时，细菌对数中期诱导比后 期诱导产率提高３２％“】。另外，在生产中，由于发酵 液中含大量蛋白质、多糖等物质。因此，搅拌时会产生 大量气泡。如果泡沫持续过久，除了会降低发酵罐的 有效容积外，还会防碍菌体呼吸，造成代谢异常而使 菌体早期自溶。对此。在生产中，要适当减轻搅拌尉烈 程度，同时少加或缓加一些易起泡原料；要用天然油 脂和合成消沫荆等消除已生成的泡沫。 ２发肆方式选择 补料分批发酵是近几年兴起的一项新技术，已被 广泛地应用于各种微生物的高密度发酵。它是指在微 生物分批发酵中以某种方式连续补加一定物料的培 养技术，主要包括非反馈补料和反馈补料两种类型。 前者包括恒速补料、变速朴料和指数补料三种方法｝ 后者包括恒ｐＨ值法、恒溶氧法、菌体浓度反馈法、 ｃＥＲ法和ＤＯ—ｓｔａｔ法。由于流加方式的不同，它们对 菌体生长及外潦蛋白表达的影响也不同。因指效流加 法比较简单，不需复杂设备，采用这一方法培养大肠 杆菌可将细胞比生长率控制在不产生副产物（如乙 酸）范围之内，所以颇受重视。该技术已广泛用于重组 大肠杆菌高密度培养生产外源蛋白。另外，它还可作 为独特动力学研究手段代替连续培养来考查培养过 程中的重要动力学参数特性。研究发现指数流加不仅 在提高菌体密度、生产强度和产物表达总量方面有显 著的优势，而且实际过程的比生产速率平均值与设定 值非常接近”］。 ３发酵终点爿断及异常发酵处理 ３．１发酵垮点判断 发酵终点的判断对提高菌体和外源蛋白的产量 及质量，以及缩短生产周期是很重要的。发酵初期，菌 体数量增加较快。但到了后期，大部分细菌已停止生 长，甚至死亡．此时，若继续发酵，则既浪费时间和财 力，又影响产物质量。溶氧规律性变化反映了大肠杆 菌生长的规律，因此将溶氧作为终止发酵的信号。在 发酵初期，由于茵体密度急剧增加．耗氧量较大，溶氧 曲线迅速下降。在对救生长期降到最低｝随后进入细
大肠杆菌高细胞密度发酵
课程设计说明书课程名称：发酵工程设计题目：大肠杆菌的高细胞密度发酵院系：生物与食品工程学院学生姓名：郑帅超学号：201106040030专业班级：11 生物技术指导教师：李安华2014年5月26日课程设计任务书设计题目枯草芽孢杆菌产淀粉酶发酵工艺的优化学生姓名郑帅超所在院系生物与食品工程学院专业、年级、班11生物技术设计要求：1、树立正确的设计指导思想，严谨负责、实事求是、刻苦钻研、勇于探索的作风和学风。
2、根据所给资料，按照任务书中提出的范围和要求按时独立完成，不得延误，不得抄袭他人成果。
3、说明书应字迹清楚文字通顺，并附有各项设计成果表，摘引其他书籍或杂志的材料必须注明出处。
4、设计标准要求规范、实用、切合实际。
5、设计应严格按有关设计规范进行。
6、设计结束后，以个人为单位提交设计说明书一份（后附流程图）。
学生应完成的工作：1、在老师的帮助下完成题目设计。
2、学生查阅相关文献、资料制定实验路线，并有指导老师检查实验路线的合理性和可行性。
3、学生在实验室完成实验方案。
4、完成课程设计说明书的初稿，由指导老师帮助修改，最后定稿。
参考文献阅读：[1]李寅等著，高细胞密度发酵技术，化学工业出版社，2006-10-01，177~288.[2]陈坚,李寅,毛英鹰,等. 生物工程学报,1998 ,14(4) :452～455.[3]李民,陈常庆,朴勤,等. 生物工程学报,1998 ,14(3) :270～275.[4]杨汝燕,李民,陈常庆. 工业微生物,1998 ,28(3) :30～33.[5 ]李民,陈常庆,朴勤等,生物工程学报,1998 ,14 (3) :270~275.[6]杨汝燕,李民,陈常庆,工业微生物,1999 ,29(1) :25～28.[7]徐皓,李民,阮长庚,等. 工业微生物,1998 ,28(2) :20～25.[8]刘社际,葛永红,杨立明. 中国生物制品学杂志,1999 ,12 (1) :29 ～31.工作计划：2013.5.11分组并确认指导老师，在老师指导下查阅文献，确定题目。
大肠杆菌高密度发酵中乙酸代谢
文献介绍
• 发酵仪器（附图介绍）
实验培养曲线对比
PH7.0、6.5培养曲线对比分析
A：PH：PH7.0时，PH相对稳定，6小时后有一个上升过程，直到7.5小时 恢复正常。 PH6.5时，PH变化较大，6小时后上升，接近6.5小时下降、稳定，大 概在8.5小时，再次上升，30分钟后下降，直到10小时才稳定。
