大肠杆菌培养方法
(完整版)大肠杆菌培养基配制及培养方法
大肠杆菌培养一、菌种冻存液的制备含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40%甘油，-80o C冻存。
二、培养基制备LB培养基配方（胰化蛋白胨（Trypton）：10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5 g/L；NaCl：10 g/L；pH 7.4）液体培养基胰化蛋白胨 10.0g酵母粉 5.0g氯化钠 10.0g水 1000mlpH 7.4固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5％－2.0％的琼脂三、平板的制备1）称取胰化蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，加入800mL二次水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，用1mol/L的NaOH调pH至7.4左右，定容至1L，调pH 7.4（若溶液pH大于7.4，用1mol/L HCl回调）。
2）分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。
如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%的琼脂（150mL液体培养基加入2.5g琼脂）。
3）在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。
所有锥形瓶如上述操作。
用记号笔注明培养基名称、配制日期。
4）高压蒸汽灭菌锅121 oC灭菌15min。
5）灭菌后的培养基取出置电热鼓风干燥器内60oC烘干，待锥形瓶的封口纸干燥后取出。
液体培养基可直接保存或使用，此时加有琼脂的培养基不会凝固，可在预先紫外杀菌30min以上的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿内，每个培养皿培养基约10-15mL（直径90mm），在培养皿中厚度大约4mm左右。
将平皿叠放在无菌操作台上，放置10min左右，待琼脂基本凝固可涂平板。
6）若平板不直接使用，灭菌后将培养基在锥形瓶中保存，待需制备平板时，微波炉中火加热约3min，使琼脂熔化，室温冷却20min至不烫手可制备平板。
四、接种大肠杆菌1）取实验室储备的大肠杆菌BL21冻存液，管口用酒精灯灼烧，打开离心管。
2）接种方法一：用灭菌枪头蘸取冻存液在平板边缘上划横条，每三道为一组，旋转平皿一圈，最后中间划之字；接种方法二：用移液枪吸取100uL溶液于平板上，用酒精灯灭菌厚的涂抹棒划十字，涂布平板。
大肠杆菌的培养
特殊营养物质
混合显色剂
琼脂
pH±25℃
此配方可以进行改良或增加营养成份以获得最佳的结果。
注意
此培养基仅供实验室使用。
用法
称取本品加入1000ml蒸馏水，加热溶解并不停搅拌，煮沸不要超过1分钟。取1ml制备好的样品液加入直径为9cm无菌平皿中心，倾入冷却至45-50℃培养基约15ml，混匀，凝固后，再加入一层培养基进行履盖。或冷却至45-50℃时，倾入无菌平皿，琼脂完全凝固后，在37℃的培养箱中倒置放置1-2小时，加入适当稀释度的样品液1ml，涂布于培养基上，36±1℃培养18～24h。
典型特征
大肠杆菌典型菌落为蓝色至紫色，大肠菌群为粉红色菌落，其它细菌为无色菌落。
大肠杆菌的培养：
37摄氏度，恒温培养48到72小时，因为接种时和具体培养条件的不同，其生长一般都在2天外才能长出明显的菌落。
菌落特征：乳白色，圆形，菌落边缘整齐，表面光滑，表面和背面颜色一致。
大肠杆菌/大肠菌群显色培养基是青岛海博生物公司改良的培养基，用于食品、水、牛奶、冰激凌和肉制品中大肠杆菌和大肠菌群的快速检测。大肠杆菌显蓝色至紫色，大肠菌群显红色。
总大肠菌群=蓝色菌落+紫色菌落+粉红色菌落
大肠杆菌=蓝色菌落+紫色菌落
4、对可疑大肠杆菌菌落可划线接种到营养琼脂平板上，36±1℃培养12-16小时，挑取单菌落做大肠杆菌全套生化试验(本公司有生化鉴定管套装20支x3种)
质量控制
1、外观
此干燥培养基的粉末均匀，具有良好的流动性，呈淡红色。制备好的平板呈透明粉红色固体培养基。
（5）包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、配制日期。
大肠杆菌培养教学课件ppt
将发酵罐放入恒温振荡器中培养，控制温度和湿度适宜，观察细菌的生长情况。
收获
当细菌生长到一定阶段时，进行收获，提取所需产物。
04
大肠杆菌培养过程中的问题与解决策略
杂菌污染及其防治
杂菌污染
大肠杆菌培养过程中经常出现 杂菌污染，导致培养失败。
污染来源
杂菌污染通常来自培养基、设 备、空气等。
防治策略
THANKS
感谢观看
肠道益生菌
大肠杆菌被认为是肠道益生菌之一，可促进肠道蠕动、增强免疫力、降低胆固醇等。
人类健康
大肠杆菌在肠道内的数量和种类对人类健康有着重要影响，可通过补充益生菌来维持肠道微生态平衡 。
06
大肠杆菌培养的教学实践建议
实验方案的设计与优化建议
确定实验目标
01
明确实验所要达到的目标，如分离、鉴定、纯化大肠杆菌等。
肠道微生物
大肠杆菌是肠道微生物群落中的一 种，对肠道健康和功能具有重要作 用。
促消化
