大肠杆菌培养基配制及培养方法

(完整版)大肠杆菌培养基配制及培养方法

大肠杆菌培养一、菌种冻存液的制备含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40%甘油，-80o C冻存。

二、培养基制备LB培养基配方（胰化蛋白胨（Trypton）：10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5 g/L；NaCl：10 g/L；pH 7.4）液体培养基胰化蛋白胨 10.0g酵母粉 5.0g氯化钠 10.0g水 1000mlpH 7.4固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5％－2.0％的琼脂三、平板的制备1）称取胰化蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，加入800mL二次水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，用1mol/L的NaOH调pH至7.4左右，定容至1L，调pH 7.4（若溶液pH大于7.4，用1mol/L HCl回调）。

2）分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。

如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%的琼脂（150mL液体培养基加入2.5g琼脂）。

3）在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。

所有锥形瓶如上述操作。

用记号笔注明培养基名称、配制日期。

4）高压蒸汽灭菌锅121 oC灭菌15min。

5）灭菌后的培养基取出置电热鼓风干燥器内60oC烘干，待锥形瓶的封口纸干燥后取出。

液体培养基可直接保存或使用，此时加有琼脂的培养基不会凝固，可在预先紫外杀菌30min以上的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿内，每个培养皿培养基约10-15mL（直径90mm），在培养皿中厚度大约4mm左右。

将平皿叠放在无菌操作台上，放置10min左右，待琼脂基本凝固可涂平板。

6）若平板不直接使用，灭菌后将培养基在锥形瓶中保存，待需制备平板时，微波炉中火加热约3min，使琼脂熔化，室温冷却20min至不烫手可制备平板。

四、接种大肠杆菌1）取实验室储备的大肠杆菌BL21冻存液，管口用酒精灯灼烧，打开离心管。

2）接种方法一：用灭菌枪头蘸取冻存液在平板边缘上划横条，每三道为一组，旋转平皿一圈，最后中间划之字；接种方法二：用移液枪吸取100uL溶液于平板上，用酒精灯灭菌厚的涂抹棒划十字，涂布平板。

大肠杆菌培养

大肠杆菌培养引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种广泛存在于自然界中的革兰氏阴性细菌。

它是一种常见的微生物实验室模型生物，在分子生物学研究、基因工程、生物技术等领域发挥着重要作用。

本文将介绍大肠杆菌的培养方法，包括培养基的配制、接种方法、培养条件的控制等。

培养基配制大肠杆菌培养基的配制是培养大肠杆菌的重要前提，不同的菌株和研究目的需要使用不同的培养基。

下面介绍两种常用的培养基配方：Luria-Bertani（LB）培养基LB培养基是最常用的大肠杆菌培养基之一，它是一种富含营养物质的培养基，适用于一般的大肠杆菌培养。

配方：•水：800 ml•Bacto-tryptone：10 g•Yeast extract：5 g•NaCl：10 g•琼脂：15 g将上述成分加入水中，搅拌均匀，然后加热至溶解，最后将pH调节至7.0 ± 0.2。

M9盐基培养基M9盐基培养基是一种缺乏有机碳源和氮源的无营养培养基，适用于研究大肠杆菌的生理特性或用于表达外源蛋白。

配方：•水：700 ml•Na2HPO4：12.8 g•KH2PO4：3 g•NH4Cl：1 g•NaCl：0.5 g•CaCl2：0.1 g•MgSO4：0.2 g•葡萄糖：2 g•琼脂：15 g将上述成分加入水中，搅拌均匀，然后加热至溶解，最后将pH调节至7.0 ± 0.2。

