大肠杆菌的保存与培养
大肠杆菌培养基配制及培养方法
大肠杆菌培养一、菌种冻存液的制备含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40％甘油，—80o C冻存。
二、培养基制备LB培养基配方（胰化蛋白胨（Trypton）:10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5g/L；NaCl：10g/L；pH7.4）液体培养基胰化蛋白胨 10。
0g酵母粉 5。
0g氯化钠10。
0g水 1000mlpH 7。
4固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5%－2。
0％的琼脂三、平板的制备1）称取胰化蛋白胨10。
0g，酵母粉5。
0g，NaCl 10.0g,加入800mL二次水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，用1mol/L的NaOH调pH至7。
4左右，定容至1L，调pH 7.4（若溶液pH大于7。
4，用1mol/L HCl回调）.2）分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。
如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%的琼脂（150mL液体培养基加入2.5g琼脂)。
3）在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。
所有锥形瓶如上述操作。
用记号笔注明培养基名称、配制日期。
4）高压蒸汽灭菌锅121 oC灭菌15min。
5）灭菌后的培养基取出置电热鼓风干燥器内60oC烘干,待锥形瓶的封口纸干燥后取出.液体培养基可直接保存或使用，此时加有琼脂的培养基不会凝固，可在预先紫外杀菌30min以上的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿内，每个培养皿培养基约10—15mL（直径90mm),在培养皿中厚度大约4mm左右。
将平皿叠放在无菌操作台上,放置10min左右，待琼脂基本凝固可涂平板。
6）若平板不直接使用，灭菌后将培养基在锥形瓶中保存，待需制备平板时，微波炉中火加热约3min，使琼脂熔化，室温冷却20min至不烫手可制备平板。
四、接种大肠杆菌1）取实验室储备的大肠杆菌BL21冻存液，管口用酒精灯灼烧，打开离心管。
2）接种方法一：用灭菌枪头蘸取冻存液在平板边缘上划横条，每三道为一组，旋转平皿一圈,最后中间划之字;接种方法二：用移液枪吸取100uL溶液于平板上,用酒精灯灭菌厚的涂抹棒划十字,涂布平板。
实验一大肠杆菌的分离和培养
细菌
2.微生物涉及五类 放线菌
真菌
原生动物
(二)培养基
• 1.分类(按物理形态分) • (1)液体培养基 • (2)固体培养基
①常用旳固体培养基: 琼脂固体培养基.
②微生物在固体培养基 表面生长,能够形成 肉眼可见旳菌落.
2.培养基内所含旳基本物质
• (1)水 • (2)碳源 • (3)氮源 • (4)无机盐
a.灼烧灭菌
注意合用范围
微生物旳接种工具 (接 种环、接种针)或其 他金属用具直接在火 焰旳充分燃烧层灼烧
b. 干热灭菌 160－170℃ ；1－2h
能耐高温旳需要保持干 燥旳物品( 玻璃器皿)
c.高压蒸汽灭菌 100kPa 121℃ 15-30min
一般用于培养基旳灭菌
二、试验操作 • （一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
• 计算－称量－溶化－灭菌－倒平板
• （二）分离纯化大肠杆菌
• 接种措施有：
• 划种未接 种旳培养基放入37℃恒温箱中培养12h 和24h后，观察并统计
三、课题延伸：菌种旳保藏
• 1、斜面保藏 • （临时保存） • 2、甘油保藏
（长久保 存）
试验1：大肠杆菌旳培养和分离
角烧瓶旳液体培养基中，三角烧瓶在37℃摇床振荡培养 12h。 • (4) 划线分离：将摇床上培养12h旳菌液在固体培养基旳 平板上连续划线，然后将盖好旳培养皿倒置，放在37℃ 恒温培养箱中进行培养。 • (5)单菌落接种培养：在无菌操作下将单菌落用接种环取 出，再用划线法接种在空白斜面上，在37℃下培养24h, 4℃冰箱保存。
设备及用具：
灭菌锅或高压锅、250ml旳三角瓶、封口膜和橡皮圈、 直径90mm旳培养皿、接种环和玻璃三角刮刀、恒温培 养箱、摇床、酒精灯和超净台、一次性塑料手套、装有 酒精棉球旳广口瓶、镊子、有棉塞旳试管 （15mm×120mm）5支
大肠杆菌如何培养
大肠杆菌如何培养
一、大肠杆菌如何培养1. 大肠杆菌如何培养2. 大肠杆菌的保存方法 3. 大肠杆菌菌种的复苏二、大肠杆菌对人体益处和危害三、什么是大肠杆菌
大肠杆菌如何培养
1、大肠杆菌如何培养1.1、称药品按实际用量计算后,按配方称取各种药品放入大烧杯中。
牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量,用热水溶解后倒入大烧杯;也可放在称量纸上称量,随后放入热水中,牛肉膏使与称量纸分离,立即取出纸片。
蛋白胨极易吸潮,故称量时要迅速。
1.2、加热溶解在烧杯中加入少于所需要的水量,然后放在石棉网上,小火加热,并用玻棒搅拌,待药品完全溶解后再补充水分至所需量。
若配制固体培养基,则将称好的琼脂放入己溶解的药品中,再加热融化,此过程中,需不断搅拌,以防琼脂糊底或溢出,最后补足所失的水分。