非常相似（图5）.在发酵6 h 前不久，当乙酸浓度达到 7.2g/L时，葡
萄糖消耗急剧的减少（ 10 分钟减少40% ）与上面描述的0.5 g/L观察
到的内容相似。在发酵过程中控制葡萄糖浓度为2.0 g/L，当葡萄糖消
耗下降时，培养物并不消耗乙酸。在 40 分钟之后，培养基浓度恢复，
葡萄糖消耗的持续增加，乙酸产生的增加。在葡萄糖消耗量减少的整
个期间，PH和异柠檬酸盐裂解酶都没有增长，可以看得出没有乙酸
消耗的现象出现，在没有发生改变的情况下。
文献总结
• 内容总结 • 在大肠杆菌发酵培养过程中，有氧和糖的消耗
以及二氧化碳的排放量暂时下降50%-80%的现象 发生，并伴有排泄物被利用的现象发生。 • 相对于营养物确定的培养基，在营养物富集的 培养基中，大肠杆菌会缓慢生长，并且会产生乙 酸。乙酸在培养基中的存在多方面影响细胞的生 理特性，浓度升高的乙酸溶液限制培养物的生长 速率，其对复杂培养基的影响比确定培养基大多 了，在分批补料培养中，乙酸的产生明显高于批 发酵所产生的，这是因为在延伸生长阶段大肠杆 菌使得乙酸达到最高浓度。
文献介绍
• 试验内容 通过14L发酵罐进行大肠杆菌高密度培养，分别以PH
为7.5、7.0、6.5、6.0，葡萄糖浓度为0.5g/L进行培养。 PH6.0，葡萄糖浓度为2.0g/L进行培养。
重组大肠杆菌产耐热α-L-鼠李糖苷酶高密度发酵条件的优化
α-L-鼠李糖苷酶（α-L-rhamnosidase ，EC 3.2.1.40）广泛存在于自然界中，如哺乳动物组织、植物、真菌、细菌等[1-4]。
该酶是一种应用广泛的糖苷水解酶，它能高效水解多种末端含有非还原性鼠李糖残基的天然化合物，如水解芦丁为异槲皮苷[3]，水解淫羊藿苷C 为淫羊藿苷[5]，水解柚皮苷为普鲁宁等[4]。
此外，少数α-L-鼠李糖苷酶还能以L-鼠李糖为供体，通过逆水解反应催化合成鼠李糖苷，如甘露醇鼠李糖基化、酚类化合物鼠李糖基化等[6，7]。
迄今为止，根据CAZy 数据库，α-L-鼠李糖苷酶分属于三大糖苷水解酶家族，即GH13家族、GH78家族和GH106家族[8]，其中大部分属于GH78家族。
此外，α-L-鼠李糖苷酶是一种重要的酶，在食品和制药工业中有着广泛的应用。
然而，目前报道的α-L-鼠李糖苷酶普遍产量不高，到目前为止，全球还没有商品化的α-L-鼠李糖苷酶产品，这极大限制了该酶在工业上的应用。
大肠杆菌是遗传背景最清楚的菌株，其具有培养成本低、抗污染能力强、生长周期短、蛋白表达量高等优势，已经成为最常用的外源蛋白表达系统。
采用高密度发酵技术，能显著提高所培养的菌体密度，最终增加单位体积单位时间内目的产物的比生产率，缩减生产周期，提升经济效益，已经在工业中有很广泛的应用[9]。
在大肠杆菌高密度发酵中，大多采用补料分批发酵方式，以实现高密度的大肠杆菌和所需的蛋白质生产[10]。
这种补料方式一方面可以避免因某些营养成分初始浓度过高而出现底物抑制现象，另一方面又能够防止因限制性营养成分被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成。
重组大肠杆菌高密度发酵是一个复杂的过程，需要对其生长的发酵参数进行优化，如葡萄糖进料速率、诱导温度、诱导pH 等。
葡萄糖是一种便宜且速效碳源，在大肠杆菌发酵生产中优于其他碳源。
但是，在有氧条件下，过多的葡萄糖会导致大肠杆菌代谢副产物的产生。
最常见的副产物是乙酸，它是由磷酸转乙酰酶（PTA ）/乙酸激酶（ACKA ）和丙酮酸氧化酶（POXB ）两种途径产生的[11]，主要原因是加入中央代谢系统的碳与细胞呼吸或三羧酸循环的有限能力之间不平衡[12]。
大肠杆菌高密度发酵中乙酸代谢
个期间，PH和异柠檬酸盐裂解酶都没有增长，可以看得出没有乙酸
消耗的现象出现，在没有发生改变的情况下。
文献总结
• 内容总结 • 在大肠杆菌发酵培养过程中，有氧和糖的消耗