接种方法大肠杆菌的接种方法有多种，常见的有无菌接种环和无菌注射器接种法。

下面分别介绍这两种接种方法：无菌接种环接种法步骤：1.用火焰将无菌接种环烧红，冷却至适宜温度。

2.打开培养基瓶盖，用无菌接种环蘸取待接种的大肠杆菌菌株。

3.快速将无菌接种环插入含有培养基的琼脂平板（或试管）中，并迅速转动接种环1-2圈，使菌体均匀分布在琼脂平板（或液体培养基）表面。

4.关闭琼脂平板（或试管）盖子，使琼脂凝固后，将琼脂平板（或试管）置于适宜的培养条件下。

无菌注射器接种法步骤：1.用火焰将无菌注射器的针头烧红，冷却至适宜温度。

大肠杆菌培养基

大肠杆菌培养基大肠杆菌（Escherichia coli）是一种革兰氏阴性杆菌，是一种常见的肠道细菌，也是一种重要的实验室模式生物。

大肠杆菌培养基是一种用于培养和繁殖大肠杆菌的营养培养基，它提供了大肠杆菌所需的营养物质和生长条件，使其能够在实验室中进行研究和应用。

大肠杆菌培养基的组成。

大肠杆菌培养基的组成通常包括以下成分：1. 碳源，大肠杆菌需要碳源来进行能量代谢和生长。

常见的碳源包括葡萄糖、蔗糖、乳糖等。

2. 氮源，氮源是大肠杆菌合成蛋白质和核酸的重要原料。

常见的氮源包括氨基酸、氨基酸盐、蛋白胨等。

3. 矿物盐，矿物盐是细胞生长和代谢所必需的微量元素，如钙、镁、钾、磷等。

4. 生长因子，大肠杆菌培养基中通常还添加了一些生长因子，如维生素、核酸、辅酶等，以促进大肠杆菌的生长和繁殖。

5. pH调节剂，培养基的pH值对大肠杆菌的生长有重要影响，通常需要添加pH调节剂来保持培养基的适宜pH范围。

根据不同的研究目的和实验条件，大肠杆菌培养基的配方会有所不同，可以根据实际需要进行调整和优化。

大肠杆菌培养基的制备方法。

大肠杆菌培养基的制备方法相对简单，一般包括以下步骤：1. 称取适量的葡萄糖、蛋白胨、氯化钠等成分，加入适量的蒸馏水中，搅拌均匀。

2. 调节pH值至适宜范围，通常大肠杆菌培养基的pH范围为7.0-7.4。

3. 加热蒸馏水，使培养基成分充分溶解。

4. 经过高温高压灭菌，使培养基无菌。

5. 分装培养基到适量的培养皿或试管中，待凝固后即可使用。

根据实验需求，可以添加抗生素、染色剂等成分，以实现对大肠杆菌的选择性培养。

大肠杆菌培养基的应用。

大肠杆菌培养基在科研和实验室应用中具有广泛的用途，主要包括以下几个方面：1. 细菌学研究，大肠杆菌培养基常用于大肠杆菌的分离、鉴定和培养，用于研究其生长特性、代谢途径、致病机制等。

2. 分子生物学实验，大肠杆菌是常用的重组DNA宿主细胞，大肠杆菌培养基可用于大肠杆菌的转化、表达、筛选等实验。

(完整版)大肠杆菌培养基配制及培养方法

大肠杆菌培养一、菌种冻存液的制备含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40%甘油，-80o C冻存。

二、培养基制备LB培养基配方（胰化蛋白胨（Trypton）：10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5 g/L；NaCl：10 g/L；pH 7.4）液体培养基胰化蛋白胨 10.0g酵母粉 5.0g氯化钠 10.0g水 1000mlpH 7.4固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5％－2.0％的琼脂三、平板的制备1）称取胰化蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，加入800mL二次水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，用1mol/L的NaOH调pH至7.4左右，定容至1L，调pH 7.4（若溶液pH大于7.4，用1mol/L HCl回调）。

2）分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。

如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%的琼脂（150mL液体培养基加入2.5g琼脂）。

3）在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。

所有锥形瓶如上述操作。

用记号笔注明培养基名称、配制日期。

4）高压蒸汽灭菌锅121 oC灭菌15min。

5）灭菌后的培养基取出置电热鼓风干燥器内60oC烘干，待锥形瓶的封口纸干燥后取出。

液体培养基可直接保存或使用，此时加有琼脂的培养基不会凝固，可在预先紫外杀菌30min以上的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿内，每个培养皿培养基约10-15mL（直径90mm），在培养皿中厚度大约4mm左右。

将平皿叠放在无菌操作台上，放置10min左右，待琼脂基本凝固可涂平板。

6）若平板不直接使用，灭菌后将培养基在锥形瓶中保存，待需制备平板时，微波炉中火加热约3min，使琼脂熔化，室温冷却20min至不烫手可制备平板。

四、接种大肠杆菌1）取实验室储备的大肠杆菌BL21冻存液，管口用酒精灯灼烧，打开离心管。

2）接种方法一：用灭菌枪头蘸取冻存液在平板边缘上划横条，每三道为一组，旋转平皿一圈，最后中间划之字；接种方法二：用移液枪吸取100uL溶液于平板上，用酒精灯灭菌厚的涂抹棒划十字，涂布平板。

大肠杆菌自动诱导培养基配方及操作方法

大肠杆菌自动诱导培养基配方及操作方法大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道细菌，也是实验室中常用的菌种之一、下面是大肠杆菌自动诱导培养基的配方及操作方法。

