实验三__鞭毛染色法及活细菌运动性的观察

二、实验原理： 实验原理
细菌是否具有鞭毛是细菌分类鉴定的重要特征之一。 细菌是否具有鞭毛是细菌分类鉴定的重要特征之一。采 用鞭毛染色法虽能观察到鞭毛的形态、着生位置和数目， 用鞭毛染色法虽能观察到鞭毛的形态、着生位置和数目， 但此法既费时又麻烦。如果仅须了解某菌是否有鞭毛， 但此法既费时又麻烦。如果仅须了解某菌是否有鞭毛， 可采用悬滴法或水封片法（即压滴法） 可采用悬滴法或水封片法（即压滴法）直接在光学显微 镜下检查活细菌是否具有运动能力， 镜下检查活细菌是否具有运动能力，以此来判断细菌是 否有鞭毛。此法较快速、简便。 否有鞭毛。此法较快速、简便。 大多数球菌不生鞭毛，杆菌中有的有鞭毛有的无鞭毛， 大多数球菌不生鞭毛，杆菌中有的有鞭毛有的无鞭毛， 弧菌和螺菌几乎都有鞭毛。 弧菌和螺菌几乎都有鞭毛。有鞭毛的细菌在幼龄时具有 较强的运动力，衰老的细胞鞭毛易脱落， 较强的运动力，衰老的细胞鞭毛易脱落，故观察时宜选 用幼龄菌体。 用幼龄菌体。
3.盖凹玻片： 盖凹玻片： 盖凹玻片
将凹玻片的凹槽对准盖玻片中央的菌液， 将凹玻片的凹槽对准盖玻片中央的菌液， 并轻轻地盖在盖玻片上，然后翻转凹玻片， 并轻轻地盖在盖玻片上，然后翻转凹玻片， 使菌液正好悬在凹槽的中央。 使菌液正好悬在凹槽的中央。
4.镜检 镜检： 镜检
先用低倍镜找到标记， 先用低倍镜找到标记，再稍微移动凹玻片即可 找到菌滴的边缘， 找到菌滴的边缘，然后将菌液移到视野中央换 高倍镜观察。由于菌体是透明的，镜检时可适当 高倍镜观察。由于菌体是透明的，镜检时可适当 缩小光圈增大反差，便于观察。 缩小光圈增大反差，便于观察。镜检时要仔细辨 别是细菌的运动还是分子运动（即布朗运动）， 别是细菌的运动还是分子运动（即布朗运动）， 前者在视野下可见细菌自一处游动至他处， 前者在视野下可见细菌自一处游动至他处，而后 者仅在原处左右摆动。细菌的运动速度依菌种不 者仅在原处左右摆动。 同而异，应仔细观察。 同而异，应仔细观察。
三、实验器材
1. 活材料：培养 活材料：培养12-16h小时的普通变形杆菌）。 小时的普通变形杆菌）。 小时的普通变形杆菌 2. 标本片：单鞭毛（绿脓杆菌），周鞭毛（伤寒 标本片：单鞭毛（绿脓杆菌），周鞭毛（ ），周鞭毛 杆菌）） 杆菌）） 3. 试剂：生理盐水、香柏油、二甲苯。 试剂：生理盐水、香柏油、二甲苯。 4. 器材：凹载玻片、盖玻片、镊子、擦镜纸、吸 器材：凹载玻片、盖玻片、镊子、擦镜纸、 水纸、接种环，显微镜等。 水纸、接种环，显微镜等
注意事项
①取菌要取菌落边缘的幼龄菌体。 取菌要取菌落边缘的幼龄菌体。 取菌后的接种环在载片上的蒸馏水中轻轻沾几下即可， ②取菌后的接种环在载片上的蒸馏水中轻轻沾几下即可， 不要用力太猛，更不能用接种环大幅度涂开； 不要用力太猛，更不能用接种环大幅度涂开；否则鞭毛 易脱落，造成染色失败。 易脱落，造成染色失败。 鞭毛染色的玻片只能自然干燥，不能用热风吹干， ③鞭毛染色的玻片只能自然干燥，不能用热风吹干，不 能热固定，这是由于加热后菌体易变形，鞭毛易脱落， 能热固定，这是由于加热后菌体易变形，鞭毛易脱落， 影响观察。 影响观察。 染液染完后用蒸馏水（ ④A、 B染液染完后用蒸馏水（自来水效果差）冲洗时 、 染液染完后用蒸馏水 自来水效果差） 一定要充分，背景很脏，鞭毛不易被观察到， 一定要充分，背景很脏，鞭毛不易被观察到，影响实验 效果。 效果。 染液后， ⑤加B染液后，将玻片稍加热（但不能太热，更不能沸 染液后 将玻片稍加热（但不能太热， 腾或蒸干）使其微冒蒸汽，染色效果较不加热为好。 腾或蒸干）使其微冒蒸汽，染色效果较不加热为好。 染色用玻片干净无油污是鞭毛染色成功的先决条件。 染色用玻片干净无油污是鞭毛染色成功的先决条件。
实验三 鞭毛染色法及活细菌 运动性的观察
一、实验目的： 实验目的：
1.学习细菌的鞭毛染色法 观察细菌鞭毛的 学习细菌的鞭毛染色法,观察细菌鞭毛的 学习细菌的鞭毛染色法 形态特征; 形态特征 2.学习用悬滴法观察细菌的运动性 学习用悬滴法观察细菌的运动性. 学习用悬滴法观察细菌的运动性
二、实验原理： 实验原理
