大肠杆菌高密度发酵

课程设计说明书

课程名称：发酵工程

设计题目：大肠杆菌的高密度发酵

院系：生物与食品工程学院

学生姓名：******

学号：************

专业班级：10生物工程（2）班

指导教师：*****

课程设计任务书

大肠杆菌的高密度

摘要：在工业生产过程中，由于技术或是生产条件的限制，在大肠杆菌高密度发酵培养中很难实现其高密度发酵。针对这一问题，我组专门为此设计一实验来探索发酵过程中的限制性因素。我们从开始的发酵培养基的组分及其配比，到后来的灭菌方式，投料程序以及在发酵过程中温度的设定控制，PH值的设定控制及溶氧的设定控制都进行了严格的监测，再到最后的OD值，氨基氮以及还原糖的测定都进行严谨的完成。

关键词：大肠杆菌高密度发酵OD值

目录

1.设计背景 (1)

1.1大肠杆菌高密度发酵产品及其质量安全现状 (1)

1.2高密度发酵定义 (1)

1.3 规定标准 (1)

2.设计方案 (2)

3.方案实施 (3)

3.1 大肠杆菌简介 (3)

3.2 菌种选材 (3)

3.3 种子扩大培养 (3)

3.4 发酵培养基配比 (3)

3.5 发酵过程 (4)

4.结果与结论 (7)

5.收获与致谢 (9)

6.参考文献 (10)

1.设计背景

1.1大肠杆菌高密度发酵产品及其质量安全现状

目前，在发酵产业进入工业化，自动化的今天，产品的高密度发酵越来越受到国内外的重视。人们在根据实验与生产阶段总结的经验中，逐步掌握发酵生产所需要的最佳控制条件。在此过程中所得的产品密度更大，纯度更高，质量安全也得到了保障。

1.2高密度发酵定义

高密度发酵（high cell density cultivation，HCDC)是指在一定条件和培养体系下，获得最多的细胞量，由此更多地或更高效地获得目的产物。即利用一定的培养技术和装置提高菌体的发酵密度，使菌体密度较普通培养有显著提高，最终提高产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量)。通常认为菌体密度超过50 g(DCW)／L即为高密度发酵。根据硒计算，理论上大肠杆菌发酵所能达到的最高菌体密度为400 g(DCW／L)，考虑到实际情况中的种种条件限制，Makel等认为最高的菌体密度为200 g(DCW／L)，此时发酵液的25％充满了长3 um，宽1um的大肠杆菌，发酵液粘度很高，几乎丧失流动性。

1.3 规定标准

我国质量标准规定，根据大肠杆菌的高密度发酵，发酵罐中生物量达到150—200g/l。根据这一标准，制定出整个试验生产计划。

微生物的发酵方式主要有分批、连续和补料分批3种。在本次大肠杆菌发酵中，我们采用补料分批培养。

分批补料发酵定义：补料分批发酵以分批发酵为基础，是介于分批发酵与连续发酵之间的一种发酵技术。在分批发酵培养开始，投入较低的浓度底物，当微生物开始消耗底物后，间歇或连续地补加新鲜培养基，而不从发酵罐中放出培养液的一种发酵方式。

这是在现代发酵工艺得到优化的一种方式，能有效的优化微生物培养过程中的化学环境。使微生物处于最佳的生长环境。这种方式一方面可以避免某些营养成分初始浓度过高出现底物抑制现象，另一方面能够防止限制性营养成分被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成。补料分批培养已广泛应用于各种各样的初级、次级生物产品和蛋白等的发酵生产中。

在此过程中，我们使用50L发酵罐采用分批补料方式对大肠杆菌进行培养。实时监测培养过程中的溶氧，PH以及温度等发酵参数，每隔两小时取料测定料液OD值，氨基氮，还原糖等数据。直至大肠杆菌停止生长。

3.1 大肠杆菌简介

在自然界分布很广，是人和动物肠道中的正常菌群。正常情况下一般不致病，但它是条件致病菌。大肠杆菌是单细胞原核生物，具有原核生物的主要特征：细胞核为拟核，无核膜，细胞质中缺乏象高等动植物细胞中的线粒体、叶绿体等具膜结构的细胞器，核糖体为70S，以二分分裂繁殖。其大小为：0.5～0.8μm×1.0～3.0μm。周身鞭毛，能运动，具致育因子的菌株还具性菌毛。其代谢类型是异养兼性厌氧型。

3.2 菌种选材

实验室保存大肠杆菌菌种

3.3 种子扩大培养

培养基：LB培养基（g/L）：酵母粉5，胰蛋白胨10，NaCl10，PH7.0

液体试管培养：自斜面菌种挑取一环酵母菌体，接入装有10ml 的无菌种子培养基的液体试管中，摇匀，置于37℃培养箱24h。

三角瓶扩大培养：将上述培养好的液体试管种子接种入250ml含有灭过菌的100ml 培养基的三角瓶中，37℃培养箱中18h。

摇瓶培养：按照1%接种量接入装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，37℃ 200r/min振荡培养

3.4 发酵培养基配比

培养基（g/L）：葡萄糖10，酵母膏11.5，蛋白胨19.5，(NH4)2SO4 4、K2HPO4 18、MgS04 1.2（单独灭菌），微量元素液1mL。。

流加培养基I(g/L)：葡萄糖600,7水硫酸镁10。

ph调节剂：0.5mol/L氨水

3.5 发酵过程

将已调配好的新鲜培养基注入发酵罐中，设定温度121℃，时间25 min，对发酵罐，培养基，葡葡糖溶液氨液和消泡剂进行同时灭菌操作。

如果传感器不能用蒸汽加压灭菌，可以在室温下把传感锡在75％酒精中浸泡加进行灭菌，然后用无菌水洗净，尽快安装在培养罐上。

开通冷却水进行冷却，同时开动搅拌器，通入无菌压缩空气以防产生负压,直到冷却到发酵温度37 ℃。

利用硅皮管将25 g/100ml葡萄糖液贮瓶和0.1 mol/L氨液贮瓶分别连接蠕动泵和培养罐上的入口，再将两个贮瓶上的排气口塞上棉花用弹簧夹夹住。消泡剂贮瓶排气口塞上锦花。

在发酵过程中，通气量控制在4L/min，搅拌转数为400rpm。向发酵罐中接种之前已经扩大培养的菌种。

开动蠕动泵流加25g/100mL葡萄糖流加混合液，使发酵罐内葡萄糖浓度达到25g/L，滴加0.1 mol/L氨液，控制培养液pH为7.0，充入适量的消泡剂。通过调节风量和搅拌转数控制溶氧浓度在30％左右。

每隔2h取样测定培养液中葡萄糖浓度、菌体量和副产物乙醇浓度，并做记录。

取样口经常用75％的酒精浸泡以保持清洁。

当菌种停止繁殖时，菌种浓度不再增加，葡萄糖浓度不再改变时，停止发酵反应。

取发酵液样品，测定酵母菌浓度，还原糖，氨基氮，DO含量参数。培养结束后，将培养液进行蒸汽加压灭菌弃去。清洗培养罐。

3.6 实验数据的测定

3.6．1斐林法测还原糖

试剂：①斐林试剂② 0.1%标准葡萄糖溶液

测定步骤：

①斐林试剂的标定：吸取斐林试剂甲、乙液各5Ml。置于250mL三角瓶中，加

入10mL水，并从滴定管中预先加入约24mL0.1%标准葡萄糖溶液（其量控制在后滴定时消耗0.1%标准葡萄糖溶液1mL以内），摇匀，于电炉上加热至沸，立即以4～5秒每滴的速度继续用0.1%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作需在1min