一、自动诱导培养基配方：1.碳源：-葡萄糖（10g/L）：作为主要的碳源供给菌体能量。

-乳糖（5g/L）：用于诱导乳糖酶的表达。

2.氮源：-酵母粉（5g/L）：提供菌体生长所需的氮源。

3.盐类：-氯化钠（5g/L）：维持培养基的渗透压和离子平衡。

4.调节剂：-草酸二钠（1.36g/L）：调节培养基的pH值，保持适宜的生长环境。

5.其他添加剂：-磷酸二氢钾（5g/L）：提供磷酸盐的源，促进菌体生长。

-氯化钾（0.25g/L）：提供钾盐的源，满足菌体对钾的需求。

-氯化镁（0.5g/L）：提供镁盐的源，满足菌体对镁的需求。

配方中的所有化学品都可以在实验室常见试剂供应商处购买得到。

二、自动诱导培养基操作方法：1.准备培养基：a.根据配方将所需的化学品称量并溶解在适量的去离子水中。

b.用自动滤器（pH7.0）滤过溶液以去除可能存在的微生物污染。

c.调节培养基的pH至7.0，再用去离子水补足总体积至所需浓度。

2.灭菌：a.将调好pH的培养基倒入适量的培养瓶中。

b.放入高压灭菌锅中，进行高压灭菌。

3.菌种接种：a.选取一株适宜的大肠杆菌菌株，用无菌技术将其接种至培养基中。

b. 将接种好的培养基培养瓶放入恒温摇床中，以28°C恒温、200 rpm的条件下培养。

4.观察生长：a.在培养过程中，定期取一部分培养基进行测量分析。

b.测量菌液的光密度（OD值），以评估菌体生长情况。

5.收获细胞：a.在菌液达到一定浓度后，用无菌操作将菌液转移到离心管中。

c.将沉淀用缓冲液重悬。

6.文库构建：a.从收获的菌体中提取DNA，并使用合适的方法构建文库。

以上即为大肠杆菌自动诱导培养基的配方及操作方法。

在实验过程中，要注意使用无菌技术，尽量避免微生物污染。

大肠杆菌培养步骤方法

大肠杆菌培养步骤方法大肠杆菌是一种重要的细菌，它在实验室中被广泛用于分子生物学研究和基因工程。

下面是大肠杆菌的培养步骤方法，共50条，并展开详细描述：1. 准备所需的培养基及试剂，包括琼脂、培养基粉、蔗糖、牛肉膏、酵母提取物、氯化钠、磷酸二氢钾等。

2. 将琼脂及培养基粉加入适量蒸馏水中，搅拌均匀后加热至沸腾，然后灭菌。

3. 将灭菌后的琼脂培养基倒入培养皿中，使其凝固成固体琼脂。

4. 取出实验室保存的大肠杆菌菌种，用无菌吸管从存储容器中取出适量菌液。

5. 将菌液均匀地涂布在琼脂培养皿表面，待其吸收后轻轻晃动培养皿使其均匀分布。

6. 将涂布好的培养皿倒置放入孵化箱中，以37℃恒温孵育。

7. 每隔一段时间观察培养皿上的菌落形成情况，选择合适的菌落进行分离和培养。

8. 在培养过程中，注意观察是否有任何异常，如细菌变异、污染等情况。

9. 定期检查培养基的PH值和温度，保持在适宜的范围内。

10. 当需要保存大肠杆菌菌株时，可以将单一菌落悬浮在无菌离心管中，并添加10%甘油保藏在-80℃低温库中。

11. 每次操作前要做好无菌操作，以避免外源菌的污染。

12. 大肠杆菌培养时，应严格控制氧气供应，可以选择静态培养或者摇瓶培养。

13. 在摇瓶培养中，要保持培养液的充分通气，防止细菌缺氧而死亡。

14. 对于含氧厌恶的大肠杆菌菌株，可以选择在含葡萄糖并定期通氮气的缺氧箱中进行培养。

15. 大肠杆菌培养皿观察时，可使用显微镜进行观察，观察菌落形态、大小和颜色等特征。

16. 对于选择性培养基的应用，可以根据需要添加抗生素或者其他选择性物质来筛选感兴趣的菌株。

17. 在进行大肠杆菌培养时，要注意控制培养基的含盐量和碳源，以及其他微量元素的添加。

18. 可以通过PCR或者其他分子生物学方法快速鉴定大肠杆菌的种属和亚种属。

19. 在大肠杆菌的培养中，要注意排放生物危害废弃物，并采取相应的安全防护措施。

20. 大肠杆菌培养时，要做好相关记录，包括菌种信息、培养条件、观察结果等。

大肠杆菌一般培养方法

大肠杆菌一般培养方法大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道细菌，也是生物学研究中最常用的模式菌株之一、大肠杆菌具有广泛的分布范围，可以在许多环境中生存和繁殖。