大肠杆菌能够促进肠道蠕动和消化 ，有助于营养物质的吸收。
免疫刺激
大肠杆菌能够刺激肠道免疫系统的 发育和功能，增强机体对病原菌的 抵抗力。
生物拮抗
大肠杆菌具有生物拮抗作用，能够 抑制病原菌的生长和繁殖。
02
大肠杆菌培养的基本原理
将菌种接种到培养基中，放入恒温振荡器中 培养。
发酵罐的灭菌与清洗
准备所需材料
包括发酵罐、不锈钢筛网、清 洗剂等。
灭菌
将发酵罐用高压蒸汽灭菌法灭菌 ，确保无菌状态。
清洗
用清洗剂清洗发酵罐内外部，去除 污垢和残留物。
接种、发酵与收获
准备所需材料
包括发酵罐、接种器、恒温振荡器等。
大肠杆菌的培养方法
大肠杆菌的培养方法
大肠杆菌是一种常见的细菌，广泛存在于自然界中，也是一种重要的实验室模式生物。
在生物学、医学、食品工业等领域中，大肠杆菌的培养方法是非常重要的。
下面我们来了解一下大肠杆菌的培养方法。
1. 培养基的选择
大肠杆菌可以在多种培养基上生长，但最常用的是LB培养基。
LB 培养基是一种富含营养物质的培养基，可以提供大肠杆菌所需的所有营养物质。
此外，还有一些特殊的培养基，如M9培养基、TB培养基等，可以根据实验需要选择。
2. 培养条件的控制
大肠杆菌的生长需要一定的温度、pH值和氧气含量等条件。
一般来说，大肠杆菌的最适生长温度为37℃，pH值为7.0左右，需要充足的氧气供应。
因此，在培养大肠杆菌时，需要控制好这些条件，以保证细菌的正常生长。
3. 培养方法的选择
大肠杆菌的培养方法有液体培养和固体培养两种。
液体培养适用于大规模培养，可以在较短时间内获得大量的细菌。
固体培养适用于单个菌落的分离和纯化，可以使不同菌株之间不互相干扰，方便后
续的实验操作。
4. 培养时间的控制
大肠杆菌的生长速度较快，一般在液体培养中可以在12-16小时内达到对数生长期，而在固体培养中需要24-48小时。
因此，在培养大肠杆菌时，需要控制好培养时间，以避免过度生长或过早停止生长。
大肠杆菌的培养方法是实验室中非常重要的一部分。
通过选择合适的培养基、控制好培养条件和时间，可以获得高质量的大肠杆菌菌株，为后续的实验操作提供保障。
大肠杆菌如何培养
大肠杆菌如何培养
一、大肠杆菌如何培养1. 大肠杆菌如何培养2. 大肠杆菌的保存方法 3. 大肠杆菌菌种的复苏二、大肠杆菌对人体益处和危害三、什么是大肠杆菌
大肠杆菌如何培养
1、大肠杆菌如何培养1.1、称药品按实际用量计算后,按配方称取各种药品放入大烧杯中。
牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量,用热水溶解后倒入大烧杯;也可放在称量纸上称量,随后放入热水中,牛肉膏使与称量纸分离,立即取出纸片。
蛋白胨极易吸潮,故称量时要迅速。
1.2、加热溶解在烧杯中加入少于所需要的水量,然后放在石棉网上,小火加热,并用玻棒搅拌,待药品完全溶解后再补充水分至所需量。
若配制固体培养基,则将称好的琼脂放入己溶解的药品中,再加热融化,此过程中,需不断搅拌,以防琼脂糊底或溢出,最后补足所失的水分。
1.3、调pH 检测培养基的pH,若pH偏酸,可滴加lmol/L NaOH,边加边搅拌,并随时用pH试纸检测,直至达到所需pH范围。
若偏碱,则用lmol/L HCl进行调节。
pH的调节通常放在加琼脂之前。
应注意pH值不要调过头,以免回调而影响培养基内各离子的浓度。
1.4、过滤液体培养基可用滤纸过滤,固体培养基可用4层纱布趁热过滤,以利培养的观察。
但是供一般使用的培养基,这步可省略。
1.5、分装按实验要求,可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。
分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。
2、大肠杆菌的保存方法
2.1、常用的长期保存法有:液体石蜡法、硅胶保存法、加入甘油或二甲基亚砜(DMSD)等保护剂。
大肠杆菌培养基配制及培养方法
大肠杆菌培养一、菌种冻存液的制备含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40%甘油，-80o C冻存。
二、培养基制备LB培养基配方（胰化蛋白胨（Trypton）：10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5 g/L；NaCl：10 g/L；pH 7.4）液体培养基胰化蛋白胨 10.0g酵母粉 5.0g氯化钠 10.0g水 1000mlpH 7.4固体培养基在液体培养基的基础上再加入 1.5％－2.0％的琼脂三、平板的制备1）称取胰化蛋白胨10.0g，酵母粉 5.0g，NaCl 10.0g，加入800mL二次水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，用1mol/L的NaOH调pH至7.4左右，定容至1L，调pH 7.4（若溶液pH大于7.4，用1mol/L HCl回调）。
2）分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。
如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%的琼脂（150mL液体培养基加入 2.5g琼脂）。
3）在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。