以及二氧化碳的排放量暂时下降50%-80%的现象 发生，并伴有排泄物被利用的现象发生。 • 相对于营养物确定的培养基，在营养物富集的 培养基中，大肠杆菌会缓慢生长，并且会产生乙 酸。乙酸在培养基中的存在多方面影响细胞的生 理特性，浓度升高的乙酸溶液限制培养物的生长 速率，其对复杂培养基的影响比确定培养基大多 了，在分批补料培养中，乙酸的产生明显高于批 发酵所产生的，这是因为在延伸生长阶段大肠杆 菌使得乙酸达到最高浓度。
文献介绍
• 发酵过程概述
•
在葡萄糖体和乙酸都消耗的时期，大约在6.5小时，异柠檬酸盐裂
解酶的特殊活性大约增加了4倍，可以观察到最初的乙醛酸旁路途径。
转换之后，这种酶活性的增加与乙酸的消耗直接相关。
• PH6.5、糖功率2.0 g/L发酵简述
•
最初 5 h发酵，初期的生长率是0.985 h-1,与0.5 g/L葡萄糖发酵的
E：两者的大概生长曲线基本相似
PH6.5，糖浓度2.0g/L的培养曲线
三条培养曲线的对比分析
• 发酵过程中控制PH在 6.5，葡萄糖 的浓度被控制在 2.0 g/L时。最初 5 h发酵，初期的生长率是0.985 h-1,与0.5 g/L葡萄糖发酵的非常相似（图5）.在发酵6 h 前不久，当 乙酸浓度达到 7.2g/L时，葡萄糖消耗急剧的减少（ 10 分 钟减少40% ）与上面描述的0.5 g/L观察到的内容相似。 在发酵过程中控制葡萄糖浓度为2.0 g/L，当葡萄糖消耗下 降时，培养物并不消耗乙酸。在 40 分钟之后，培养基浓 度恢复，葡萄糖消耗的持续增加，乙酸产生的增加。在葡 萄糖消耗量减少的整个期间，PH和异柠檬酸盐裂解酶都 没有增长，可以看得出没有乙酸消耗的现象出现 。此时， 乙酸没有消耗与PH7.0、PH6.5，补糖量0.5 g/L不同。
发酵工艺：工程菌高密度发酵工艺开发策略8项(以大肠杆菌为例)
发酵工艺：工程菌高密度发酵工艺开发策略8项（以大肠杆菌为例）利用重组DNA技术获取的生物药物在人类文明史上具有划时代的意义。
许多价值高产量低的功能蛋白如干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、生长激素、胰岛素、人血白蛋白、蛋白酶等都在工程菌中获得了高效率表达。
由于工程菌高密度培养能够提高单位体积的产量，在工业生产上可以提高效率降低成本。
所以，高密度培养一直都是发酵工程师们所追捧的热点。
本文就工程大肠杆菌高密度发酵工艺开发中涉及的关键控制点加以探讨。
1工程菌种稳定可靠的菌种是工业化大生产的有力保障，直接关系到生产效率和成本高低。
不同于传统诱变育种模式，在对待工程菌菌种问题上，有人认为基因工程菌种构建完成后无需经过严格单克隆筛选，既节约时间成本又大大减少了工作量，这其实是一个认识误区。
这样做出来的菌种很难连续稳定传代50次以上，给中试放大以及后续的长期稳定生产留下了隐患。
业内一般以能否稳定遗传50代作为判断工程菌种优劣的一个标准。
发酵所需的接种量不是越大越好，要适当。
接种量过小导致适应期过长，菌种易提前老化，也增加了杂菌污染的风险。
接种量过大会过早引起溶氧不足，导致发酵失控。
且营养物质消耗过快也会影响后期正常生长。
一般大肠杆菌接种量遵循逐级增大的原则，并将最后一级的放大倍数控制在10倍左右。
种子培养一定要在最佳条件下进行，培养时间不宜过长，当种子生长至最佳状态时果断移种。
如果种子做的不好，其负面影响往往在发酵中后期会有所体现。
工程菌种培养会加入抗生素，不仅是为了抑制杂菌生长，更重要的是为了给菌种形成正向的抗性筛选压力，及时淘汰质粒丢失的菌株或者衰老的菌体，保证质粒携带菌群的正常生长与表达。
2高密度发酵培养基除了必须的碳源以外，有机复合氮源在蛋白表达阶段不可或缺。
有机复合氮源可提供丰富的氨基酸、小肽、嘌呤、嘧啶、维生素、生物素以及一些生物活性物质，能减轻细胞代谢负担，促进外源蛋白表达。
如果酵母膏和蛋白胨是以流加的方式添加时，存在一种非常有趣的代谢机制：当流加培养基中只有酵母膏时，重组蛋白不稳定；而当流加培养基中只有蛋白胨时，大肠杆菌难以再利用其所产生的乙酸。
大肠杆菌高密度培养
大肠杆菌发酵罐高密度培养1.菌种活化冻干管活化：甘油保存管及生产斜面制作另述甘油管活化：取冷冻甘油管一支室温下融化，划线于平板（根据一月的生产计划），挑取数个或数十个单菌落划密之字线于生产斜面，37℃22-24h培养，将斜面包扎好置于4℃冰箱保藏。
2.摇瓶培养取两支斜面，加无菌水或生理盐水4ml，用接种环刮洗制成菌悬液备用。
