离子交换树脂层析分离混合氨基酸

实验二离子交换树脂层析分离混合氨基酸

【实验目的】

1. 了解离子交换树脂层析的工作原理及操作技术。

2. 学会用离子交换树脂层析法分离混合氨基酸。

【实验原理】

离子交换树脂是一种合成的高聚物，不溶于水，能吸水膨胀。高聚物分子由能电离的性基团及非极性的树脂组成。极性基团上的离子能与溶液中的离子起交换作用，而非极性的树脂本身物性不变。通常离子交换树脂按所带的基团分为强酸(＝R＝S03H)、弱(＝COOH)、强碱(＝N+＝R：)和弱碱(＝NH2＝NHR＝NR2)。

离子交换树脂分离小分子物质如氨基酸、腺苷、腺苷酸等是比较理想的。但对生物大于物质如蛋白质是不适当的，因为它们不能扩散到树脂的链状结构中。故如分离生物大子、可选用以多糖聚合物如纤维素、葡聚糖为载体的离子交换剂。

本实验用磺酸阳离子交换树脂分离酸性氨基酸(天冬氨酸)、中性氨基酸(丙氨酸)碱性氨基酸(赖氨酸)的混合液。在特定的pH条件下，它们解离程度不同，通过改变脱液的pH 或离子强度可分别洗脱分离。

【实验材料】

1．实验器材

层析柱（1.6X20cm）；恒流泵；梯度混合器；试管及试管架；紫外分光光度计、磺酸阳离子交换树脂(Dowex 50)

2．实验试剂

(1)2mol／L HCl

(2)2mol／L NaOH

(3)0.1mOl／L HCl

(4)0.1mol／L NaOH

(5)pH4.2的柠檬酸缓冲液：0.lmol／L柠檬酸54m1加0.1mol／L柠檬酸钠46ml

(6)pH5的醋酸缓冲液：0.2mol／L NaAc 70ml加0.2mol／L HAc 30ml

(7)0.2％中性茚三酮溶液：0.2g茚三酮加100ml丙酮

(8)氨基酸混合液：丙氨酸、天冬氨酸、赖氨酸各10m1加0.1mol／L HCl 3m

【实验方法】

1. 树脂的处理

100ml烧杯中置约10g树脂，加25ml 12mo1／L HCl搅拌2h，倾弃酸液，用蒸馏水充洗涤树脂至中性。加25ml 12mol／L NaOH至上述树脂中搅拌2h，倾弃碱液，用蒸馏水洗涤至中性。将树脂悬浮于50ml pH4.2柠檬酸缓冲液中备用。

2. 装柱

取直径0.8cm～1.2cm、长度10cm～12cm的层析柱，底部垫玻璃棉或海绵圆垫，自顶部注入经处理的上述树脂悬浮液，关闭层柱出口，待树脂沉降后，放出过量的溶液，在加入一些树脂，至树脂沉积至8cm～10cm高度即可。于柱子顶部继续加入pH4.2柠檬酸缓冲液洗涤，使流出液pH为4.2为止，关闭柱子出口，保持液面高出树脂表面1cm左右。

3. 加样、洗脱及洗脱液收集

打开山口使缓冲液流出，待液面几乎平齐树脂表面时关闭出口(不可使树脂表面干燥)。用长滴管将15滴氨基酸混合液仔细直接加到树脂顶部，打开出口使其缓慢流入柱内。当液面刚平树脂表面时，加入0.1mol／L HCl 3ml，以10滴／min～12滴／min的流速洗脱，收集洗脱液，每管20滴，逐管收存。当HCl液面刚平树脂表面时，用1m1 pH4.2柠檬酸缓冲液冲洗柱壁一次，接着用2ml pH4.2柠檬酸缓冲液洗脱，保持流速10滴／min～12滴／min 并注意勿使树脂表面干燥。