所有锥形瓶如上述操作。
用记号笔注明培养基名称、配制日期。
4）高压蒸汽灭菌锅121 oC灭菌15min。
5）灭菌后的培养基取出置电热鼓风干燥器内60oC烘干，待锥形瓶的封口纸干燥后取出。
液体培养基可直接保存或使用，此时加有琼脂的培养基不会凝固，可在预先紫外杀菌30min以上的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿内，每个培养皿培养基约10-15mL（直径90mm），在培养皿中厚度大约4mm左右。
将平皿叠放在无菌操作台上，放置10min左右，待琼脂基本凝固可涂平板。
6）若平板不直接使用，灭菌后将培养基在锥形瓶中保存，待需制备平板时，微波炉中火加热约3min，使琼脂熔化，室温冷却20min至不烫手可制备平板。
四、接种大肠杆菌1）取实验室储备的大肠杆菌BL21冻存液，管口用酒精灯灼烧，打开离心管。
2）接种方法一：用灭菌枪头蘸取冻存液在平板边缘上划横条，每三道为一组，旋转平皿一圈，最后中间划之字；接种方法二：用移液枪吸取100uL溶液于平板上，用酒精灯灭菌厚的涂抹棒划十字，涂布平板。
大肠杆菌培养步骤方法
大肠杆菌培养步骤方法大肠杆菌是一种重要的细菌，它在实验室中被广泛用于分子生物学研究和基因工程。
下面是大肠杆菌的培养步骤方法，共50条，并展开详细描述：1. 准备所需的培养基及试剂，包括琼脂、培养基粉、蔗糖、牛肉膏、酵母提取物、氯化钠、磷酸二氢钾等。
2. 将琼脂及培养基粉加入适量蒸馏水中，搅拌均匀后加热至沸腾，然后灭菌。
3. 将灭菌后的琼脂培养基倒入培养皿中，使其凝固成固体琼脂。
4. 取出实验室保存的大肠杆菌菌种，用无菌吸管从存储容器中取出适量菌液。
5. 将菌液均匀地涂布在琼脂培养皿表面，待其吸收后轻轻晃动培养皿使其均匀分布。
6. 将涂布好的培养皿倒置放入孵化箱中，以37℃恒温孵育。
7. 每隔一段时间观察培养皿上的菌落形成情况，选择合适的菌落进行分离和培养。
8. 在培养过程中，注意观察是否有任何异常，如细菌变异、污染等情况。
9. 定期检查培养基的PH值和温度，保持在适宜的范围内。
10. 当需要保存大肠杆菌菌株时，可以将单一菌落悬浮在无菌离心管中，并添加10%甘油保藏在-80℃低温库中。
11. 每次操作前要做好无菌操作，以避免外源菌的污染。
12. 大肠杆菌培养时，应严格控制氧气供应，可以选择静态培养或者摇瓶培养。
13. 在摇瓶培养中，要保持培养液的充分通气，防止细菌缺氧而死亡。
14. 对于含氧厌恶的大肠杆菌菌株，可以选择在含葡萄糖并定期通氮气的缺氧箱中进行培养。
15. 大肠杆菌培养皿观察时，可使用显微镜进行观察，观察菌落形态、大小和颜色等特征。
16. 对于选择性培养基的应用，可以根据需要添加抗生素或者其他选择性物质来筛选感兴趣的菌株。
17. 在进行大肠杆菌培养时，要注意控制培养基的含盐量和碳源，以及其他微量元素的添加。
18. 可以通过PCR或者其他分子生物学方法快速鉴定大肠杆菌的种属和亚种属。
19. 在大肠杆菌的培养中，要注意排放生物危害废弃物，并采取相应的安全防护措施。
20. 大肠杆菌培养时，要做好相关记录，包括菌种信息、培养条件、观察结果等。
大肠杆菌一般培养方法
大肠杆菌一般培养方法大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道细菌，也是生物学研究中最常用的模式菌株之一、大肠杆菌具有广泛的分布范围，可以在许多环境中生存和繁殖。
本文将介绍大肠杆菌的一般培养方法。
一、培养基的制备大肠杆菌的培养基通常包括两个主要组分：固体培养基和液体培养基。
固体培养基用于菌落计数和细菌分离，并可用于培养单个菌落。
液体培养基则可用于扩大菌种和进行大规模的培养。
1.固体培养基的制备最常用的固体培养基为琼脂培养基。
制备过程如下：（1）称取所需琼脂，加入适量的蒸馏水中，进行均匀搅拌。
（2）加热至100摄氏度，溶解琼脂。
（3）煮沸1-2分钟，消毒琼脂。
（4）冷却至约50摄氏度。
（5）加入所需的培养基成分，如营养物质和抗生素等。
（6）倒入培养皿中，待凝固后即可使用。
2.液体培养基的制备最常用的液体培养基包括LB培养基（Lysogeny Broth）和TB培养基（Terrific Broth）。
制备过程如下：（1）称取所需培养基成分，加入适量蒸馏水中。
（2）加入琼脂和洗涤剂等成分，以调整液体的黏度和表面张力。
（3）调整pH值。
（4）加热并搅拌溶解，待溶解后冷却。
（5）过滤培养基，以去除不溶性杂质。
（6）分装到培养瓶中。
二、大肠杆菌的预培养将保存的大肠杆菌菌种(如冻存菌)挑取一高洁净的培养皿上贴菌，通常可采用菌板上交叉涂布法，用三角稀菌棒反复涂抹菌落。
之后用无菌瓷珠轻压菌落，使其均匀分散于培养皿上。
贴菌后将培养皿倒置，避免水分凝结在盖子上。
培养皿翻转的目的是避免水珠滴入培养基内，影响气体交换。
然后将培养皿放入培养箱中，37℃保温，24小时后进行预培养。
三、大肠杆菌的正式培养预培养后，取适量的大肠杆菌菌落液，加入培养基中，并进行摇床培养。
有时候，还需要在培养基中添加相应的抗生素，以筛选具有特定基因或表现的菌株。
培养条件一般为37摄氏度、摇床转速为200-250转/分钟。
培养时间根据需要和实验目的而定。
大肠杆菌的培养与分离
五、大肠杆菌分离后保存
1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成 后置于4℃冰箱保存。 2、长期保存：甘油冷冻管藏法