本文将介绍大肠杆菌的一般培养方法。

一、培养基的制备大肠杆菌的培养基通常包括两个主要组分：固体培养基和液体培养基。

固体培养基用于菌落计数和细菌分离，并可用于培养单个菌落。

液体培养基则可用于扩大菌种和进行大规模的培养。

1.固体培养基的制备最常用的固体培养基为琼脂培养基。

制备过程如下：（1）称取所需琼脂，加入适量的蒸馏水中，进行均匀搅拌。

（2）加热至100摄氏度，溶解琼脂。

（3）煮沸1-2分钟，消毒琼脂。

（4）冷却至约50摄氏度。

（5）加入所需的培养基成分，如营养物质和抗生素等。

（6）倒入培养皿中，待凝固后即可使用。

2.液体培养基的制备最常用的液体培养基包括LB培养基（Lysogeny Broth）和TB培养基（Terrific Broth）。

制备过程如下：（1）称取所需培养基成分，加入适量蒸馏水中。

（2）加入琼脂和洗涤剂等成分，以调整液体的黏度和表面张力。

（3）调整pH值。

（4）加热并搅拌溶解，待溶解后冷却。

（5）过滤培养基，以去除不溶性杂质。

（6）分装到培养瓶中。

二、大肠杆菌的预培养将保存的大肠杆菌菌种(如冻存菌)挑取一高洁净的培养皿上贴菌，通常可采用菌板上交叉涂布法，用三角稀菌棒反复涂抹菌落。

之后用无菌瓷珠轻压菌落，使其均匀分散于培养皿上。

贴菌后将培养皿倒置，避免水分凝结在盖子上。

培养皿翻转的目的是避免水珠滴入培养基内，影响气体交换。

然后将培养皿放入培养箱中，37℃保温，24小时后进行预培养。

三、大肠杆菌的正式培养预培养后，取适量的大肠杆菌菌落液，加入培养基中，并进行摇床培养。

有时候，还需要在培养基中添加相应的抗生素，以筛选具有特定基因或表现的菌株。

培养条件一般为37摄氏度、摇床转速为200-250转/分钟。

培养时间根据需要和实验目的而定。

培养基配方及配制方法

培养基配方及配制方法培养基是一种用于寄养和培养细胞、微生物、组织等生物体的基质。

其配方的选择和配制方法对于不同的生物体和研究目的有很大的差异。

以下是一般常用的培养基配方及简单的配制方法：1. LB培养基（Luria-Bertani）LB培养基是常见的用于大肠杆菌等细菌的培养基，其配方包括：- 1% 蛋白胨（tryptone）: 添加营养源和能量- 0.5% 酵母粉（yeast extract）: 提供维生素和生长因子-1%NaCl（氯化钠）:调节渗透压-蒸馏水:使混合液体稀释至所需体积配制方法：将蛋白胨、酵母粉和NaCl加入蒸馏水中，调整pH至7.0，将混合液体加热至溶解，过滤杂质，如需固化则加入1.5%的琼脂。

2. YPD培养基（Yeast extract-Peptone-Dextrose）YPD培养基常用于酵母菌的培养，其配方包括：- 1% 酵母提取物（yeast extract）: 提供维生素和生长因子- 2% 蛋白胨（peptone）: 为细菌提供碳源和能量- 2% 葡萄糖（dextrose）: 为细菌提供碳源和能量-蒸馏水:使混合液体稀释至所需体积配制方法：将酵母提取物、蛋白胨和葡萄糖加入蒸馏水中，调整pH至7.0，将混合液体加热至溶解，过滤杂质，如需固化则加入2%的琼脂。

3. DMEM培养基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）DMEM培养基是常用的哺乳动物细胞培养基，其配方包括：-10%胎牛血清（FBS）:提供生长因子和营养物质- 1% 青霉素-链霉素溶液（Penicillin-Streptomycin Solution）: 防止细菌污染- 1% L-谷氨酰胺（L-Glutamine）: 提供细胞代谢所需的基础物质-DMEM基础培养液:包括氨基酸、维生素等成分-蒸馏水：使混合液体稀释至所需体积配制方法：将胎牛血清、青霉素-链霉素溶液、L-谷氨酰胺和DMEM基础培养液加入蒸馏水中，调整pH值至7.4，混合均匀即可。

大肠杆菌一般培养方法

大肠杆菌一般培养方法大肠杆菌是一种常见的肠道细菌，也是实验室常用的模型菌株之一、它具有许多重要的应用价值，如基因工程、发酵制药和生物学研究等。

因此，了解大肠杆菌的常规培养方法是非常重要的。

大肠杆菌的培养基本上可以分为两个类型：液体培养基和固体培养基。

下面我将为您详细介绍。

1.液体培养基液体培养基是一种将细菌培养在含有养分的液体中的方法。

使用液体培养基可以快速扩大大肠杆菌数量，并且可以用于后续实验，如基因克隆和蛋白表达等。

下面是一种常见的液体培养基配方：- 色氨酸酸盐 (tryptone): 10g/L- 酵母粉 (yeast extract): 5g/L-氯化钠(NaCl):10g/L- 葡萄糖 (glucose): 5g/L-洗涤剂提供的磷酸缓冲溶液(PBS)：500mL，pH值自动调整到7.0将这些成分溶解在适量的去离子水中，并将溶液进行无菌过滤。

然后将无菌培养基分装到培养瓶中，每个瓶子的体积约为250-500mL，用铝箔进行覆盖。

接种数量的大肠杆菌通常为菌液的10-20倍。

将培养瓶放在摇床上以200rpm的速度培养，温度为37°C。

培养时间一般为12-16小时。

2.固体培养基固体培养基是将细菌培养在含有固体化剂（如琼脂）的培养基上的方法。

使用固体培养基可以使大肠杆菌形成菌落，便于分离和挑选单个菌落。

下面是一种常见的固体培养基配方：- 琼脂 (agar): 15g/L- 色氨酸酸盐 (tryptone): 10g/L- 酵母粉 (yeast extract): 5g/L-氯化钠(NaCl):10g/L- 葡萄糖 (glucose): 5g/L-洗涤剂提供的磷酸缓冲溶液(PBS)：500mL，pH值自动调整到7.0将这些成分溶解在适量的去离子水中，并将溶液进行无菌过滤。

