(完整版)大肠杆菌培养基配制及培养方法

大肠杆菌培养
一、菌种冻存液的制备
含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40%甘油，-80o C冻存。

二、培养基制备
LB培养基配方（胰化蛋白胨（Trypton）：10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5 g/L；NaCl：10 g/L；pH 7.4）
液体培养基
胰化蛋白胨 10.0g
酵母粉 5.0g
氯化钠 10.0g
水 1000ml
pH 7.4
固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5％－2.0％的琼脂
三、平板的制备
1）称取胰化蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，加入800mL二次水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，用1mol/L的NaOH调pH至7.4左右，定容至1L，调pH 7.4（若溶液pH大于7.4，用1mol/L HCl回调）。

2）分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。

如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%的琼脂（150mL液体培养基加入2.5g琼脂）。

3）在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。

所有锥形瓶如上述操作。

用记号笔注明培养基名称、配制日期。

4）高压蒸汽灭菌锅121 oC灭菌15min。

5）灭菌后的培养基取出置电热鼓风干燥器内60oC烘干，待锥形瓶的封口纸干燥后取出。

液体培养基可直接保存或使用，此时加有琼脂的培养基不会凝固，可在预先紫外杀菌30min以上的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿内，每个培养皿培养基约10-15mL（直径90mm），在培养皿中厚度大约4mm左右。

将平皿叠放在无菌操作台上，放置10min左右，待琼脂基本凝固可涂平板。

6）若平板不直接使用，灭菌后将培养基在锥形瓶中保存，待需制备平板时，微波炉中火加热约3min，使琼脂熔化，室温冷却20min至不烫手可制备平板。

四、接种大肠杆菌
1）取实验室储备的大肠杆菌BL21冻存液，管口用酒精灯灼烧，打开离心管。

2）接种方法一：用灭菌枪头蘸取冻存液在平板边缘上划横条，每三道为一组，旋转平皿一圈，最后中间划之字；接种方法二：用移液枪吸取100uL溶液于平板上，用酒精灯灭菌厚的涂抹棒划十字，涂布平板。

3）因实验一般都要求挑取单菌落，故涂平板适应考虑冻存液内细菌数量，若菌量过大应适当稀释。

一般方法一获得单菌落的可能性比较大。

涂平板应在酒
精灯附近进行，若冻存液涂完的平板应倒置，防止平皿盖上产生水蒸气。

五、大肠杆菌的培养
1）将接种好的平皿倒置放入37℃的恒温培养箱中培养，大约十几小时后长出菌落。

2）挑取生长状态好，特征明显的单个菌落，接种于新鲜灭菌的LB液体培养基中37℃，220rpm/min恒温振荡培养9-12h。

菌落特征：乳白色，圆形，菌落边缘整齐，表面光滑，表面和背面颜色一致。