小结
1.如何操作才可以尽量避免被杂菌污染?
(1)胆大心细，操作快捷。（2）注意灭菌操作 原则，灭菌彻底，降低环境污染概率。（3） 注意微生物生长条件，如PH、渗透压、温度等。 细菌喜碱，喜蛋白质，喜37度；霉菌喜酸，喜 糖，喜25-30度
5.平板冷凝后，要将平板倒置,既可以使培养基表面的 水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养 基，造成污染.
三、大肠杆菌的扩大培养
将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的液体 培养基中,使其在37℃摇床培养12小时。
注意事项:
1.火焰旁从斜面上用接种环取菌;
2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧 灭菌,冷却后方能取菌; 3.取菌后封口膜和棉塞复原.
【课堂练习】 例1．关微生物营养物质的叙述中，正确的是（ D） A.是碳源的物质不可能同时是氮源
B.凡碳源都提供能量
C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量
例2防止杂菌污染
B.接种前菌种要进行灭菌
C.培养基和发酵设备都必须灭菌 D.灭菌必须在接种前
2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后 再进行划线？
答：以免接种环温度太高，杀死菌种。 3.在作第二次以及其后的划线操作时，为 什么总是从上一次划线的末端开始划线？ 答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起 始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能 使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少， 最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
FeSO4 CaCl2 H 2O
0.5g 0.5g 100ml
（3）若除去成分②，加入（CH2O）， 该培养基可用于培养 固氮微生物。 （4）表中营养成分共有 3 类。 （5）不论何种培养基，在各种成分都 溶化后分装前，要进行的是 调整pH 。 （6）右表中各成分重量确定的原则 是 依微生物的生长需要确定 。 （7）若右表培养基用于菌种鉴定，应 该增加的成分 琼脂（或凝固剂） 。
大肠杆菌培养生长条件
大肠杆菌培养生长条件大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的革兰氏阴性杆菌，广泛存在于自然环境中，也是人和动物肠道中的常见菌群之一。
大肠杆菌的培养生长条件对于研究其生物学特性以及应用于实验室工作至关重要。
本文将介绍大肠杆菌的培养生长条件。
1. 培养基选择：大肠杆菌的培养基种类繁多，常用的包括LB（Luria-Bertani）培养基、TB（Terrific Broth）培养基等。
LB培养基是最常用的培养基之一，其成分包括蛋白胨、酵母提取物和盐类等。
TB培养基则在LB培养基的基础上添加了葡萄糖、甘油和维生素等，可用于大规模培养。
2. 温度：大肠杆菌的适宜生长温度一般在37摄氏度左右。
在实验室中，常用恒温培养箱或恒温振荡培养箱来提供恒定的温度条件。
3. pH值：大肠杆菌的适宜生长pH范围为6.5-7.5。
因此，在培养大肠杆菌时，需要调整培养基的pH值，以提供适宜的生长环境。
4. 氧气需求：大肠杆菌是一种好氧菌，对氧气的需求较高。
因此，在培养大肠杆菌时，需要提供充足的氧气供应。
常用的培养方式包括摇床培养和搅拌培养，以增加培养液与空气的接触面积。
5. 培养时间：大肠杆菌的生长速度较快，通常在适宜的培养条件下，可以在12-16小时内达到对数生长期。
因此，在培养大肠杆菌时，需要控制培养时间，避免过度生长导致细菌密度过高。
6. 抗生素选择：在培养大肠杆菌时，常常需要添加适当的抗生素来选择性地抑制其他细菌的生长。
常用的抗生素包括氨苄青霉素（Ampicillin）、卡那霉素（Kanamycin）等。
总结起来，大肠杆菌的培养生长条件包括培养基选择、温度、pH值、氧气需求、培养时间和抗生素选择等。
合理调控这些条件可以为大肠杆菌的生长提供良好的环境，为后续的实验工作奠定基础。
在实验室中，科研人员需要根据具体实验目的和要求，选择合适的培养条件，以获得所需的大肠杆菌菌株。
通过不断优化培养条件，可以提高大肠杆菌的生长速度和产量，为相关研究和应用提供有力支持。
大肠杆菌培养基配制及培养方法
大肠杆菌培养一、菌种冻存液的制备含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40%甘油，-80o C冻存。