然后将无菌培养基分装到试管或平盘中，每个试管或平盘的体积约为10-15mL或20-25mL，用无菌塞子或膜进行封口。

大肠杆菌的培养与分离

五、大肠杆菌分离后保存
1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4℃冰箱保存。 2、长期保存：甘油冷冻管藏法
小结
1.如何操作才可以尽量避免被杂菌污染?
(1)胆大心细，操作快捷。（2）注意灭菌操作原则，灭菌彻底，降低环境污染概率。（3）注意微生物生长条件，如PH、渗透压、温度等。细菌喜碱，喜蛋白质，喜37度；霉菌喜酸，喜糖，喜25-30度
5.平板冷凝后，要将平板倒置,既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染.
三、大肠杆菌的扩大培养
将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的液体培养基中,使其在37℃摇床培养12小时。
注意事项:
1.火焰旁从斜面上用接种环取菌;
2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧灭菌,冷却后方能取菌; 3.取菌后封口膜和棉塞复原.
【课堂练习】例1．关微生物营养物质的叙述中，正确的是（ D） A.是碳源的物质不可能同时是氮源
B.凡碳源都提供能量
C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量
例2防止杂菌污染
B.接种前菌种要进行灭菌
C.培养基和发酵设备都必须灭菌 D.灭菌必须在接种前
2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
答：以免接种环温度太高，杀死菌种。 3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
FeSO4 CaCl2 H 2O
0.5g 0.5g 100ml
（3）若除去成分②，加入（CH2O），该培养基可用于培养固氮微生物。（4）表中营养成分共有 3 类。（5）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是调整pH 。（6）右表中各成分重量确定的原则是依微生物的生长需要确定。（7）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分琼脂（或凝固剂）。

大肠杆菌培养基制备过程

大肠杆菌培养基制备过程
制备大肠杆菌培养基的过程如下：
1. 准备培养基成分：大肠杆菌培养基的成分包括碳源、氮源、矿物质盐及其他添加物。

常用的
碳源有葡萄糖、蔗糖等；氮源可以选择氨基酸、氨基酸类化合物等；矿物质盐可以选择无机盐、有机盐等。

添加剂有pH调节剂、辅因子等。

2. 杀菌处理：将所需的碳源、氮源、矿物质盐及其他添加物加入适量的蒸馏水中，经过高温高
压灭菌处理。

3. 酶解处理：将培养基中添加的蛋白质进行酶解处理，以提供大肠杆菌生长所需的氮源。

4. 调整pH值：使用pH调节剂调整培养基的pH值，常见的调节剂有氢氧化钠和氢氧化钾等。

5. 分装和灭菌：将制备好的培养基分装到培养瓶或培养皿中，然后进行高温高压灭菌处理，以
保证培养基的无菌状态。

6. 储存和使用：将灭菌后的培养基在低温下储存，以延长其使用寿命。

使用时，将培养基回溶，配制成适当浓度的液态培养基，用于大肠杆菌的培养和研究。

需要注意的是，大肠杆菌培养基的制备过程可能存在一定的差异，具体的制备步骤和成分比例
可根据实验需求进行调整。

此外，操作过程中需要注意无菌操作，并保持培养基的无菌状态，
以避免杂菌污染。

大肠杆菌培养基配制及培养方法

大肠杆菌培养一、菌种冻存液的制备含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40%甘油，-80o C冻存。

二、培养基制备LB培养基配方（胰化蛋白胨（Trypton）：10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5 g/L；NaCl：10 g/L；pH 7.4）液体培养基胰化蛋白胨 10.0g酵母粉 5.0g氯化钠 10.0g水 1000mlpH 7.4固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5％－2.0％的琼脂三、平板的制备1）称取胰化蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，加入800mL二次水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，用1mol/L的NaOH调pH至7.4左右，定容至1L，调pH 7.4（若溶液pH大于7.4，用1mol/L HCl回调）。

2）分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。

如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%的琼脂（150mL液体培养基加入2.5g琼脂）。

3）在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。

所有锥形瓶如上述操作。

用记号笔注明培养基名称、配制日期。

4）高压蒸汽灭菌锅121 oC灭菌15min。

5）灭菌后的培养基取出置电热鼓风干燥器内60oC烘干，待锥形瓶的封口纸干燥后取出。

液体培养基可直接保存或使用，此时加有琼脂的培养基不会凝固，可在预先紫外杀菌30min以上的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿内，每个培养皿培养基约10-15mL（直径90mm），在培养皿中厚度大约4mm左右。