细菌的鞭毛极细，直径一般为 细菌的鞭毛极细，直径一般为10—20nm，只有用电子 ， 显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法， 显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法，则在 普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色方法很多， 普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色方法很多，但 其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理， 其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理，让它沉 积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。 积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用 的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。 的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。
五、实验作业： 实验作业：
1. 绘出鞭毛菌（绿脓和伤寒杆菌）的形态图 绘出鞭毛菌（绿脓和伤寒杆菌）的形态图. 2. 用鞭毛染色法准确鉴定一株细菌菌是否具 有鞭毛，要注意哪些环节？ 有鞭毛，要注意哪些环节？ 3. 悬滴法中，为什么加的菌液不能大多？如 悬滴法中，为什么加的菌液不能大多？ 果发现显微镜视野内大量细菌向一个方向 流动，你认为是什么原因造成的？ 流动，你认为是什么原因造成的？
ห้องสมุดไป่ตู้
注意事项
1、检查细菌运动的载玻片和盖玻片都要洁净无 、 否则将影响细菌的运动。 油，否则将影响细菌的运动。 2、制水封片时菌液不可加得太多，过多的菌液 、制水封片时菌液不可加得太多， 会在盖玻片下流动， 会在盖玻片下流动，因而在视野内只见大量的细 菌朝一个方向运动， 菌朝一个方向运动，从而影响了对细菌正常运动 的观察。 的观察。 3、若使用油镜观察，应在盖玻片上加香柏油一 、若使用油镜观察， 滴。
A染液（媒染剂）染色4-6分钟→蒸馏水洗→ 再 染液（媒染剂）染色 分钟→ 染液 分钟 蒸馏水洗→ 染液（ 用B染液（硝酸银）冲洗残水→ 然后使 液充满 染液 硝酸银）冲洗残水→ 然后使B液充满 载片→ 酒精灯加热至冒气（微热） 载片→ 酒精灯加热至冒气（微热），30-60秒 秒 加热时应随时补充蒸发掉的染料， （ 加热时应随时补充蒸发掉的染料 ， 不可使玻 片出现干涸区） 蒸馏水洗、自然干燥→ 镜检. 片出现干涸区）→蒸馏水洗、自然干燥→ 镜检
下周实验
四大类微生物菌落及个体形态观察
本次实验课结束
请确保油镜头擦拭干净！ 请确保油镜头擦拭干净！ 请第三组同学留下值日
四、实验方法
（一）鞭毛染色 硝酸银染色法： 硝酸银染色法：
1.清洗玻片：选择光滑无裂痕的玻片，最好选用 清洗玻片：选择光滑无裂痕的玻片， 清洗玻片 新的。 新的。然后将玻片置洗衣粉过滤液中 洗衣粉煮沸后用滤纸过滤，以除去粗颗粒）， （洗衣粉煮沸后用滤纸过滤，以除去粗颗粒）， 煮沸20min。取出稍冷后用自来水冲洗、晾 煮沸 。取出稍冷后用自来水冲洗、 再放入浓洗液中浸泡5—6天，使用前取出 干，再放入浓洗液中浸泡 天 玻片，用自来水冲去残酸，再用蒸馏水洗。 玻片，用自来水冲去残酸，再用蒸馏水洗。将 水沥干后，放入95%乙醇中脱水。 乙醇中脱水。 水沥干后，放入 乙醇中脱水
结果：菌体呈深褐色，鞭毛呈浅褐色 结果：菌体呈深褐色，鞭毛呈浅褐色, 一般呈波浪形
（二）细菌的运动性观察
悬滴法： 悬滴法： 1.制备菌液：在幼龄菌斜面上，滴加 制备菌液： 制备菌液 在幼龄菌斜面上，滴加3-4滴 滴 生理盐水，制成轻度混浊的菌悬液。 生理盐水，制成轻度混浊的菌悬液。 2.滴加菌液：加1滴菌液于盖玻片的中央， 滴加菌液： 滴菌液于盖玻片的中央， 滴加菌液 滴菌液于盖玻片的中央 也可用接种环挑取一环菌液于玻片中央， 也可用接种环挑取一环菌液于玻片中央， 并用记号笔在菌液的边缘做一记号， 并用记号笔在菌液的边缘做一记号，以便 在显微镜观察时，易于寻找菌液的位置。 在显微镜观察时，易于寻找菌液的位置。
载片上滴一滴蒸馏水→ 载片上滴一滴蒸馏水 → 菌种斜面的冷凝水处取 在载片上的蒸馏水中轻轻沾几下→ 一环菌 →在载片上的蒸馏水中轻轻沾几下→将 载片稍倾斜， 使菌液散开即可（ 切勿涂抹） 载片稍倾斜 ， 使菌液散开即可 （ 切勿涂抹 ） → 自然风干→ 固定。 自然风干→ 固定。
4、 硝酸银染色： 、 硝酸银染色：
2. 菌液的制备：菌龄较老的细菌容易失落 菌液的制备： 鞭毛， 鞭毛，所以在染色前应将待染细菌在新配制的 牛肉膏蛋白胨培养基斜面上连续移接3-5代， 牛肉膏蛋白胨培养基斜面上连续移接 代 以增强细菌的运动力。最后一代菌种放恒温箱 以增强细菌的运动力。 中培养12—16h。 中培养 。
3. 制片： 制片：