1.3、调pH 检测培养基的pH,若pH偏酸,可滴加lmol/L NaOH,边加边搅拌,并随时用pH试纸检测,直至达到所需pH范围。
若偏碱,则用lmol/L HCl进行调节。
pH的调节通常放在加琼脂之前。
应注意pH值不要调过头,以免回调而影响培养基内各离子的浓度。
1.4、过滤液体培养基可用滤纸过滤,固体培养基可用4层纱布趁热过滤,以利培养的观察。
但是供一般使用的培养基,这步可省略。
1.5、分装按实验要求,可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。
分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。
2、大肠杆菌的保存方法
2.1、常用的长期保存法有:液体石蜡法、硅胶保存法、加入甘油或二甲基亚砜(DMSD)等保护剂。
大肠杆菌实验总结
分离划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。
涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。
（一）制备LB培养基（通用的细菌培养基）1、配方：蛋白胨10.0克，牛肉膏5.0g，氯化钠10.0克，水1000ml（配固体培养基再加琼脂20克）2、流程计算称量溶解调pH分装加塞，包扎灭菌倒平板培养基配制(特)培养基应现配现用，每次配置350ml，一次性使用完毕。
1、按下表称取物资配置LB培养基到500ml锥形瓶中：2、用双层铝箔和棉绳对锥形瓶进行封口，摇晃锥形瓶以使各物质迅速、均匀、完全、溶解。
待灭菌。
①分装：注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，因此在将培养基转移到三角瓶或试管中时必须用___三角漏斗 _。
②加塞：试管用塑料盖或__棉花塞___；三角瓶口用_封口膜__或_6层纱布封口,再用__牛皮纸__或报纸封口。
③包扎：用_牛皮纸__或报纸④灭菌：高压蒸气灭菌法 1）加水：向外层锅内加入适量的水，加水的要求是不触及内胆 _.2）装锅：物品放置的要求__整齐、稳定、留出空隙：加盖：将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的_排气槽__内。
再以__两两对称方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。
3）加热排气：打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。
待冷空气完全排尽后，关上排气阀。
4）保温保压：当锅内压力升到1_kg/cm2时，控制热源，维持压力至15 _min。
5）出锅：切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力降至_0_时，打开_排气阀__，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。
否则会因锅内压力较高，打开气阀后造成的压力差可能使容器内的培养基喷溅造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至使容器爆炸。
灭菌后，通常将实验用具放入60℃~80 ℃_烘箱中烘干，以除去灭菌时的水分，避免引起_污染_。
⑤倒平板、制斜面操作平台：超净台灭菌好的培养基和实验器具置于超净台上打开__紫外线 _和_过滤风，灭菌30min.倒平板：待培养基冷却至__60_ ℃时，将每只培养皿倒入_10~12_ml未凝固的固体培养基，置于_水平_位置上，轻轻晃动使其均匀铺满平皿底部，待凝，使之形成平面。
大肠杆菌培养步骤方法
大肠杆菌培养步骤方法大肠杆菌是一种重要的细菌，它在实验室中被广泛用于分子生物学研究和基因工程。
下面是大肠杆菌的培养步骤方法，共50条，并展开详细描述：1. 准备所需的培养基及试剂，包括琼脂、培养基粉、蔗糖、牛肉膏、酵母提取物、氯化钠、磷酸二氢钾等。
2. 将琼脂及培养基粉加入适量蒸馏水中，搅拌均匀后加热至沸腾，然后灭菌。
3. 将灭菌后的琼脂培养基倒入培养皿中，使其凝固成固体琼脂。
4. 取出实验室保存的大肠杆菌菌种，用无菌吸管从存储容器中取出适量菌液。
5. 将菌液均匀地涂布在琼脂培养皿表面，待其吸收后轻轻晃动培养皿使其均匀分布。
6. 将涂布好的培养皿倒置放入孵化箱中，以37℃恒温孵育。
7. 每隔一段时间观察培养皿上的菌落形成情况，选择合适的菌落进行分离和培养。
8. 在培养过程中，注意观察是否有任何异常，如细菌变异、污染等情况。
9. 定期检查培养基的PH值和温度，保持在适宜的范围内。
10. 当需要保存大肠杆菌菌株时，可以将单一菌落悬浮在无菌离心管中，并添加10%甘油保藏在-80℃低温库中。
11. 每次操作前要做好无菌操作，以避免外源菌的污染。
12. 大肠杆菌培养时，应严格控制氧气供应，可以选择静态培养或者摇瓶培养。
13. 在摇瓶培养中，要保持培养液的充分通气，防止细菌缺氧而死亡。
14. 对于含氧厌恶的大肠杆菌菌株，可以选择在含葡萄糖并定期通氮气的缺氧箱中进行培养。
15. 大肠杆菌培养皿观察时，可使用显微镜进行观察，观察菌落形态、大小和颜色等特征。
16. 对于选择性培养基的应用，可以根据需要添加抗生素或者其他选择性物质来筛选感兴趣的菌株。