在收集洗脱液的过程中，逐管用茚三酮检验氨基酸的洗脱情况，方法是：于各管洗脱液中加10滴pH5醋酸缓冲液和10滴中性茚三酮溶液，沸水浴中煮10min，如溶液呈紫蓝色，表示已有氨基酸洗脱下来。显色的深度可代表洗脱的氨基酸浓度，可比色测。

在用pH4.2柠檬酸缓冲液把第二个氨基酸洗脱出来之后，再收集两管茚三酮反应阴性部分，关闭层析柱出口，将树脂顶部剩余的pH4.2柠檬酸缓冲液移去。

于树脂顶部加入2ml 0.1mo1／L NaOH，打开出口使其缓慢流入柱内，按上面I续用0.1mo1／L NaOH洗脱并逐管收集(注意仍然保持流速10滴／min～12滴／min)，每管20滴。做洗脱液中氨基酸检验，在第三个氨基酸用0.1mo1／L NaOH洗脱下来以后，再继续收集两管茚三酮反应阴性部分。

最后以洗脱液管号为横坐标，洗脱液各管光密度（以水作空白，在570nm波长读取吸光度）或颜色深浅（以-，±，+，++．．．表示）为纵坐标作图，即可画出一条洗脱曲线。

【注意事项】

1. 在装柱时必须防止气泡、分层及柱子液面在树脂表面以下等现象发生。

2. 一直保持流速10滴/min～12滴／min，并注意勿使树脂表面干燥。

【思考题】

1. 为什么混合氨基酸从磺酸阳离子交换树脂上逐个洗脱下来?

2. 树脂如何保存?

Experiment 13 Separating Mixed Amino Acids by Ion – Exchange

Chromatography

【Purpose】

1. Know the principle and operating techniques of ion - exchange - resin chromatography.

2. Learn to use ion- exchange- resin chromatography to separate the mixed amino acids.

【Principle】

Ion - exchange resin is a kind of synthetic polymer. It can’t be soluble in water, but can expand by absorbing water to dilate. Polymer molecule consists of polar groups that can ionize and nonpolar resin. The ions on the polar groups can be exchanged with the ion in the solution, but the physical property of the nonpolar resin will not change. Usually the groups that carried by ion- exchange resin can be divided into strong acid (＝R＝SO3H ), weak acid (＝COOH ), strong base (＝N+＝R3 ) weak base (＝NH2＝NHR=NR2 ).

It’s relatively ideal to use ion - exchange - resin to separate small molecules such as amino acid, adenosine, and adenylate and so on. But it’s not proper for macro-molecule substance like protein, because it can’t diffuse into the chain structure of resin. So we can choose ion- exchange reagent that takes polysaccharide such as cellulose and dextran as the supporter to separate biological macromolecules.

This experiment uses sulfonic acid cation - exchange resin to separate the mixture of acidic amino acid (aspartic acid), neutral amino acid (alanine) and basic amino acid (lysine). In the condition of certain pH, the degree of their dissociation is different, so they can be respectively eluted and separated by changing the pH and the ion strength of eluting solution.

【Materials】

1. Apparatus:

(1)Column（16/20）

(2)Pump

(3)Gradient maker

(4)Ultraviolet meters

(5)Sulfonic acid cation- exchange- resin (Dowex 50)

2．Reagents:

(1)Hydrogen chloride (2mol/L)

(2)Sodium hydroxide (2mol/L)

(3)Hydrogen chloride (0.1 mol/L)

(4)Sodium hydroxide (0. 1mol/L)

(5)Citric acid buffer (pH4.2): 54ml of 0.1mol/L Citric acid and 46ml of 0.1mol/L sodium citrate

(6)Acetate acid buffer (pH5): 70mi of 0.2mol/L sodium acetate and 30ml 0.2mol/L acetate acid

(7)Neutral triketohydrindene hydrate solution (0.2%): 0.2g of triketohydrindene hydrate