基因分析仪的检测原理和应用

TrueScience™ RespiFinder® Panels
AB PN 4460381
AB Name TrueScience™ RespiFinder® 15 Viral Identification Panel
4460382 TrueScience™ RespiFinder® 19 Pathogen Identification Panel
RespiFinder®试剂盒的检测原理
杂交 连接 PCR 扩增
上机检测
27 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012
The Power of Multiplex PCR technology
Needle in a haystack…
Description
Detects and Identifies 15种呼吸道病毒 50 次反应
Detects and Identifies 15种呼吸道病毒 + 4 种细菌 50 次反应
29 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012
12 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012
片段分析的原理和流程
生成荧光标记的 DNA片段
标记引物5’端
电泳
数据分析 (大小)
数据分析 (基因型)
标记ddNTP
T
G
A
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ߴ压电‫ݯ‬
ܹޫܹ发ॴ༗௨ಓ
DDNAN测Aং测ࣔ序ҙ图示意图
C T T G C A T G A C 序列
信号
用点的大小代表DNA分子的大小， 颜色代表DNA所标记的颜色
检测窗口 毛细管
9 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012
呼吸道病原体检测的传统方法：
• 过去门诊病人的诊断主要依赖于触觉和传统工具
− 听诊器，温度计，压舌片，拍片，医生的临床经验和直觉
• 目前: 快速检测法 (每次检测1个位点，敏感性有待提高) • 问题: 根据临床表现进行诊断容易误诊
− 抗生素对病毒感染引起的呼吸道疾病不起作用 − 重症患者诊断 (通常是住院病人):
3130/3130(xl) System （4道和16道毛细管）
3 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012
3730/3730(xl) System （48道和96道毛细管）
DNA分子组成
脱氧核糖核苷酸dNTP
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单个SNP位点检测
rfu
wt
T
wt
C
mut
rfu wt/mut
rfu mut
Homozygote = wt
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Heterozygote
Homozygote = mut
多个SNP位点同时检测
…after amplification…
28 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012
Imagine this for 20 different needles simultaneously! ….as in a Multiplex PANEL
15 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012
标准曲线
片段分析的原理和流程
生成荧光标记的 DNA片段
电泳
数据分析 (大小)
数据分析 (基因型)
16 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012
单个SNP位点检测
Primer
ddG
ddT
ddC
Enzyme
ddA
Primer
A Template – Allele 1
G Template – Allele 2
T
C
Single Base Extension Reaction(单碱基延伸反应)
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Allelic Ladder的结果
19 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012
检测样品的结果
20 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012
> 病毒培养 (金标准, 时间长) > 直接荧光抗体法快速检测 (敏感性不高) > 定向(Targeted ) PCR (敏感, 但每次只能检测1-2个位点)
• 传统的方法和快速检测法敏感性差而且易出错 • 难以区别细菌和病毒感染，或鉴别合并感染
26 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012
操作流程
Step 1 RT-PCR [2hr 30 min]
Step 2 杂交 [1hr]
Step 3a 探针连接 [15 min]
Step 3b 探针扩增 [1hr 45 min]
30 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012
• 器官移植和骨髓配型前要进行供体/ 受体兼容性检测 • 比血清学或PCR方法更精确更可信
11 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012
测序 vs. 片段分析
测序 = 检测DNA片段中的碱基序列
片段分析 = 分离荧光标记的片段并检测其相对大小
片段分析的原理和流程
生成荧光标记的 DNA片段
电泳
数据分析 (大小)
数据分析 (基因型)
14 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012
片段分析的原理和流程
生成荧光标记的 DNA片段
分子量标准
电泳
数据分析 (大小)
数据分析 (基因型)
人类偏肺病毒（Human metapneumovirus）
鼻病毒（Rhinovirus） – 普通感冒
副流感病毒（ParaInfluenza） – 喉炎
呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus ，RSV)
25 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012
不同位点的引物带不同长度的尾巴
T
T
C
A
A
C ddGTP
G
ddCTP Extend and
ddUTP Terminate Primer
ddATP
A
A
G
T
T
T
T
C
A
A
G C
C G
Primer G Template
C G
1
2
3
4
5
6
大小 = 位点
颜色 = 基因型
24 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012
片段分析的应用：微卫星/STR
Locus X
(CA)n
CA CA CA CA CA CA CA CA
• STR = Short Tandem Repeat 短串联重复 • 每个重复单位长2~7 nt • 等位基因根据重复数不同加以区别
等位基因 1 等位基因 2
17 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012
变性
DNA模板
引物
退火
A 延伸/终止
6 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012
AG CT
测序酶 荧光标记的ddNTP
ʢBigDye® Terminatorʣ
dNTPs
荧光标记的测序反应产物
ddNTP 被加到正在合成的链上，由于它的3’-OH已被氧化，下一个dNTP 的5’-磷酸基团不能与之形成磷酸二酯键，使合成终止。 测序反应的延伸阶段，ddNTP在不同位置掺入产生一系列不同长度的新的 DNA片段。
A
Adenine
G
Guanine
T
Thymine
C
Cytosine
测序反应的原理
5’
O
O O
3’ H
无3’ OH的ddNTP阻止下一个dNTP的掺入
5’
O
5 | Life Technologies Proprietary & Con来自百度文库idential | 5/18/2012
3’ OH
测序反应的原理
TrueScienceTM RespiFinder® Panels
RespiFinder 15
片段分析的应用：呼吸道病原体检测
• 呼吸道感染ʢRespiratory tract infections ɼ
RTI)是成人和儿童患者发病和死亡的主要因 素。
– 对国家造成明显的经济负担 – 分类：上呼吸道感染和下呼吸道感染 – 致病因素：病毒和细菌
腺病毒（Adenovirus）– 咽炎
流感病毒（Influenza virus） – 流感
HID (Human Identificationɼ人类鉴定)
Identifiler®
D18S51 TPOX vWA D19S433 D2S1338 D16S539 D13S317 TH01 D3S1358 CSF1PO D7S820 D21S11 D8S1179
FGA D5S818
• 法医鉴定- 嫌疑犯证据配型 • 亲子鉴定 • 失踪人口调查 • 遇难者辨识- 残骸鉴定 • 重罪犯 DNA 数据库 • 历史调查 • 骨髓移植监测 (嵌合体研究) • AmpFlSTR® Identifiler® 试剂盒
3100(A) , 3130(xl)
平板胶电泳
1996年
310
全球第一台
毛细管基因分析仪
毛细管电泳
2 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012
LIFE公司基因分析仪大家族
310 System
（1道毛细管）
3500/3500(xl) System （8道和24道毛细管）
片段分析的应用ɿSNP检测
(Single Nucleotide Polymorphismɼ单核苷酸多态性)
• SNP在人基因组中的发生频率比较高， 大约平均每300个碱基中就有1个多态 位点
• 与遗传特性，疾病易感性和药物治疗效 果有关
• 构建高分辨遗传图谱很好的遗传标记
21 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012
7 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012
基因分析仪的基本构造
计ࢉ‫ص‬෼ੳ测ং਺ਾ
CCD ૬‫ص‬记录ॴ༗௨ಓ৴߸
ໟ细؅
电ӭํ޲
8 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012
进样端
杂合子检测：发现新突变
10 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012
K = (GT) M = (AC) R = (AG) S = (GC) W = (AT) Y = (CT)
基于HLA序列的分型
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基因分析仪的检测 原理及其应用
1 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012
LIFE公司基因分析仪发展历史
1986年
全球第一台 370 373 377 基因分析仪
3730(xl) 3500(xl)
市场占有率: 85%，全世 界2万多台,中国1000多台