每支菌悬液接两个三角瓶，4x200ml/1000ml 37℃ 200r/min 16-18h 3.种子罐培养25l/50l种子罐，500ml/500ml补料瓶(500ml/1000ml三角瓶)补料培养基：葡萄糖500g/l 蛋白胨80g/l 酵母膏50g/l MgSO48g/l PH7.5-7.8（灭菌前）灭菌温度 115℃ 30min3.1通气量：1-4h 1:0.5-0.6 4-6h 1:0.8-0.9 7-10h 1:1.03.2转速：1-3h 120-150r/min 4-10h 180-200r/min 罐压保持0.05mpa 3.3PH：20％NaOH溶液（酸碱瓶灭菌，溶液不灭）补加量一般350-500ml3.4消泡剂：添加量：泡敌（GPE聚醚型—聚氧乙烯氧丙烯甘油）0.01-0.02％豆油 0.10-0.15％宁少勿多。
3.5补料：补料时间及补料量：4-6h 55ml/h 165ml 7-10h 80ml/h 320ml 总计约485ml3.6移种与取样：一般对数期后期移种，平板培养结合镜检4.发酵罐培养300l/500l种子罐 10l/20l补料罐补料培养基同种子罐4.1通气量：1-4h 1:0.5-0.6 4-6h 1:0.8-0.9 7-12h 1:1.0 4.2转速：1-3h 120-150r/min 4-12h 180-200r/min 罐压保持0.05mpa 4.3 PH：20％NaOH溶液（酸碱瓶灭菌，溶液不灭）补加量一般 4-6L （90ml/150ml发酵罐培养8h补加160g/l的NaOH溶液4.0L）.4.4消泡剂：添加量：泡敌0.01-0.02％豆油 0.10-0.15％宁少勿多。
大肠杆菌高密度发酵提高表达量的策略
大肠杆菌高密度发酵提高表达量的策略概述重组大肠杆菌的高密度培养的目的在于获得更高的目标蛋白单位体积产量。
但是在重组大肠杆菌的高密度培养过程中，常常遇见的是高密度低表达现象，表达效率只有摇瓶的三分之一。
实现外源蛋白在菌体高密度培养过程中高效率表达仍是工程重组菌发酵的研究热点。
添加复合氮源菌体生长至高密度时，营养成分逐步耗尽。
营养的缺乏也是限制高密度培养下实现高表达的因素。
Shimizu等发现在表达阶段，限制蛋白胨和酵母抽提物的浓度，对外源基因表达不利，补料液中加大酵母抽提物比例可以提高外源蛋白的表达量。
认为有机氮源提供丰富的氨基酸、小肽、嘌呤、嘧啶、维生素、生物素以及一些生物活性物质，减轻了细胞代谢负担，促进了外源蛋白的表达。
利用代谢工程作用消除乙酸的抑制作用乙酸对菌体生长和外源蛋白表达抑制的机理通常认为是乙酸破坏了跨膜质子梯度，而跨膜质子梯度是氧化磷酸化和其它需能跨膜运输所必需。
pH为中性时乙酸以HAc 和Ac－形式共存，HAc渗透过细胞膜，在细胞内（pH约为7.5）再分解为H＋和Ac－。
由于不断渗透使胞外HAc和Ac－之间平衡向HAc移动，结果引起一个净电中性H＋内流，降低了胞内pH 。
由于具有缓冲功能的培养基体积大，乙酸渗透不会导致胞外pH发生剧烈变化，因此胞内pH降低将产生去偶联影响。
细胞自身的稳态机制需要能量以改变胞内pH降低趋势，即使质子推动力不发生变化情况下也是如此。
因此为了快速生长，E.coli不仅需要一个大的质子电动势，而且需要维持最佳胞内pH。
乙酸大量积累将加剧代谢去偶联的发生。
也有报道认为乙酸等短链脂肪酸对DNA、RNA、蛋白质、脂质和肽聚糖等的合成均有抑制，而这些大分子物质是菌体生长和外源蛋白表达所必需的。
目前，一些控制乙酸生成的方法正在被人们所研究，比如培养基优化法，有人以甘油代替葡萄糖作为碳源，实现了高密度培养；葡萄糖流加控制也是一种常用的控制乙酸的方法。
为了减少或避免乙酸积累，已经发展了各种葡萄糖流加策略，流加方式主要有恒速流加、线性流加、指数流加等。
大肠杆菌高密度发酵
课程设计说明书课程名称：发酵工程设计题目：大肠杆菌的高密度发酵院系：生物与食品工程学院学生姓名：******学号：************专业班级：10生物工程（2）班指导教师：*****课程设计任务书大肠杆菌的高密度摘要：在工业生产过程中，由于技术或是生产条件的限制，在大肠杆菌高密度发酵培养中很难实现其高密度发酵。
针对这一问题，我组专门为此设计一实验来探索发酵过程中的限制性因素。