二、培养基制备LB培养基配方（胰化蛋白胨（Trypton）：10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5 g/L；NaCl：10 g/L；pH 7.4）液体培养基胰化蛋白胨 10.0g酵母粉 5.0g氯化钠 10.0g水 1000mlpH 7.4固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5％－2.0％的琼脂三、平板的制备1）称取胰化蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，加入800mL二次水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，用1mol/L的NaOH调pH至7.4左右，定容至1L，调pH 7.4（若溶液pH大于7.4，用1mol/L HCl回调）。
2）分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。
如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%的琼脂（150mL液体培养基加入2.5g琼脂）。
3）在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。
所有锥形瓶如上述操作。
用记号笔注明培养基名称、配制日期。
4）高压蒸汽灭菌锅121 oC灭菌15min。
5）灭菌后的培养基取出置电热鼓风干燥器内60oC烘干，待锥形瓶的封口纸干燥后取出。
液体培养基可直接保存或使用，此时加有琼脂的培养基不会凝固，可在预先紫外杀菌30min以上的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿内，每个培养皿培养基约10-15mL（直径90mm），在培养皿中厚度大约4mm左右。
将平皿叠放在无菌操作台上，放置10min左右，待琼脂基本凝固可涂平板。
6）若平板不直接使用，灭菌后将培养基在锥形瓶中保存，待需制备平板时，微波炉中火加热约3min，使琼脂熔化，室温冷却20min至不烫手可制备平板。
四、接种大肠杆菌1）取实验室储备的大肠杆菌BL21冻存液，管口用酒精灯灼烧，打开离心管。
2）接种方法一：用灭菌枪头蘸取冻存液在平板边缘上划横条，每三道为一组，旋转平皿一圈，最后中间划之字；接种方法二：用移液枪吸取100uL溶液于平板上，用酒精灯灭菌厚的涂抹棒划十字，涂布平板。
大肠杆菌培养方法
大肠菌群测定的操作细则大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。
1 设备和材料1.1 温箱：36±1℃。
1.2 冰箱:0～4℃。
1.3 恒温水浴:44.5±0.5℃。
1.4 天平。
1.5 显微镜。
1.6 均质器或乳钵。
1.7 平皿:直径为90mm。
1.8 试管。
1.9 吸管。
1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。
1.11 玻璃珠:直径约5mm。
1.12 载玻片。
1.13 酒精灯。
1.14 试管架。
2 培养基和试剂2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。
2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。
2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。
2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。
2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中3.22规定。
2.6 生理盐水。
2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。
3 操作步骤3.1 检样稀释3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。
固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。
3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。
3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。
3.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。
大肠杆菌的培养
大肠杆菌种子液的制备牛肉膏蛋白胨培养基的配方：液体培养基牛肉膏 3.0g蛋白胨10.0g氯化钠 5.0g水1000mlpH 7.4-7.6固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5％－2.0％的琼脂1 试管斜面与平板的制备（1）称量按培养基配方比例依次准确称取蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂、水放入烧杯中。
（2）熔化在上述烧杯中先加入少于所需要量的水，用玻璃棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，药品完全溶解后，补充水到所需的总体积。
将称量好的 1.8％琼脂放入已溶的药品中，再加热熔化，最后补充所损失的水分。
（3）调PH 在未调PH前，先用精密PH试纸测量培养基的原始PH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH,边加边搅拌，并随时用PH试纸测基PH直到PH达到7.4-7.6。