将平皿叠放在无菌操作台上，放置10min左右，待琼脂基本凝固可涂平板。

6）若平板不直接使用，灭菌后将培养基在锥形瓶中保存，待需制备平板时，微波炉中火加热约3min，使琼脂熔化，室温冷却20min至不烫手可制备平板。

四、接种大肠杆菌1）取实验室储备的大肠杆菌BL21冻存液，管口用酒精灯灼烧，打开离心管。

2）接种方法一：用灭菌枪头蘸取冻存液在平板边缘上划横条，每三道为一组，旋转平皿一圈，最后中间划之字；接种方法二：用移液枪吸取100uL溶液于平板上，用酒精灯灭菌厚的涂抹棒划十字，涂布平板。

大肠杆菌培养操作规程

大肠杆菌培养操作规程大肠杆菌是一种常见的革兰氏阴性细菌，广泛存在于土壤、水体、动植物体内等环境中，是一种重要的实验菌株。

在分子生物学和遗传工程的研究中，常用大肠杆菌作为宿主进行DNA重组、蛋白表达等操作。

下面是大肠杆菌培养操作规程，详细介绍了培养基配制、无菌操作和培养条件的要点。

一、培养基配制1.LB培养基配制：-将10g/L的蛋白胨和5g/L的酵母粉加入1000mL的蒸馏水中，搅拌溶解。

-加入5g/L的氯化钠和15g/L的琼脂糖，搅拌均匀。

-调节pH值为7.0，并用蒸馏水补足到1L。

-装入适量培养瓶中，用自吸过滤器过滤杂质后，压紧玻璃瓶盖。

-在121°C高压蒸汽灭菌器中高压下蒸煮30分钟。

-冷至50°C左右后，即可使用。

2.青霉素抗生素的添加：- 使用10mL 的β-内酰胺抗生素青霉素钾盐（100mg/mL）。

-在室温下将药物滴入培养基中。

-搅拌使药物均匀分布于培养基中。

二、无菌操作1.无菌操作区域：-使用无菌柜进行操作，以保证培养物中不受到外界的细菌污染。

-操作前将无菌柜的工作区域用75%酒精喷雾消毒。

2.培养物接种操作：-取一支培养物的试管，用无菌匙蘸取培养物碰触到无菌培养基，轻轻搅拌均匀。

-取一支无菌的移液管，将含有培养物的液体尽量缓慢地加入到培养基中。

-在接种完成后，用无菌铝箔封好培养基表面，以防止进一步的细菌污染。

三、培养条件1.温度与时间：-大肠杆菌在常规情况下在37°C下生长最好。

而对于一些特殊要求的实验，也可在30°C或42°C下培养。

-培养时间根据实验不同而定，通常在12-16小时为一个周期。

2.培养环境：-培养过程中应控制氧气的供应量，通常可以使用摇床培养。

-pH值控制在6.8-7.2之间，以便细菌生长繁殖。

3.培养密度：-通常使用100-1000mL培养基装入培养瓶中，以便细菌有足够的空间进行生长。

-在培养过程中需要适时摇晃培养瓶，以帮助培养物进行氧气和营养物的均匀供应。

大肠杆菌培养基配制及培养方法

大肠杆菌培养基配制及培养方法大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛用于分子生物学实验和基因工程研究中。

为了成功培养大肠杆菌，我们需要配制适合其生长繁殖的培养基，并采用正确的培养方法。

以下是大肠杆菌培养基的配制及培养方法的详细介绍。

一、大肠杆菌培养基的配制1. Luria-Bertani（LB）培养基LB培养基是最常用的培养基之一，其成分包括三个主要组成部分：氮源、碳源和盐类。

氮源：用于提供细菌所需的氮元素，可以使用氨基酸、含氮化合物等。

常用的氮源有氨基酸混合物、酵母提取物和酪蛋白水解物等。

碳源：用于提供细菌所需的碳元素，可以使用单糖、复糖、酒精、醇等。

常用的碳源有葡萄糖和乳糖等。

盐类：培养基中加入适量的盐类，以提供维持细菌生长所需的离子平衡，常用的盐类有氯化钠、磷酸二氢钠、氯化镁等。

将氮源、碳源和盐类按照一定比例混合，加入适量的蒸馏水中，调节pH值至7.0左右，然后用高压蒸汽灭菌。

2.M9培养基M9培养基是一种突变细菌筛选培养基，其主要成分是无机盐和碳源。

无机盐：使用硫酸铵、磷酸二氢钾、氯化钠等无机盐调配而成。

碳源：使用葡萄糖、蔗糖、乳糖等单糖或多糖。

按照一定比例混合无机盐和碳源，加入适量的蒸馏水中，调节pH值至7.0左右，然后用高压蒸汽灭菌。

二、大肠杆菌的培养方法1.培养前的预处理将所需的培养基配制好，装入洁净的培养皿或试管中，然后用高压蒸汽灭菌。

在培养大肠杆菌前，需要将冻存的菌株从-80℃的冰箱中取出，快速化解并接种至预先准备的LB或M9培养基中。

2.培养条件大肠杆菌的适宜生长温度为37℃，因此在培养过程中需要将培养皿放在37℃恒温培养箱中。

同时，还需控制培养时间和培养瓶内的氧气含量。

3.培养方法（1）液体培养将培养基加热至适温后，接种所需菌株，一般取两根菌体悬浮液放入新鲜的培养基中，使得初始菌体数约为10^7个/毫升。

随后放入37℃恒温培养箱中培养，每隔一段时间取样进行检测。

大肠杆菌发酵培养基及发酵培养方法

大肠杆菌发酵培养基及发酵培养方法大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的革兰氏阴性菌，广泛存在于人体和动物的肠道中。