我们从开始的发酵培养基的组分及其配比，到后来的灭菌方式，投料程序以及在发酵过程中温度的设定控制，PH值的设定控制及溶氧的设定控制都进行了严格的监测，再到最后的OD值，氨基氮以及还原糖的测定都进行严谨的完成。
关键词：大肠杆菌高密度发酵OD值目录1.设计背景 (1)1.1大肠杆菌高密度发酵产品及其质量安全现状 (1)1.2高密度发酵定义 (1)1.3 规定标准 (1)2.设计方案 (2)3.方案实施 (3)3.1 大肠杆菌简介 (3)3.2 菌种选材 (3)3.3 种子扩大培养 (3)3.4 发酵培养基配比 (3)3.5 发酵过程 (4)4.结果与结论 (7)5.收获与致谢 (9)6.参考文献 (10)1.设计背景1.1大肠杆菌高密度发酵产品及其质量安全现状目前，在发酵产业进入工业化，自动化的今天，产品的高密度发酵越来越受到国内外的重视。
人们在根据实验与生产阶段总结的经验中，逐步掌握发酵生产所需要的最佳控制条件。
在此过程中所得的产品密度更大，纯度更高，质量安全也得到了保障。
1.2高密度发酵定义高密度发酵（high cell density cultivation，HCDC)是指在一定条件和培养体系下，获得最多的细胞量，由此更多地或更高效地获得目的产物。
即利用一定的培养技术和装置提高菌体的发酵密度，使菌体密度较普通培养有显著提高，最终提高产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量)。
通常认为菌体密度超过50 g(DCW)／L即为高密度发酵。
大肠杆菌高密度经验总结
大肠杆菌发酵经验总结首先，补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响），所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果。
其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制pH值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。
第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之内，选在此时诱导，1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达；2.已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。
第四，补料过程中的碳氮比也很重要。
若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。
另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。
根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。
可以适当调整碳氮比。
大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响，针对我们论坛所发的帖，我先总结以下几点，并作出相应解决措施。
一、代谢副产物-乙酸乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一，一般认为在好气性条件下，5～10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。
当乙酸浓度大于10或20g/L 时，细胞将会停止生长，当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。
重组大肠杆菌 高密度发酵工艺流程
重组大肠杆菌是一种重要的微生物工程技术，它在生物医药领域具有广泛的应用前景。
高密度发酵是重组大肠杆菌工程中的关键技术之一，它能够提高生产效率，降低成本，是生物制药工业发展的重要推动力。
本文将围绕重组大肠杆菌高密度发酵工艺流程展开讨论，旨在全面梳理该流程的节点、原理和优化策略，为相关领域的研究人员和工程师提供参考和借鉴。