反之用1mol/L HCl进行调节。
（4）分装将培养基分装入三个试管中和三角烧瓶中。
其试管装量不超过管高的1/5，三角烧瓶的量不超过1/2加塞培养基分装完毕后，在试管口和三角烧瓶口上塞上棉塞。
（5）包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，其外再用一道麻绳扎好。
用记号笔注明培养基名称、配制日期。
（6）灭菌将上述培养基以0.1Mpa,121℃,15min高压蒸气灭菌。
（7）倒平板，取三个已消毒的培养皿，在无菌操作台上用三角烧瓶中的培养基倒制三个平板培养基，冷却。
（8）搁置斜面将灭菌的试管培养基冷却至50℃左右，将试管口端搁在玻璃棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。
2 接种大肠杆菌斜面种子(1) 取实验室储备的大肠杆菌BL21种子，在酒精灯附近，用接种环在已制备好的斜面上接种上大肠杆菌。
(2) 将接种好的斜面放入37℃的恒温培养箱子中培养24h。
3 制备平板种子(1) 在无菌条件下，取一支保存的大肠杆菌的斜面，用无菌生理盐水将菌种冲洗下来，再用无菌生理盐水将其梯度稀释为1倍，10倍，100倍和1000倍，用移液枪分别吸取各梯度的溶液涂布平板(每个梯度涂布三个平板，每次吸取溶液100ul)，然后在37℃培养箱中过夜。
大肠杆菌的测定方法
大肠杆菌的测定方法
致病性大肠杆菌是病原体，它的筛选、鉴定以及测定是病原微生物的重要步骤。
本文将介绍大肠杆菌测定的一般方法，其中包括细菌的培养、鉴定与测定流程。
一、细菌培养
大肠杆菌的培养，首先要选择利于细菌生长的培养基，培养基需要含有必须的养分和活性，具有适宜的pH值，用于维持细菌的生长。
常用的培养基包括牛油硫磺琼脂（MacConkey）、牛油硫磺琼脂（SS agar）、牛油硫磺琼脂棕榈酸（MSA）、牛油硫磺琼脂乳酸（MSL）以及甲氧苄啶琼脂（MMB）等。
培养的大肠杆菌会产生具有细胞膜抗原特性的抗原。
细胞膜抗原可以形成抗原抗体复合物，从而产生免疫反应。
将样本装置在具有合理浓度的抗原抗体复合液中，将有助于调节抗体与抗原的反应，使抗体与抗原之间形成稳定的结合，增强抗体的特异性，同时也可以提高测定的准确性，提高测试的灵敏度。
二、细菌鉴定
通过培养可以初步判断大肠杆菌的类型，但要确定其种类，可以采用血凝试验（血清凝集），该试验可用于识别各种凝集素。
另外，培养过程中产生的生化特性也可以帮助在识别大肠杆菌中发挥作用。
实验一 大肠杆菌的培养和分离
细菌培养基需求中性偏碱，霉菌培养基需求中性偏酸。
LB液体培养基：
细菌在液体培养基中 扩大培养
LB固体培养基
倒入平板，用 于分离细菌
制成斜面，用于保存 细菌
（三)细菌的分离
划线分离
操作简单
涂布分离
单菌落更易分开
操作复杂
（三）无菌技术
泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。 1、消毒： 是指杀灭大部分病原微生物的方法。 常用消毒方法： （1）100℃煮沸5-6min （2）巴氏消毒法：70-75 ℃下煮30min或 80 ℃ 下煮15min （3）用75%酒精等进行皮肤消毒 （4）紫外线消毒
进行操作时，注意瓶口、壁上等不能沾有培养基，否则易发生污染。
大肠杆菌的培养和分离实验操作步骤
• 实验器材
培养基（微生物生存的环境和营养物质）
LB液体培养基 大肠杆菌菌种斜面 空白斜面
（一）培养基的制备与灭菌
取两个250ml的三角瓶，分别装入50ml LB液体培养基和50ml LB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜，用牛皮 纸包装后放入灭菌锅内，1kg压力灭菌15min。
（2） 划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端 开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个 细菌繁殖而来的菌落。
（3）为什么每次划线之前都要灼烧接种环？
每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留 的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的 末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减 少，以便得到单菌落。
即时反馈
课堂小结与作业布置
大肠杆菌培养基配制及培养方法
大肠杆菌培养一、菌种冻存液的制备含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40%甘油，-80o C冻存。
二、培养基制备LB培养基配方（胰化蛋白胨（Trypton）：10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5 g/L；NaCl：10 g/L；pH 7.4）液体培养基胰化蛋白胨 10.0g酵母粉 5.0g氯化钠 10.0g水 1000mlpH 7.4固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5％－2.0％的琼脂三、平板的制备1）称取胰化蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，加入800mL二次水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，用1mol/L的NaOH调pH至7.4左右，定容至1L，调pH 7.4（若溶液pH大于7.4，用1mol/L HCl回调）。