17. 在进行大肠杆菌培养时，要注意控制培养基的含盐量和碳源，以及其他微量元素的添加。
18. 可以通过PCR或者其他分子生物学方法快速鉴定大肠杆菌的种属和亚种属。
19. 在大肠杆菌的培养中，要注意排放生物危害废弃物，并采取相应的安全防护措施。
20. 大肠杆菌培养时，要做好相关记录，包括菌种信息、培养条件、观察结果等。
大肠杆菌-中国典型培养物保藏中心
中国典型培养物保存中心China Center for Type Culture Collection (CCTCC)大肠杆菌Escherichia coli CCTCC AB 93154实验步骤：1、将实验菌种在5ml NA液体培养基中活化，活化的菌种接种于100ml NA 液体培养基中，37℃摇床中培养，接种后立即取0.1ml测量OD值，后连续22h 取菌液测其OD值，并绘制实验菌株的生长曲线。
2、将实验菌株细菌在NA斜面置于37℃培养，斜面生长至12h时，取菌进行革兰氏染色，油镜镜检。
斜面继续培养至16h时，同样，取菌镜检。
3、将菌种接种到生理生化检测培养基中，37℃培养48h。
检测菌种生理生化特性。
实验结果：1.生长曲线图1. 细菌在约11h左右，增长速率最高。
15h左右进入对数生长后期。
根据实验操作方便取12h和16h两个时间点观察。
2.显微观察(a) (b)图2. 对比细菌在12h和16h时的革兰氏染色(1000×)：(a)大肠杆菌12h；(b)大肠杆菌16h。
3.甲基红实验（37℃培养48h）图3. A 大肠杆菌加甲基红试剂前B 大肠杆菌加甲基红试剂后（阳性） C产气肠杆菌加甲基红试剂前D产气肠杆菌加甲基红试剂后（阴性）结果说明：培养基变为红色为阳性图4. A 大肠杆菌（阳性）B 产气肠杆菌（阴性）结果说明：有红色环状物为阳性。
5.柠檬酸盐实验（37℃培养48h）图5. A 未接菌空白B 大肠杆菌C 产气肠杆菌结果说明：黄色说明培养基变为酸性，蓝色说明培养基变为碱性。
图6. A 大肠杆菌（阳性）B 产气肠杆菌（阴性）结果说明：培养物为红色者为阳性。
7.硫化氢实验（37℃培养48h）图7. A 大肠杆菌（弱阳性）B 产气肠杆菌（阳性）结果说明：阳性有黑色硫化铅产生。
a.葡萄糖发酵试验图8. A空白对照B大肠杆菌（阳性）C变形杆菌（阳性）b.乳糖发酵试验图9. A空白对照B大肠杆菌（阳性）C变形杆菌（阴性）c.蔗糖发酵试验图10. A空白对照B大肠杆菌（阴性）C变形杆菌（阴性）教学建议：最佳接种时间：建议前一天17:00接种，方便第二天9:00实验课。
实验1 大肠杆菌的培养和分离
（2）具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌是理想的酒精发酵菌种，对野生酵母菌进行 诱变后通过筛选可以得到具有这些特性的突变菌，诱变及筛选过程如下：
步骤1：野生菌液体培养一段时间后接受紫外线照射诱变处理。 步骤2:制备选择培养基。在基本培养基的基础上，注意＿和 ＿，加琼脂后灭菌，制成
本图来自十一学校
二、实验流程 配制培养基
包器材
灭菌
倒平板(或斜面)
接种扩大培养 分离
单菌落培养
接种保存
细菌的分离方法
1.种类: 划线分离法和涂布分离法。 划线分离法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操 作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面. 划线时不能划破培养基
2.作用: 是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表 达量菌株的最简便方法之一。
实验一
大肠杆菌的培养和分离
微生物
定义:结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有 细胞结构的低等生物，包括病毒、原核生物、原生 生物和某些真菌。
曲霉
酵
母
菌
草履虫
细菌：是单细胞的原核生物。 结构组成：细胞壁（肽聚糖）、细胞膜、细胞质，拟核 分裂方式：二分裂
菌落：由单个细菌（或其他微生物）在适宜固体培养 基表面或内部生长繁殖到一定程度；形成肉眼可见有 一定形态结构等特征的子细胞的群落。
为什么要倒置培养？
培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，正放培养 皿会使水蒸气凝结成水滴后，落入培养基的表面并 且扩散，菌落中的细菌也会随水扩散，菌落间相互 影响，很难再分成单菌落，达不到分离的目的。
1.下面两图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接 种后培养的效果图解，请分析接种的具体方法。
大肠杆菌一般培养方法
大肠杆菌一般培养方法大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道细菌，也是生物学研究中最常用的模式菌株之一、大肠杆菌具有广泛的分布范围，可以在许多环境中生存和繁殖。
本文将介绍大肠杆菌的一般培养方法。
一、培养基的制备大肠杆菌的培养基通常包括两个主要组分：固体培养基和液体培养基。
固体培养基用于菌落计数和细菌分离，并可用于培养单个菌落。
液体培养基则可用于扩大菌种和进行大规模的培养。
1.固体培养基的制备最常用的固体培养基为琼脂培养基。
制备过程如下：（1）称取所需琼脂，加入适量的蒸馏水中，进行均匀搅拌。
（2）加热至100摄氏度，溶解琼脂。
（3）煮沸1-2分钟，消毒琼脂。
（4）冷却至约50摄氏度。