一、高密度发酵工艺流程概述高密度发酵是指通过对发酵过程中的微生物、培养基、营养物质、发酵条件等方面进行优化，使得发酵反应体系中微生物细胞数量达到较高水平的一种发酵技术。
重组大肠杆菌是一种常见的表达宿主，其高密度发酵工艺流程主要包括菌种预处理、大规模发酵、收获和纯化等环节。
1. 菌种预处理菌种的筛选和预处理对于高密度发酵的成功至关重要。
首先要选择生长迅速、表达目的蛋白质能力强的重组大肠杆菌菌株，确保其具有较高的生产潜力。
随后进行菌种的预培养和激发，通过连续传代、逐渐提高菌种浓度等手段，使菌种达到理想的生长状态，为大规模发酵做好准备。
2. 大规模发酵大规模发酵是高密度发酵的核心环节，其主要包括发酵罐设计、发酵培养基配方、发酵条件控制等内容。
在发酵罐设计方面，需要考虑罐体结构、通气方式、搅拌方式等因素，以保证发酵过程中的氧气和营养物质充分混合，为微生物生长提供良好的环境。
培养基的配方需要根据菌株特性进行调整，保证细胞生长所需的碳源、氮源、无机盐等养分充足。
发酵过程中温度、pH、溶氧量、搅拌速率等参数的控制也至关重要，可通过在线监测和智能控制系统进行实时调节，以确保发酵反应的顺利进行。
3. 收获和纯化发酵结束后，需对发酵液进行收获和纯化，以获取所需的重组蛋白质产品。
收获过程包括发酵液的分离、离心、过滤等操作，目的是将微生物细胞和培养基分离，获取含有目的产物的上清液。
随后进行一系列的纯化步骤，如固定化金属亲和层析、离子交换层析、尺寸排阻层析等，最终得到纯度较高的重组蛋白质产品。
二、高密度发酵工艺流程优化策略为了提高重组大肠杆菌的生产效率和产品质量，研究人员和工程师们一直在不断探索和优化高密度发酵工艺流程。
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课程设计说明书课程名称：发酵工程设计题目：大肠杆菌的高密度发酵院系：生物与食品工程学院学生姓名：******学号：************专业班级：10生物工程（2）班指导教师：*****课程设计任务书大肠杆菌的高密度摘要：在工业生产过程中，由于技术或是生产条件的限制，在大肠杆菌高密度发酵培养中很难实现其高密度发酵。
针对这一问题，我组专门为此设计一实验来探索发酵过程中的限制性因素。
我们从开始的发酵培养基的组分及其配比，到后来的灭菌方式，投料程序以及在发酵过程中温度的设定控制，PH值的设定控制及溶氧的设定控制都进行了严格的监测，再到最后的OD值，氨基氮以及还原糖的测定都进行严谨的完成。
关键词：大肠杆菌高密度发酵OD值目录1.设计背景 (1)1.1大肠杆菌高密度发酵产品及其质量安全现状 (1)1.2高密度发酵定义 (1)1.3 规定标准 (1)2.设计方案 (2)3.方案实施 (3)3.1 大肠杆菌简介 (3)3.2 菌种选材 (3)3.3 种子扩大培养 (3)3.4 发酵培养基配比 (3)3.5 发酵过程 (4)4.结果与结论 (7)5.收获与致谢 (9)6.参考文献 (10)1.设计背景1.1大肠杆菌高密度发酵产品及其质量安全现状目前，在发酵产业进入工业化，自动化的今天，产品的高密度发酵越来越受到国内外的重视。
人们在根据实验与生产阶段总结的经验中，逐步掌握发酵生产所需要的最佳控制条件。
在此过程中所得的产品密度更大，纯度更高，质量安全也得到了保障。
1.2高密度发酵定义高密度发酵（high cell density cultivation，HCDC)是指在一定条件和培养体系下，获得最多的细胞量，由此更多地或更高效地获得目的产物。
即利用一定的培养技术和装置提高菌体的发酵密度，使菌体密度较普通培养有显著提高，最终提高产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量)。
通常认为菌体密度超过50 g(DCW)／L即为高密度发酵。
根据硒计算，理论上大肠杆菌发酵所能达到的最高菌体密度为400 g(DCW／L)，考虑到实际情况中的种种条件限制，Makel等认为最高的菌体密度为200 g(DCW／L)，此时发酵液的25％充满了长3 um，宽1um的大肠杆菌，发酵液粘度很高，几乎丧失流动性。
1.3 规定标准我国质量标准规定，根据大肠杆菌的高密度发酵，发酵罐中生物量达到150—200g/l。
