酶联免疫吸附试验测AFP——ELISA双抗体夹心法

实验材料与仪器
待检抗原原液、酶标抗体、抗原稀Leabharlann Baidu液、 酶标稀释液、酶标板条、洗涤液、显色液 A、显色液B、终止液
滴管、吸管、微量加样器、移液管 酶标仪、温育箱
操作
在酶标板条的孔中加入相应浓度的抗原（100UL/孔）
↓37℃×30min
弃孔内液体，用洗涤液洗3遍，30s/次
↓拍干
加所设计的不同工作浓度的酶标抗体100UL/孔
Ab＋Ag＋Ab* Ab • Ag • Ab* ＋Ab • Ag ＋Ag • Ab*＋Ab* • Ag • Ab*
a
b
c
d
Ab ＋ Ag Ab • Ag （b复合物）
(1)
Ab • Ag＋Ab* Ab • Ag • Ab* （a复合物）
(2)
HooK‘S效应（钩状效应）
ELISA影响因素实验设计
实验设计要求
在实验本上绘出36孔设计图表
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
写出实验中选择的包被液的情况 写出实验中选择的包被抗体、酶标抗体、
检测抗原的浓度，和系列稀释方案。 写出最终测得的OD值并分析实验结果。
评价
双抗体夹心ELISA法简单易行，不需 复杂的仪器设备，特异性强、敏感性 高，其中一步法更简单、省时，但有 Hook效应的缺点。
ELISA综合性实验二
综合性实验设计方案探讨
ELISA最佳工作浓度的选择
——此次试验提供0.5mg/mL的包被抗体原液每组300μl (经过一系列的预实验，现在我们抗体包被的浓度范围缩 小为10μg/mL ～ 60μg/mL)。
——包被用Na2CO3缓冲液每组各10ml ——酶标抗体稀释液、抗原稀释液每组10ml ——1:50酶标抗体液每组100μl（预实验后工作浓度范围
缩小在1:2000～1:10000之内） ——800μg/mL的检测抗原原液每组800μl（自己调整检
测浓度，此次试验强阳性抗原为400μg/mL、弱阳性抗原 浓度为20μg/mL、阴性直接加抗原稀释液 ） ——聚苯乙烯酶标板条3条，共36孔
实验设计操作要求
包被抗体、酶标抗体、检测抗原浓度的确立； 聚苯乙烯板条每孔加包被抗体液100μL，4℃包被
48h。 弃去孔内液体，每孔加200μL封闭液，4℃封闭24h。 弃去封闭液，风干，检测（检测时每孔所加的各
稀释度的酶标液和抗原都为100μL ），结果分析。
标本检测的原理
将特异性抗体包被固相载体，加入受检标 本（抗原）使之与固相载体上的抗体结合 成抗体抗原复合物，加入酶标抗体形成抗 体抗原酶标抗体复合物，加入底物显色。
↓37℃×30min
弃去孔内液体，同上洗涤三次
↓拍干
加底物A、B液各2滴(100UL/孔)
↓37℃×15min
显色后加终止液1滴(50UL/孔)
↓
酶标比色仪450nm读取OD 值
棋盘滴定法选择最佳工作浓度
选择标准：强阳性参考血清A值为0.8左右 阴性参考血清A值<0.1
（即：选择强阳性对照孔最接近0.8，且阴 性孔小于0.1的孔所对应的包被浓度和酶标 浓度为最佳的ELISA检测浓度。）
第一组：边缘效应 第二组：叠加效应 第三组：温浴方式 第四组：加样方式 第五组：洗涤次数 第六组：温浴时间 第七组：试剂温度
小组讨论结束后每组写出一份具体的试验设计方 案，下节课上每组派代表上台讲述实验方案和可 行性，讲述时间为2-3分钟左右。
要求设计方案中包括： 实验对象、标本要求 操作条件、操作过程（可画出96孔加样示
意图或对比示意图等） 结果判断标准 结果分析方式
谢谢！