（5）加入所需的培养基成分，如营养物质和抗生素等。
（6）倒入培养皿中，待凝固后即可使用。
2.液体培养基的制备最常用的液体培养基包括LB培养基（Lysogeny Broth）和TB培养基（Terrific Broth）。
制备过程如下：（1）称取所需培养基成分，加入适量蒸馏水中。
（2）加入琼脂和洗涤剂等成分，以调整液体的黏度和表面张力。
（3）调整pH值。
（4）加热并搅拌溶解，待溶解后冷却。
（5）过滤培养基，以去除不溶性杂质。
（6）分装到培养瓶中。
二、大肠杆菌的预培养将保存的大肠杆菌菌种(如冻存菌)挑取一高洁净的培养皿上贴菌，通常可采用菌板上交叉涂布法，用三角稀菌棒反复涂抹菌落。
之后用无菌瓷珠轻压菌落，使其均匀分散于培养皿上。
贴菌后将培养皿倒置，避免水分凝结在盖子上。
培养皿翻转的目的是避免水珠滴入培养基内，影响气体交换。
然后将培养皿放入培养箱中，37℃保温，24小时后进行预培养。
三、大肠杆菌的正式培养预培养后，取适量的大肠杆菌菌落液，加入培养基中，并进行摇床培养。
有时候，还需要在培养基中添加相应的抗生素，以筛选具有特定基因或表现的菌株。
培养条件一般为37摄氏度、摇床转速为200-250转/分钟。
培养时间根据需要和实验目的而定。
实验1,大肠杆菌的培养和分离
实验1,大肠杆菌的培养和分离篇一：实验1 大肠杆菌的培养和分离实验教学提纲实验1 大肠杆菌的培养和分离教学提纲实验目的1. 进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。
2. 进行大肠杆菌的分离，用固体培养基进行细菌的划线培养。
3. 说明大肠杆菌的培养条件和操作要求的原理。
实验材料1. 配制LB液体培养基，蛋白胨0.5g，酵母提取液0.25g，氯化钠0.5g，加水50mL溶解。
2. 配制LB固体培养基，蛋白胨0.5g，酵母提取液0.25g，氯化钠0.5g，琼脂1g，加水50mL溶解（配制LB固体培养基是用来倒平板和倒试管斜面）。
实验步骤1. 培养基灭菌。
在两个150mL的三角瓶中分别装入50mL LB液体培养基和50mL LB 固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜(一种塑料薄膜，中间有小孔的滤膜。
既可以通气，又不使细菌进入。
)。
将培养皿用牛皮纸包好，放入高压灭菌锅中，1kg压力灭菌15min（有压力时开始计时）。
同时将需要灭菌使用的培养皿、试管、三角瓶等和所用器械（接种环、镊子等）等一块灭菌。
2. 倒平板，倒斜面。
灭菌后。
待高压锅压力与大气压相同时，打开锅盖，将有培养基的三角瓶、试管、培养皿等放在灭菌后的超净工作台上。
超净工作台操作：打超净工作台的紫外灯（注意：打开紫外灯后人必须离开），持续30min，关闭紫外灯，打开过滤风和白炽灯。
将有培养基的三角瓶和培养皿放在灭菌后的超净工作台上后，点燃酒精灯，用镊子夹出酒精棉球擦拭桌面，并用酒精棉球擦手。
待固体培养基冷却到60℃时（手放上还有些热的时候），在酒精灯火焰旁，以右手无名指及小指夹持含有固体培养基的三角瓶的封口膜，右手其他三个手指拿着三角瓶；左手拿着培养皿，并打开上盖的一边，将三角瓶的培养基约10～20mL倒入1 个培养皿中。
倒入后立即置于水平位置上，轻轻摇晃，使培养基铺满培养皿底，待凝，使之形成平面。
倒斜面（试管内空白斜面），用玻璃漏斗倒入试管内，每试管2mL。
大肠杆菌的保存与培养
一．菌种的保存重组DNA 分子(质粒、噬菌体、粘性质粒)必须导入宿主菌中，通过细菌培养来扩增所需的重组DNA。
通常采用宿主菌是大肠杆菌，根据不同载体需求，选用不同品系大肠杆菌1. 概述：大肠杆菌其它微生物一样，都具有稳定遗传性和变异性、遗传性，保证微生物本身特征的相对稳定，即无性繁殖过程中能够保持原有的性状，为菌种保藏提供了有利因此，而变异性，使微生物的性状在繁殖过程中出现某些改变，给菌种保藏带来了困难。
由于存在变异，即菌种常出现所谓的退化，主要指理想性状的丧失，从而导致发育缓慢，存活率和产质量降低等现象，菌种保藏工作就是使菌种的变异降低至最小水平，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、优良生产性能、形态特征以及不污染杂菌。
能够长期在研究上应用。
2. 微生物的变异速度，通常情况下，与其新陈代谢速度有关，微生物代谢活力旺盛，它的变异速度快，代谢活动微弱，变异速度就慢。
并且在多次的无性繁殖过程中可能会有突变的积累。
人们利用这一规律，可以创造各种条件，使微生物活动处于微弱活动或不活动状态，以减少变异的发生。
3. 菌种保藏的原理是：通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段，以达最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制细菌的生长和繁殖。
由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠状态，从而可以保藏较长时间。
要求保存的菌种在复苏后除保持以前的生活与繁殖能力、不发生形态特征、生理状态及遗传性状的改变外，还不允许污染任何杂菌。
此外，在保存前应确保菌种的单纯性，先分离单菌落后进行鉴定，然后再繁殖保存。
4. 常用的长期保存法有：液体石蜡法、硅胶保存法、加入甘油或二甲基亚砜（DMSD）等保护剂。