根据这一标准，制定出整个试验生产计划。
微生物的发酵方式主要有分批、连续和补料分批3种。
在本次大肠杆菌发酵中，我们采用补料分批培养。
分批补料发酵定义：补料分批发酵以分批发酵为基础，是介于分批发酵与连续发酵之间的一种发酵技术。
在分批发酵培养开始，投入较低的浓度底物，当微生物开始消耗底物后，间歇或连续地补加新鲜培养基，而不从发酵罐中放出培养液的一种发酵方式。
这是在现代发酵工艺得到优化的一种方式，能有效的优化微生物培养过程中的化学环境。
使微生物处于最佳的生长环境。
这种方式一方面可以避免某些营养成分初始浓度过高出现底物抑制现象，另一方面能够防止限制性营养成分被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成。
补料分批培养已广泛应用于各种各样的初级、次级生物产品和蛋白等的发酵生产中。
在此过程中，我们使用50L发酵罐采用分批补料方式对大肠杆菌进行培养。
实时监测培养过程中的溶氧，PH以及温度等发酵参数，每隔两小时取料测定料液OD值，氨基氮，还原糖等数据。
直至大肠杆菌停止生长。
3.1 大肠杆菌简介在自然界分布很广，是人和动物肠道中的正常菌群。
正常情况下一般不致病，但它是条件致病菌。
大肠杆菌是单细胞原核生物，具有原核生物的主要特征：细胞核为拟核，无核膜，细胞质中缺乏象高等动植物细胞中的线粒体、叶绿体等具膜结构的细胞器，核糖体为70S，以二分分裂繁殖。
其大小为：0.5～0.8μm×1.0～3.0μm。
周身鞭毛，能运动，具致育因子的菌株还具性菌毛。
其代谢类型是异养兼性厌氧型。
3.2 菌种选材实验室保存大肠杆菌菌种3.3 种子扩大培养培养基：LB培养基（g/L）：酵母粉5，胰蛋白胨10，NaCl10，PH7.0液体试管培养：自斜面菌种挑取一环酵母菌体，接入装有10ml 的无菌种子培养基的液体试管中，摇匀，置于37℃培养箱24h。
三角瓶扩大培养：将上述培养好的液体试管种子接种入250ml含有灭过菌的100ml 培养基的三角瓶中，37℃培养箱中18h。
摇瓶培养：按照1%接种量接入装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，37℃ 200r/min振荡培养3.4 发酵培养基配比培养基（g/L）：葡萄糖10，酵母膏11.5，蛋白胨19.5，(NH4)2SO4 4、K2HPO4 18、MgS04 1.2（单独灭菌），微量元素液1mL。
流加培养基I(g/L)：葡萄糖600,7水硫酸镁10。
ph调节剂：0.5mol/L氨水3.5 发酵过程将已调配好的新鲜培养基注入发酵罐中，设定温度121℃，时间25 min，对发酵罐，培养基，葡葡糖溶液氨液和消泡剂进行同时灭菌操作。
如果传感器不能用蒸汽加压灭菌，可以在室温下把传感锡在75％酒精中浸泡加进行灭菌，然后用无菌水洗净，尽快安装在培养罐上。
开通冷却水进行冷却，同时开动搅拌器，通入无菌压缩空气以防产生负压,直到冷却到发酵温度37 ℃。
利用硅皮管将25 g/100ml葡萄糖液贮瓶和0.1 mol/L氨液贮瓶分别连接蠕动泵和培养罐上的入口，再将两个贮瓶上的排气口塞上棉花用弹簧夹夹住。
消泡剂贮瓶排气口塞上锦花。
在发酵过程中，通气量控制在4L/min，搅拌转数为400rpm。
向发酵罐中接种之前已经扩大培养的菌种。
开动蠕动泵流加25g/100mL葡萄糖流加混合液，使发酵罐内葡萄糖浓度达到25g/L，滴加0.1 mol/L氨液，控制培养液pH为7.0，充入适量的消泡剂。
通过调节风量和搅拌转数控制溶氧浓度在30％左右。
每隔2h取样测定培养液中葡萄糖浓度、菌体量和副产物乙醇浓度，并做记录。
取样口经常用75％的酒精浸泡以保持清洁。
当菌种停止繁殖时，菌种浓度不再增加，葡萄糖浓度不再改变时，停止发酵反应。
取发酵液样品，测定酵母菌浓度，还原糖，氨基氮，DO含量参数。
培养结束后，将培养液进行蒸汽加压灭菌弃去。
清洗培养罐。
3.6 实验数据的测定3.6．1斐林法测还原糖试剂：①斐林试剂② 0.1%标准葡萄糖溶液测定步骤：①斐林试剂的标定：吸取斐林试剂甲、乙液各5Ml。