大肠杆菌是一种非致病性菌株，也是一种重要的实验室模式细菌，广泛用于生物学、分子生物学和生物工程等领域的研究。

在研究中，为了培养大肠杆菌并使其生长繁殖，需要提供适宜的发酵培养基。

下面将介绍一种常用的大肠杆菌发酵培养基及发酵培养方法。

1. 碱性消化酪蛋白（Peptone）：提供菌体生长所需的氨基酸和碳氮源。

2. 天然酪蛋白（Tryptone）：提供菌体生长所需的氨基酸和碳氮源。

3.单质氯化钠（NaCl）：维持适宜的渗透压。

4.复合钠磷酸盐缓冲液：维持培养基的pH值。

5.复合钠酸盐或磷酸二钠：提供磷酸和其他离子。

6.葡萄糖：作为碳源供能。

7. 瓜尔豆胨（Yeast Extract）：提供维生素和微量元素。

8.氯化镁（MgCl2）：提供镁离子，促进细菌生长。

9. 镓氰酸（Glycerol）：提供细菌生长所需的能源。

10.硫酸镁（MgSO4）：提供硫酸和镁离子。

大肠杆菌的发酵培养方法如下：1.准备培养基：根据具体实验目的配制相应的发酵培养基，常用的是LB培养基。

首先称取适量的碱性消化酪蛋白、天然酪蛋白和葡萄糖，溶解于适量的水中，调整pH值为7.0。

然后加入其他成分，如NaCl、复合钠磷酸盐缓冲液等，再加入足够的水使总体积达到所需量。

最后将培养基加热至沸腾，搅拌溶解，然后用自动过滤器过滤除菌。

2.酸碱调节：将培养基分装到培养瓶中，每瓶约装200-250mL。

使用滤液灭菌器或高温高压灭菌，将培养基灭菌。

3.原液接种：取一天前培养好的大肠杆菌菌种，用直线均匀接种于含有发酵培养基的培养瓶中，可根据需要调整接种量。

4.接种培养：将培养瓶置于恒温摇床上适当温度的恒温箱中，保持适宜的温度（通常为37℃）和摇动速度。

等待一定的时间，观察细菌生长情况。

5.静置培养：可以将菌液经过适当的培养时间后进行离心，去掉上清液，留下细菌沉淀。

大肠杆菌如何培养

大肠杆菌如何培养大肠杆菌（Escherichia coli）是一种广泛存在于自然界中的革兰氏阴性菌，是常见的肠道菌群中的一种。

大肠杆菌在科研领域和工业领域中非常重要，因为它作为一种模式微生物，广泛应用于基因工程、蛋白表达、酶制备、细胞生物学等领域的研究和应用。

培养大肠杆菌需要一定的培养基和条件，下面将介绍大肠杆菌的培养方法。

一、培养基的准备培养大肠杆菌所需的基本培养基是含有营养物质的培养液，如Luria-Bertani培养基（LB培养基）。

LB培养基的主要成分包括蛋白胨、酵母提取物、氯化钠和葡萄糖。

可以根据需要对LB培养基进行改良，如添加不同的抗生素以筛选转基因菌株。

二、大肠杆菌的分离和保存1.分离方法：（1）从样品中取一小部分，如土壤样品、水样或其他样品，制备10倍稀释系列。

（2）将每个稀释液均匀地涂布到含有LB培养基的琼脂平板上。

（3）将琼脂平板倒置放入37℃恒温培养箱中培养约12-24小时，直到出现菌落。

（4）将不同形态的菌落挑选出来，用成层排样法分离出单斑菌株。

2.保存方法：（1）利用冷冻保存：将单斑菌落接种到含有LB培养基和15%甘油的离心管中，混匀后急速冷冻到-80℃，并进行长期保存。

（2）利用冷冻干燥保存：将单斑菌落接种到含有LB培养基的离心管中，培养后在-80℃的环境下进行冷冻干燥。

三、大肠杆菌的液体培养1.悬浮培养：（1）从保存的冷冻物中，挑选适量的菌落接种到含有LB培养基的培养瓶中。

（2）将培养瓶放入37℃恒温摇床中以200-250rpm的振荡速度摇培养约8-12小时。

2.深层培养：（1）取一定量的培养液接种到含有LB培养基的试管中，将试管倾斜放置，使培养液接触空气。

（2）将试管放入37℃恒温培养箱中培养12-24小时，直到培养液产生沉淀。

四、大肠杆菌的固体培养1.斜面培养：（1）将大肠杆菌接种到含有LB培养基的琼脂平板上。

（2）将琼脂平板倒置放入37℃恒温培养箱中培养约12-24小时，直到出现菌落。

大肠杆菌显色培养基