5. 甘油低温保存法(－70℃—－196℃)的特点i.甘油菌低温保存的基本原理是：在-70℃或液氮中冻存，细菌内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。
在0℃—-70℃温度范围内，水晶呈针状，极易招致细菌的严重损伤。
大肠杆菌的保存与培养
大肠杆菌的保存与培养大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道菌，在许多实验室中用作模型生物。
为了长期保存和使用大肠杆菌，需要进行保存和培养。
本文旨在介绍大肠杆菌的保存和培养方法。
大肠杆菌的保存方法冻存法冻存法是保存大肠杆菌最常用的方法之一。
它使用冻干法或液氮法将菌株保存在低温下，以避免菌株变异或污染。
冻干法冻干法是将菌株在液氮下冷冻后进行干燥。
这种方法需要使用冻干器。
冻干器通过减压将菌株冻干，并将其保存在低温下。
液氮法液氮法是将菌株在液氮中冷冻后进行保存。
菌株存储在液氮罐中，使用时取出并解冻。
非冷冻法非冷冻法也可以用于保存大肠杆菌，例如保存在琼脂板上或制备干粉剂。
不过，这些方法缺乏长期保存和使用的稳定性，更适合短期保存。
鉴定编码大肠杆菌可以根据不同的基因、菌株和形态进行分类。
为了便于记忆和识别，每个菌株都有一个独特的编码。
这些编码可以在数据库中查找，以便进行鉴定和分类。
大肠杆菌的培养方法培养基培养基是生长大肠杆菌的基本食物。
常用的培养基包括肉汤培养基、三蔗糖培养基和Luria Broth培养基。
这些培养基提供大量的营养物质和水分，以支持细菌的生长和繁殖。
培养条件大肠杆菌的生长需要适当的环境条件。
最适宜的温度为37°C，pH值为7.0到7.5。
此外，大肠杆菌需要氧气和适当的紫外线照射。
分离和纯化分离和纯化是从混合菌群中收集大肠杆菌的过程。
这些步骤有助于在单独的培养皿中产生纯种大肠杆菌，并减少混杂菌群带来的影响。
分离大肠杆菌的常用方法是麻醉稀释法，也称为涂片法。
涂片法将混合菌群分散到琼脂板的表面上，并等待菌落生长和扩散。
选出大肠杆菌的单一菌群后，可以将其移植到另一培养皿中进行纯化。
大肠杆菌是实验室常见的菌株之一。
为了存储和使用大肠杆菌，需要使用冻存法或其他方法保存，使用培养基提供必要的营养物质支持生长，根据适宜的生长条件进行培养，加强分离和纯化步骤可以提高培养质量。
这些步骤可以帮助实验人员快速高效地进行大肠杆菌的保存和培养。
实验1 大肠杆菌的培养和分离
()
A．属于单细胞的原核生物 B．在固体培养基表面可见其细胞
C．细胞壁成分与植物不同 D．细胞中含有DNA和RNA
2．微生物实验中分别采用了高压蒸气、酒精、火焰灼烧等几种不同的灭菌处理，这些方法依次
可以用于杀灭什么部位的杂菌
()
A．接种针、手、培养基 B．高压锅、手、接种环
C．培养基、手、接种环 D．接种针、手、高压锅
平均菌落数÷涂布的稀释液体积×稀释倍数 （3）利用鉴别培养基确定细菌种类： 在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了 氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高 。因此，我们可以通过检测培 养基pH变化来判断该化学反应是否发生。在以尿素为唯一氮源的培养基 中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说 明该细菌能够分解尿素。 3．思考题： （1）农作物不能直接吸收利用尿素，但尿素却是农业生产上的重 要氮肥。农作物如何利用尿素中的氮？
环温度较高，为避免烫死菌种，可将其接触
冷却后再取样和接种。
4．接种划线：在固体培养基的表面连续划线
条，将培养皿转动一定角度后，用接种
环通过第1次划线的
做第2次连续平行划线，然后再以同样方法依次操作。
划线时要轻，不可
，也不要使接种环碰到培养皿边缘。
划线后盖好培养皿，将培养皿
，将培养皿放入恒温培养箱中在
面。 待酒精挥发之后，再点燃酒精灯。 2．接种 （1）接种时的要求 接种过程要在酒精灯火焰附近完成，这是因为在火焰附近形成的上
升气流能避免空气中的微生物落入培养基中。 接种环灭菌：将接种环在酒精灯火焰的外焰灼烧灭菌。对金属丝与
柄部连接部位也要在火焰上穿梭1－2次。灼烧后的接种环温度较高，为 避免烫死菌种，可将其接触培养基或培养容器的内壁冷却后再取菌种。
大肠杆菌的培养与分离
五、大肠杆菌分离后保存
1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成 后置于4℃冰箱保存。 2、长期保存：甘油冷冻管藏法
小结
1.如何操作才可以尽量避免被杂菌污染?
(1)胆大心细，操作快捷。（2）注意灭菌操作 原则，灭菌彻底，降低环境污染概率。（3） 注意微生物生长条件，如PH、渗透压、温度等。 细菌喜碱，喜蛋白质，喜37度；霉菌喜酸，喜 糖，喜25-30度
5.平板冷凝后，要将平板倒置,既可以使培养基表面的 水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养 基，造成污染.
三、大肠杆菌的扩大培养
将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的液体 培养基中,使其在37℃摇床培养12小时。
注意事项:
1.火焰旁从斜面上用接种环取菌;
2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧 灭菌,冷却后方能取菌; 3.取菌后封口膜和棉塞复原.