置于250mL三角瓶中，加入10mL水，并从滴定管中预先加入约24mL0.1%标准葡萄糖溶液（其量控制在后滴定时消耗0.1%标准葡萄糖溶液1mL以内），摇匀，于电炉上加热至沸，立即以4～5秒每滴的速度继续用0.1%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作需在1min中内完成，总消耗量为V 0 mL。
②定糖：预备试验：吸取斐林试剂甲、乙液各 5mL，置于250mL三角瓶中，加入V 1 毫升试样稀释液（含葡萄糖量为 5 ～ 15 毫升）及适量多0 .1% 标准葡萄糖溶液，摇匀，以下同标定时操作。
总耗糖量为 V 2 毫升。
正式实验：吸取斐林试剂甲、乙液各 5 毫升，置于 250mL 三角瓶中，加入 V 1 毫升试样稀释液和（ V 2 － 1）毫升 0.1% 标准葡萄糖溶液，补加 [（V 0 +10 ）－（ V 1 +V 2 ）] 毫升水，摇匀，以下操作同标定时操作，总耗糖量为 V 毫升。
3.6.1.3计算葡萄糖 =（ V 0 -V ）×C×n×1/V 1（ g/mL ）。
3.6.2氨基氮的测定基本原理氨基酸是有氨基与羧基得两性化合物，在溶液中以两性离子状态存在。
如：R-CH--COO-+2HCHO-NH3是弱酸，完全解离时pH在11-12之间或者更高，若用碱滴定- NH3释放出来的H+来测定氨基酸，一般指示剂的变色范围＜10，很难指示滴定终点。
但是用甲醛处理后，由于甲醛能与氨基结合使氨基上的氢离子游离，使溶液中的酸度增加，滴定中和终点移至酚酞的变色区域内（8.0-10.0）。
因此可用酚酞作指示剂，用碱来滴定，从而计算氨基酸的含量。
试剂：1mol/l盐酸，0.1mol/l氢氧化钠标准溶液，0.5mol/l氢氧化钠标准溶液，12%中性甲醛，0.2%甲基红指示剂，1%酚酞指示剂。
仪器及器具：100ml三角瓶，10ml刻度吸管，25ml刻度吸管，碱式滴定管取发酵离心上清液2.5ml至100ml三角瓶中，加水50ml，甲基红指示剂2滴，1mol/l盐酸1-2滴，调节溶液至红色，静置5分钟，再用0.5mol/l的氢氧化钠标准溶液调节溶液至橙色（体积不计），使呈中性。
加12%中性甲醛10ml(每次用之前用氢氧化钠溶液调至微红色，酚酞作为指示剂)，摇匀静置10min,加1%酚酞指示剂5滴，用0.1mol/l氢氧化钠溶液滴定至微红色为终点。
计算：氨基氮（mg/100ml）=C×V×14.01×100/2.5C:氢氧化钠滴定液浓度，mol/lV：氢氧化钠滴定液消耗体积，ml3.6.3 OD法测菌体密度原理：OD表示被检测物吸收掉的光密度。
光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。
实验步骤首先对配好的培养基进行检测光密度，以此作为对照。
其次，用三支试管取10的样品液，分别用磷酸盐缓冲液稀释稀释不同的倍数，用wfj7200可见分光光度计在波长600nm下测定不同稀释不同稀释倍数的菌悬液以及对照样品的OD值。
计算:OD=㏒10(入射光/透射光）4.结果与结论表4.1大肠杆菌发酵液的OD值，氨基氮，还原糖数据从整个实验过程中测得的实验数据可以观察到：氨基氮和还原糖的含量从开始略有上升到后来维持稳定。
主要原因是大肠杆菌在繁殖中需要碳源转化为葡萄糖为其提供能量，将氮源转化为氨基酸为其提供合成自身产物的原料，随着菌体密度的不断增大，两者的含量也不断升高，知道菌体密度维持稳定后两者的含量才稳定下来。
在测量OD数据时，第二次测得的数据具有失真现象，应当不予考虑，从实验数据的整体来看整个OD 值的走势还是符合大肠杆菌生长曲线的。
大肠杆菌起初被接种在发酵罐内，由于对发酵罐内的生活环境还不适应，菌体的繁殖速率降低，代谢物产量几乎处于停滞阶段，此时期被定为适应期；接着菌体对整个生存环境有了适应，其数目呈现几何级数增长，代谢产物也在不断积累，此时期为对数期；处于稳定期的菌体其繁殖的菌体数与衰亡的细胞数达到动态平衡，菌体产量达到最高点，其次生代谢产物也在此时期进行积累；最终军中衰老，活的菌种数量逐渐下降。
5. 收获与致谢首先，本次课程设计是在****老师精心指导下完成的。
并且老师为我们组修改并制定了最佳课程设计的方案，每次我们有疑惑或者不是很懂的地方就会立即为我们讲解，让我们学到了很多的东西，并且也让我深深体会到只有动手去操作才能检验我们学到的东西。