编号：CRM002中文名称：大肠杆菌显色培养基英文名称：ChromogenicE.coli Agar用途：用于大肠杆菌的快速检测和计数。

原理：蛋白胨和酵母膏粉提供碳氮源和微量元素;氯化钠可维持均衡的渗透压;琼脂是培养基的凝固剂;十二烷基硫酸钠抑制革兰氏阳性菌;显色底物与大肠杆菌β-葡萄糖醛酸苷酶发生特异性反应，水解底物，释放出显色基团，在淡黄色平板上产生绿色的菌落。

图鉴：配方(每升)：蛋白胨 10g酵母膏粉 3g氯化钠 5g十二烷基硫酸钠 0.1g琼脂 12g显色底物 2.7g最终pH 7.0±0.2使用方法：1、称取本品32.8g，加入蒸馏水或去离子水1 L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，无需高压灭菌。

2、以无菌手续取样品25g或25mL，加入含225mL无菌磷酸盐缓冲液(或生理盐水)的三角瓶内，充分振摇或用均质器均质1min成1：10稀释液，然后以1：10继续稀释，选择三个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种两个平皿。

3、采用倾注法：将培养基水浴冷却至约50℃，准备直径90mm已灭菌平皿，每个培养皿接种1ml样品，然后倾注约15ml上述溶解的培养基，混匀使其凝固，倒置，37℃培养24小时。

4、采用表面接种法：冷却至约50℃，摇匀将培养基倾注于已灭菌平皿中。

在室温可保存一天或在冰箱里贮存数天(避光，4℃)。

样品用划线接种法或滤膜法，37℃培养24小时。

5、观察结果。

质量控制：本品倾注平皿后呈淡黄色，下列菌株接种后于36℃±1℃培养18h～24h生长情况如下表。

菌名菌号生长状况培养特征大肠埃希氏菌ATCC25922 良好菌落绿色弗氏柠檬酸杆菌ATCC43864 良好菌落无色粪肠球菌ATCC29212 受抑制-----贮存：贮存于10℃-30℃、避光、阴凉干燥处，用后立即旋紧瓶盖。

贮存期二年。

规格：可配置1L的培养基干粉。

大肠杆菌培养操作规程

大肠杆菌培养操作规程一、目的及适用范围制订本规程的目的为规范大肠杆菌总RNA的制备，保证为诊断试剂产品提供质量可控的质控品及标准品基质。

本规程适用于南京实验室提取大肠杆菌总RNA的操作。

依照本操作规程，每次可提前大约提取基质液原液2.7ml。

二、常规时间安排预计安排步骤耗材准备PBS储存液配置第一天培养基配制灭菌领取菌种菌种复苏第二天接种分装培养RNA完全提取根据需求，自行安排。

三、培养用耗材准备1、锥形瓶、双层铝箔、棉绳2、包扎一盒1ml的枪头，50ml康宁冻存管四、培养基配制(早上)培养基应现配现用，每次配置350ml，一次性使用完毕。

1、按下表称取物资配置LB培养基到500ml锥形瓶中：例如：配制350mlLB培养基配方如下：[配置双份]蛋白胨成分名称TRYPTONE称取质量3.5g钠3.5gYEAST某TRACT1.75g补足350ml氯化酵母提取物去离子水耗时评估20min40min20min3h10min9h40min13h2、用双层铝箔和棉绳对锥形瓶进行封口，摇晃锥形瓶以使各物质迅速、均匀、完全、溶解。

待灭菌。

五、PBS溶液配制1、10某PBS不需要每次生产都配置，生产前跟检查PBS量是否充足，如充足则可跳过该步骤。

2、配制10某PBS缓冲液备用；例如配制1000L10某PBS储存液，取1000ml配液瓶，根据下表称取各物质。

用去离子水定容至1000ml。

名称浓度H2ONaClKClNa2HPO4KH2PO4称取量10某1000ml80.0g2.0g14.4g2.4g3、将PBS溶液混合均匀，包扎好，待灭菌。

六、灭菌1、将配置好的PBS溶液，培养基，1ml枪头准备好。

2、确认灭菌锅内水位是否达到标准水位，若未达到，则加入纯化水至标准水位。

3、将包扎好的培养基、PBS溶液和枪头盒一同放入灭菌锅。

注意PBS盖不可太紧，盖紧灭菌锅盖，须旋紧；设置各参数：121℃，20min。

4、灭菌结束后，待灭菌锅压力降至“0”，打开灭菌锅盖；取出灭好菌的培养基和枪头盒。