【课堂练习】 例1．关微生物营养物质的叙述中，正确的是（ D） A.是碳源的物质不可能同时是氮源
B.凡碳源都提供能量
C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量
例2防止杂菌污染
B.接种前菌种要进行灭菌
C.培养基和发酵设备都必须灭菌 D.灭菌必须在接种前
2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后 再进行划线？
答：以免接种环温度太高，杀死菌种。 3.在作第二次以及其后的划线操作时，为 什么总是从上一次划线的末端开始划线？ 答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起 始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能 使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少， 最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
FeSO4 CaCl2 H 2O
0.5g 0.5g 100ml
（3）若除去成分②，加入（CH2O）， 该培养基可用于培养 固氮微生物。 （4）表中营养成分共有 3 类。 （5）不论何种培养基，在各种成分都 溶化后分装前，要进行的是 调整pH 。 （6）右表中各成分重量确定的原则 是 依微生物的生长需要确定 。 （7）若右表培养基用于菌种鉴定，应 该增加的成分 琼脂（或凝固剂） 。
大肠杆菌的培养
大肠杆菌种子液的制备牛肉膏蛋白胨培养基的配方：液体培养基牛肉膏3.0g蛋白胨10.0g氯化钠5。
0g水1000mlpH 7。
4—7.6固体培养基在液体培养基的基础上再加入1。
5%－2.0％的琼脂1 试管斜面与平板的制备（1）称量按培养基配方比例依次准确称取蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂、水放入烧杯中.（2）熔化在上述烧杯中先加入少于所需要量的水，用玻璃棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，药品完全溶解后，补充水到所需的总体积。
将称量好的1。
8%琼脂放入已溶的药品中，再加热熔化，最后补充所损失的水分。
（3）调PH 在未调PH前，先用精密PH试纸测量培养基的原始PH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌,并随时用PH试纸测基PH直到PH达到7。
4—7。
6。
反之用1mol/L HCl进行调节.（4）分装将培养基分装入三个试管中和三角烧瓶中。
其试管装量不超过管高的1/5,三角烧瓶的量不超过1/2加塞培养基分装完毕后,在试管口和三角烧瓶口上塞上棉塞.（5）包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆好,再在棉塞外包一层牛皮纸,其外再用一道麻绳扎好.用记号笔注明培养基名称、配制日期。
（6）灭菌将上述培养基以0。
1Mpa,121℃，15min高压蒸气灭菌。
（7）倒平板，取三个已消毒的培养皿，在无菌操作台上用三角烧瓶中的培养基倒制三个平板培养基，冷却.（8）搁置斜面将灭菌的试管培养基冷却至50℃左右，将试管口端搁在玻璃棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜.2 接种大肠杆菌斜面种子（1）取实验室储备的大肠杆菌BL21种子，在酒精灯附近，用接种环在已制备好的斜面上接种上大肠杆菌。
(2) 将接种好的斜面放入37℃的恒温培养箱子中培养24h.3 制备平板种子(1) 在无菌条件下，取一支保存的大肠杆菌的斜面，用无菌生理盐水将菌种冲洗下来，再用无菌生理盐水将其梯度稀释为1倍,10倍,100倍和1000倍,用移液枪分别吸取各梯度的溶液涂布平板(每个梯度涂布三个平板，每次吸取溶液100ul），然后在37℃培养箱中过夜。
大肠杆菌的冷冻干燥保存
步骤：1各种物品的准备与高温蒸汽灭菌2 菌种的培养:LB液体培养基24h3离心4有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。
保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。
保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。
5真空冷冻干燥。
大肠杆菌的冷冻真空干燥法【试剂与器材】1．菌种: 保存的大肠杆菌2．培养基：LB液体培养基3．溶液或试剂:脱脂奶粉4．仪器或其他用具1ml枪头、无菌滴管，冻干管（青霉素瓶），普通冰箱，低温冰箱(-30℃)、离心机、离心管、锥形瓶、试管、灭菌锅、烘干箱等。
【操作步骤】1．准备冻干管：青霉素瓶（5ml）用蒸馏水冲洗1～2次，加四层纱布封口后，121℃灭菌30min备用。
配制保护剂：将脱脂奶粉配成10%乳液, 115℃，灭菌10min,随机抽样进行无菌检查,确认无菌后方可使用。
2．培养菌种：将要保存的菌种接入LB斜面培养基中，36±1℃培养24h后，镜检后转接LB液体培养基36±1℃培养24h。
3．离心（细胞收集）：将长好菌的液体培养基分装灭过菌的离心管，6000r/min离心10min。
4. 加保护液：每100ml 培养基离心出的细胞加入5-10ml 保护液混匀。
5、分装样品：用灭过菌的1ml枪头吸取加过菌的保护剂，注入到冻干管中（2mL）。
6．预冻：将加好保护剂的冻干管盖上胶盖封上纱布放于饭盒中，置于-30℃冰柜冷冻24h-48h 即可。
7．冷冻真空干燥: 启动冷冻真空干燥机制冷系统。
当温度下降到-50℃以下时，将冻结好的样品在无菌条件下打开胶盖（不拿下来，留一个缝隙即可）封好纱布，迅速放入冻干机钟罩内，启动真空泵抽气直至样品干燥（约24h）。
8．取出样品：先关真空泵、再关制冷机，打开进气阀使钟罩内真空度逐渐下降，直至与室内气压相等后打开钟罩，取出样品。
大肠杆菌
大肠杆菌的菌种保存
一.目的:保存大肠杆菌菌种
二.原理:大肠杆菌为革兰氏阴性菌,单在或成对排列,可以在普通肉汤培养基(形成菌落边缘整齐湿润),麦康凯培养基上(形成红色菌落), 兼性厌氧培养.