2）分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。
如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%的琼脂（150mL液体培养基加入2.5g琼脂）。
3）在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。
所有锥形瓶如上述操作。
用记号笔注明培养基名称、配制日期。
4）高压蒸汽灭菌锅121 oC灭菌15min。
5）灭菌后的培养基取出置电热鼓风干燥器内60oC烘干，待锥形瓶的封口纸干燥后取出。
液体培养基可直接保存或使用，此时加有琼脂的培养基不会凝固，可在预先紫外杀菌30min以上的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿内，每个培养皿培养基约10-15mL（直径90mm），在培养皿中厚度大约4mm左右。
将平皿叠放在无菌操作台上，放置10min左右，待琼脂基本凝固可涂平板。
6）若平板不直接使用，灭菌后将培养基在锥形瓶中保存，待需制备平板时，微波炉中火加热约3min，使琼脂熔化，室温冷却20min至不烫手可制备平板。
四、接种大肠杆菌1）取实验室储备的大肠杆菌BL21冻存液，管口用酒精灯灼烧，打开离心管。
2）接种方法一：用灭菌枪头蘸取冻存液在平板边缘上划横条，每三道为一组，旋转平皿一圈，最后中间划之字；接种方法二：用移液枪吸取100uL溶液于平板上，用酒精灯灭菌厚的涂抹棒划十字，涂布平板。
大肠杆菌的保存和培养
大肠杆菌的保存和培养1菌种的保存菌种的保存通常采用甘油低温保存法1.1基本原理：在-70℃或液氮中冻存，细菌内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。
在0℃—-70℃温度范围内，水晶呈针状，极易招致细菌的严重损伤。
用电镜观察，可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔。
因此，为了避免0℃—-70℃冰晶的形成和细菌膜两侧离子平衡的破坏，需要加保护剂。
甘油可降低冰点，在缓慢的冻结条件下，能使细菌内水分在冻结前透出细菌外。
贮存在-70℃以下低温中能减少冰晶形成，甘油对细菌无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细菌。
1.2使用浓度范围为15%-50%，一般常用30%。
在保存瓶中按1：1加入60%的甘油和菌液，混匀后液氮速冻，然后放入-70度超低温冰箱贮存。
2菌种的复苏复苏菌种时，用接种环或牙签挑取少许冻结的菌种到平皿上，37℃培养8-12小时即可。
甘油菌从冰箱取出使用时应置于低温或0℃冰浴中，用完尽快放回，接种时挑取表面已融化部分即可，不可全溶，因反复冻融会导致细胞壁破裂。
切记：接种过程中不得使保存瓶中的菌液融化。
3大肠杆菌培养3.1培养基配制：培养基从形态上分为液体与固体培养基。
根据有无抗生素和其他选择性药物分为普通与选择培养基，常用LB培养基。
3.1.1 LB（Luria-Bertain)液体培养基配制蛋白胨 1.0%酵母提取物0.5%氯化钠 1.0%称重后搅拌使之完全溶解，用5M NaOH调pH至7.0，高压灭菌20min。
3.1.2含琼脂的固体培养基配制（1）普通培养基:固体培养基是在液体培养基中加 1.5%琼脂制成，先配液体培养基，然后加入 1.5%琼脂，高压灭菌20min，取出后再无菌状态下铺平板（2）选择性培养基:将消毒好的固体培养基置室温下冷却50℃时加抗生素，摇匀后倒入灭菌皿中厚度2-3mm, 室温固化。
(抗生素用三蒸水溶解后，用无菌滤头过滤到无菌瓶中, 氨苄青霉素终浓度50μl/ml)。
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4 、对可疑大肠杆菌菌落可划线接种到营养琼脂平板上， 36 ± 1 ℃培养 12-16 小时，挑取单菌落做大肠杆菌全套生化试验 ( 本公司有生化鉴定管套装 20 支 x3 种 )
质量控制
1 、外观
此干燥培养基的粉末均匀，具有良好的流动性，呈淡红色。制备好的平板呈透明粉红色固体培养基。
贮存
制备好的平板应立即使用，应避免光线直接照射。干燥培养基应放置于阴暗干燥处， 保存温度 2-8 ℃，注意避光保存。
失效
干燥培养基超过保质期、结块和颜色变化都不能使用。
操作步骤
1 、按国家标准、 SN 标准、 FDA 标准或其它方法制备样品液
2 、取样品液 1ml 加入 冷却至 45-50 ℃显色培养基中混匀或 涂布于平板上
2.加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量,然后放在石棉网上,小火加热,并用玻棒搅拌,待药品完全溶解后再补充水分至所需量.若配制固体培养基,则将称好的琼脂放入己溶解的药品中,再加热融化,此过程中,需不断搅拌,以防琼脂糊底或溢出,最后补足所失的水分.