甘油可以保护大肠杆菌在低温环境中存活,可以防止菌体在超低温环境中水分形成冰粒,起到保护作用.
三.实验器材及材料:麦康凯培养基(分离细菌),普通肉汤培养基(扩增细菌),超低温冰箱,恒温震荡培养箱,操净台,试管1000ul移液枪,离心杯,甘油.
四.实验步骤
1、培养基：配制营养肉汤培养基
配方：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，磷酸氢二钾1g，蒸馏水1000ml．(高压灭菌备用)
2、分离大肠杆菌
3、染色观察,做细菌生化鉴定,确认为大肠杆菌
4、扩增培养：在液体培养基中接入大肠杆菌菌落（总量约为试管的
1/3），37℃恒温震荡培养箱中培养18-24h
5、保存方法：在离心杯中加入300ul菌液+700ul甘油(80%甘油+20%
生理盐水)－70℃培养
6、验菌:取出离心杯验菌,看是否有细菌生长。
大肠杆菌的培养和分离
3.常用的消毒与灭菌的方法：
（1）消毒法： A、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min B、巴氏消毒法：70-75 ℃下煮30min或 80 ℃下煮 15min（牛奶） C、化学药剂消毒法:用70%酒精进行皮肤消毒;氯气 消毒水源 D、紫外线消毒（空气）
（2）常用灭菌的方法：
高压蒸汽灭菌： 培养基、无菌水、各种
平板划线分离法
划线分离法注意事项:
1.接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不 同位置连续划线多次.
2.划线首尾不能相接
3.划线后,培养皿倒置培养12~24h
斜面接种及菌种保存
主要器具：接种环、恒温箱、冰箱
操作过程：在无菌操作下，用接种环挑取_单__菌落， 再用划线法（自斜面底部向上轻轻划直线）接种 在_斜__面__上， _３__７__℃恒温培养箱中培养_２__４_小时 后，__４__℃ 冰箱保存。
涂布分离法
划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。 涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。
四、大肠杆菌的培养和分离
1、大肠杆菌 （1）特性：
革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌 （2）用途：
基因工程技术中被广泛采用的工具
2、培养： LB液体培养基 —— 扩大培养 LB固体培养基 —— 分离 成分？
3、培养与分离 培养基灭菌 将LB液体和固体培养基及培养皿高压蒸
2.灭菌及消毒：无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭 菌；桌面及人手用酒精棉球消毒
3.操作时右手无名指和小指夹住封口膜,另外三指持三 角瓶,左手拿培养皿并打开上盖的一边,在酒精灯火焰旁 操作.
4.需要使锥形瓶的瓶口通过火焰，灼烧灭菌
5.平板冷凝后，要将平板倒置,既可以使培养基表面的 水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养 基，造成污染.
高中生物 第一部分《实验一 大肠杆菌的培养和分离》课件13 浙科版选修1
①常用的固体培养基:
琼脂固体培养基. ②微生物在固体培养基
表面生长,可以形成
肉眼可见的菌落.
第七页，共38页。
2.培养基内所含的基本物质
• (1)水 • (2)碳源
• (3)氮源
• (4)无机盐
第八页，共38页。
3.培养基内所需的其他条件 • (1)pH值 • 如:培养霉菌需酸性、培养细菌需中性或微碱
α-固定化酶的使用 α-固定化酶 条件和效果
枯草杆菌
果酒和果醋的制作 果酒:酵母菌+天然 干酵母 果醋:醋化醋杆菌 菌种或醋曲
泡菜的腌制和亚硝 假丝酵母、乳酸菌 天然微生物 酸的测定
植物组织培养
菊花
第二页，共38页。
实验1 大肠杆菌的培养和分离
• 实验目的： • 1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进
的铅笔上，冷却后使培养基形成斜面。
第二十页，共38页。
步骤:
１、配制培养基; 培养基灭菌、器具灭菌
2、冷却，倒平板 (编号,无菌环境操无菌环境操作)
４、划线分离、恒温培养箱培养12~24h
(无菌环境操作)
５、接种斜面,4℃冰箱保存(目的:为了保存菌种)
6、实验完成后，接触过细菌的器皿均应灭菌处理后丢失。
4℃冰箱保存。
视频
6.实验完成后，接触过细菌的器皿均应灭菌处 理后丢弃。 目的：为了防止实验菌残留于接种环而污染环境 和感染实验人员。
第三十一页，共38页。
1为了获得纯净的培养物，其关键是防止外来杂菌的入侵 污染： 1）培养皿； 2）培养基； 3）接种过程是无菌的 2请思考：培养基、培养皿、手、接种环分别如何消毒或 灭菌？
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一．菌种的保存
重组DNA 分子(质粒、噬菌体、粘性质粒)必须导入宿主菌中，通过细菌培养来扩增所需的重组DNA。
通常采用宿主菌是大肠杆菌，根据不同载体需求，选用不同品系大肠杆菌
1. 概述：大肠杆菌其它微生物一样，都具有稳定遗传性和变异性、遗传性，保证微生物本身特征的相对稳定，即无性繁殖过程中能够保持原有的性状，为菌种保藏提供了有利因此，而变异性，使微生物的性状在繁殖过程中出现某些改变，给菌种保藏带来了困难。
由于存在变异，即菌种常出现所谓的退化，主要指理想性状的丧失，从而导致发育缓慢，存活率和产质量降低等现象，菌种保藏工作就是使菌种的变异降低至最小水平，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、优良生产性能、形态特征以及不污染杂菌。
能够长期在研究上应用。
2. 微生物的变异速度，通常情况下，与其新陈代谢速度有关，微生物代谢活力旺盛，它的变异速度快，代谢活动微弱，变异速度就慢。
并且在多次的无性繁殖过程中可能会有突变的积累。
人们利用这一规律，可以创造各种条件，使微生物活动处于微弱活动或不活动状态，以减少变异的发生。
3. 菌种保藏的原理是：通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段，以达最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制细菌的生长和繁殖。
由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠状态，从而可以保藏较长时间。
要求保存的菌种在复苏后除保持以前的生活与繁殖能力、不发生形态特征、生理状态及遗传性状的
改变外，还不允许污染任何杂菌。
此外，在保存前应确保菌种的单纯性，先分离单菌落后进行鉴定，然后再繁殖保存。
4. 常用的长期保存法有：液体石蜡法、硅胶保存法、加入甘油或二甲基亚砜（DMSD）等保护剂。
5. 甘油低温保存法(－70℃—－196℃)的特点
i.
甘油菌低温保存的基本原理是：在-70℃或液氮中冻存，细菌内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。
在0℃—-70℃温度范围内，水晶呈针状，极易招致细菌的严重损伤。
用电镜观察，可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔。
因此，为了避免0℃—-70℃冰晶的形成和细菌膜两侧离子平衡的破坏，需要加保护剂。
甘油可降低冰点，在缓慢的冻结条件下，能使细菌内水分在冻结前透出细菌外。
贮存在-70℃以下低温中能减少冰晶形成，甘油对细菌无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细菌.
ii.
使用浓度范围为15%-50%，一般常用30%。
在保存瓶中按1：1加入60%的甘油和菌液，混匀后贮存于-70℃或液氮中。
复苏后细菌仍能生长，活力不受任何影响。
二、菌种的复苏
复苏菌种时，用接种环或牙签挑取少许冻结的菌种到平皿上，37℃培养8-12小时即可。
甘油菌从冰箱取出使用时应置于低温或0℃冰浴中，用完尽快放回，接种时挑取表面已融化部分即可，不可全溶，因反复冻融会导致细胞壁破裂。
切记：接种过程中不得使保存瓶中的菌液融化。
三、大肠杆菌培养
1.培养基配制：培养基从形态上分为液体与固体培养基。
根据有无抗生素和其他选择性药物分为普通与选择培养基，常用LB培养基。
1）LB（Luria-Bertain)液体培养基配制
精解蛋白胨(bacto-tryptone)1.0%
酵母浸出粉(bacto-extract)0.5%
氯化钠1.0%
搅拌使之完全溶解，用5molNaOH(about0.2ml/1000ml培养基）调pH至7.0，如用进口试剂可不
必调，高压灭菌20min(120℃0.1Mpa)
2）含琼脂的固体培养基配制
（1）普通培养基:固体培养基是在液体培养基中加1.5%琼脂制成，先配液体培养基，然后加入1.5%琼脂，高压灭菌20min，取出后再无菌状态下铺平板
（2）选择性培养基:将消毒好的固体培养基置室温下冷却50℃时加抗生素或其他必加成分，摇匀后倒入灭菌皿中厚度2-3mm, 室温固化。
(抗生素用三蒸水溶解后，用无菌滤头过滤到无菌瓶中, 氨苄青霉素终浓度50μl/ml)新制备的固体培养基较湿，铺上的液体不易吸收，可在室温下放2-3天，或37℃放半小时，然后4℃保存备用。
（3）LB培养基中所用抗生素终浓度：氨苄青霉素-50μl/ml；氯霉素-20μl/ml；庆大霉素
-15μl/ml；卡那霉素-30μl/ml；春日霉素-1000μl/ml；壮观霉素-100μl/ml；链霉素-30μl/ml；四环素-12μl/ml。
注意：除了四环素保存-20℃，其余均应保存4℃，所有抗生素均应溶于无菌去离子水。
四环素对光敏感
2.液体细菌培养
1）小量培养:
(1) 取灭菌16 或18mm 口径培养管，加3-5mlLB 培养基，再加50mg/ml 氨苄青霉素3-5ul（宿主菌不加抗生素）
(2) 无菌牙签挑取单菌落，送入培养液中，或取菌液5-10ul，转入培养液中，封好管口
(3) 37℃摇床培养100-200r/min 至生长饱和，约6-12 小时
2）大量培养:取500ml 培养瓶内装培养基100-200ml，及相应抗生素。
以0.5-1%浓度接种菌液，37 度摇床培养100-200r/min至OD值0.6-0.8。
3.固体细菌培养: 用于单一菌落的挑选，转化后抗性菌落的筛选。
方法：采用划痕接种法。
用接种环从菌种中沾取少量菌液，划线。