3. 调pH 检测培养基的pH,若pH偏酸,可滴加lmol/L NaOH,边加边搅拌,并随时用pH试纸检测,直至达到所需pH范围.若偏碱,则用lmol/L HCl进行调节.pH的调节通常放在加琼脂之前.应注意pH值不要调过头,以免回调而影响培养基内各离子的浓度.
3 、 36 ± 1 ℃培养 18 ～ 24h ，选用有 30 ～ 200 个菌落的平板，计数平板上出现的典型大肠菌群和大肠杆菌菌落。大肠杆菌典型菌落为蓝色至紫色，大肠菌群为粉红色菌落，其它细菌为无色或黄色菌落。
总大肠菌群 = 蓝色菌落 + 紫色菌落 + 粉红色菌落
大肠杆菌 = 蓝色菌落 + 紫色菌落
此配方可以进行改良或增加营养成份以获得最佳的结果。
注意
此培养基仅供实验室使用。
用法
称取本品 41.5g 加入 1000ml 蒸馏水，加热溶解并不停搅拌，煮沸不要超过 1 分钟。取 1ml 制备好的样品液加入直径为 9cm 无菌平皿中心，倾入冷却至 45-50 ℃培养基约 15ml ，混匀，凝固后，再加入一层培养基进行履盖。或冷却至 45-50 ℃时，倾入无菌平皿，琼脂完全凝固后，在 37 ℃的培养箱中倒置放置 1-2 小时，加入适当稀释度的样品液 1ml ，涂布于培养基上， 36 ± 1 ℃培养 18 ～ 24h 。
大肠杆菌培养方法
双击自动滚屏 发布者：admin 发布时间：2009-10-6 19:13:38 阅读：3247次
使用牛肉膏蛋白胨培养基
组成成分：牛肉膏 3g,蛋白胨 10g,Nacl 5g,琼脂 15～20g,水1000mL,PH7.4～7.6。
具体配置步骤：
1.称药品 按实际用量计算后,按配方称取各种药品放入大烧杯中.牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量,用热水溶解后倒入大烧杯;也可放在称量纸上称量,随后放入热水中,牛肉膏使与称量纸分离,立即取出纸片.蛋白胨极易吸潮,故称量时要迅速.
2 、微生
质控菌株
ATCC
生长情况
菌落颜色
单增李氏菌
27853
-/+
无色
金黄色葡萄球菌
25923
-/+
无色
大肠杆菌
25922
+++
蓝色
4.过滤 液体培养基可用滤纸过滤,固体培养基可用4层纱布趁热过滤,以利培养的观察.但是供一般使用的培养基,这步可省略.
5.分装 按实验要求,可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内.分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染.
分装量:固体培养基约为试管高度的l/5,灭菌后制成斜面.分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜.半固体培养基以试管高度的1/3为宜,灭菌后垂直待凝.
沙门氏菌
+++
无色
大肠菌群
+++
粉红色
方法的局限性
本培养基鉴定 大肠菌群 / 大肠杆菌，少数情况下可能会出现假阳性，但不会出现假阴性，有时可能需做其它补充试验。
典型特征
大肠杆菌典型菌落为蓝色至紫色，大肠菌群为粉红色菌落，其它细菌为无色菌落。
大肠杆菌 / 大肠菌群显色培养基是青岛海博生物公司改良的培养基，用于食品、水、牛奶、冰激凌和肉制品中大肠杆菌和大肠菌群的快速检测。大肠杆菌显蓝色至紫色，大肠菌群显红色。
成份 (g/L)
特殊营养物质
28.19
混合显色剂
0.31
琼脂
13.0
pH 6.8 ± 0.2 25 ℃
6.加棉塞 试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞.棉塞的形状,大小和松紧度要合适,四周紧贴管壁,不留缝隙,才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用.要使棉塞总长约3/5塞入试管口或瓶口内,以防棉塞脱落.有些微生物需要更好的通气,则可用8层纱布制成通气塞.有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞.
9.无菌检查 将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24～48h,无菌生长即可使用,或贮存于冰箱或清洁的橱内,备用.
大肠杆菌的培养：
37摄氏度，恒温培养48到72小时，因为接种时和具体培养条件的不同，其生长一般都在2天外才能长出明显的菌落。
菌落特征：乳白色，圆形，菌落边缘整齐，表面光滑，表面和背面颜色一致。
7.包扎 加塞后,将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸,以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞.若培养基分装于试管中,则应以5支或7支在一起,再于棉塞外包一层牛皮纸,用绳扎好.然后用记号笔注明,培养基名称,组别,日期.
8.灭菌 将上述培养基于121.3℃湿热灭菌20min.如因特殊情况不能及时灭菌,则应故人冰箱内暂存.