2-2-微生物工程菌种(4)

调查研究（包括资料查阅） 试验方案设计
筛 选 工 作 程 序
第一次原种斜面
采样 增殖条件探索 第一次增殖培养 第一次平板分离 第二次增殖培养 根据实际情况进 行定量或半定量 测定 第二次平板分离 第二次原种斜面 定量或半定量测定 初筛（1株1瓶）
第三次平板分离 第三次原种斜面 复筛 不纯 第四次平板分离 第四次原种斜面 初步工艺条件摸索 再复筛 1株3-5瓶 较优菌株 保藏及进一步做生产性能试 验或作为育种的出发菌株 某些必要试验和毒性试验 种子培养 第三次菌种保藏
通常指在较长时期传代保藏后，菌株的一个或多个生理 性状和形态特征逐渐减退或消失的现象。 1. 菌种退化主要表现:
形态上：分生孢子的减少或菌落颜色的改变 生理上：生产量下降或抗噬菌体能力减弱
2. 引起菌种退化的原因：
基因突变：主要原因（负突变） 连续传代：直接原因
二、防止菌种退化的方法
控制传代次数 合理的育种：单核（避免表型延迟） 选用合适的培养基 创造良好的培养条件 采用有效的菌种保藏方法及多种保藏方法
可显著提高分离筛选效率的方法有：
透明圈法
变色圈法
生长圈法
抑菌圈法
1、透明圈法
在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培 养基混浊； 能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明 圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。 分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉 酶、脂肪酶、核酸酶等；
2、变色圈法 对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物 平板中加入指示剂或显色剂，使目的微生物菌落周围 呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来；
1、出发菌株的选择
• 出发菌株的来源： 自然界直接分离到的野生型菌株 经历过生产条件考验的菌株。具备一定的生产形状， 对环境有好的适应性，正突变大。 已经历多次育种处理的菌株。损伤较大，负突变大 •选择第1或2类菌株，第2类较佳。
2、单细胞（或单孢子）悬液制备
一般均采用生理状态一致的单细胞或单孢子悬液 进行诱变处理。 因为 1）分散状态的细胞可均匀地接触诱变剂 2）可避免长出不纯的菌落。
诱变剂 （%）
土曲霉 土曲霉
紫外线+X-射线 氮芥+紫外线
5、变异菌株的筛选
由于经诱变处理后提高产量的变异株仍属少数，所以必 须经过大量的筛选工作，才能得到需要的菌株。
初筛 和 复筛
初
筛
要求迅速地从大量菌株中挑选出较好的一些菌，主 要应着眼于尽量扩大挑选范围。 在初筛过程中，一般采用观察初筛菌落在平板上的生 理效应所呈现的变色圈、透明圈、生长圈或抑菌圈的大 小来进行初步测定。 例如，测定突变株淀粉酶活力，可把待测菌株的培养液 以相同大小和条件浸泡的滤纸片点植于淀粉平板上，经 培养后滴加碘液再仔细观察并测定其透明圈的大小。
3、生长圈法
通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和 维生素的产生菌 指示菌（工具菌）是一些相对应的营养缺陷型菌株 将待检菌涂布于高浓度指示菌并缺少所需营养物的平板上进 行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌 落周围便会形成一个混浊的生长圈 如 嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混合倒平 板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生长圈的菌 落即为嘌呤产生菌
3、诱变剂及诱变处理
凡能引起生物体遗传物质发生变异的因素，统称诱变剂。
如紫外线、X-射线、β-射线、γ-射 线、快中子、激光、超声波、离子束 等 硫酸二乙酯(DES)、亚硝基胍 (NTG)、 亚硝酸(NA)、氮芥(NM)、羟胺、吖啶类 物质、2-氨基嘌呤等 噬菌体、转座子
物理诱变剂
诱变剂
化学诱变剂
分离耐高渗透压酵母菌，可到甜果、蜜饯、甘蔗渣堆积处采样
四、含微生物样品的富集培养 富集(enrichment)培养 是在目的微生物含量较少时，根据微生物的 生理特点，设计一种选择性培养基，创造有 利的生长条件，使目的微生物在最适的环境 下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然 条件下的劣势种变成人工环境下的优势种， 以利分离到所需的菌株。
诱变育种的原理 • 理论基础是基因突 变。 染色体畸 缺失、异位、倒位、重复
变： 基因突 变：
（点突变）
碱基对置换、突变
一）诱变育种的一般步骤
原始菌株（出发菌株）
细胞或孢子悬液制备 活细胞计数 诱变预备处理 诱变剂处理 活细胞计数 中间培养 突变株分离 初筛 复筛 生产性能试验
诱 变 育 种 的 工 作 程 序
五、目的菌种的分离与筛选
分离的效率取决于培养基养分、pH值和加入的 选择性抑制剂。 分离与筛选常用的方法是利用固体平板的生化 反应进行分离 。其分离要点有二：
利用特殊的分离培养对大量混杂微生物进行初步分 离的方法。 分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性或利 用某些代谢产物生化反应来设计的。
通常有两种方法：
自然突变两种情况： 生产上所不希望的：菌种的衰退和生产质量下 降 对生产有益的：
生产性能提高
自然选育的一般程序： 制备单孢子（单细胞）悬液 适当稀释 在固体平板上分离 挑取部分单菌落进行生产能力测定 经反复筛选以确定生产能力更高的菌株替代原来的菌株
自然选育简单易行，可以达到纯化菌种、防止菌 种衰退、稳定生产、提高产量等目的。
了解概念，其他内容不作考试内容
四、原生质体融合育种
原生质体融合（protoplast fusion）：是通过人 工方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发 生融合，并产生重组子的过程，又称为“细胞融合” （cell fusion）
了解概念，其他内容不作考试内容
第四节 菌种退化和菌种保藏
菌种退化 一、菌种退化
三、含微生物样品的采集
较复杂；应根据分离目的灵活掌握 土壤（丰富、 5-25cm、土质、酸碱度、植被状况、地理条件、季节） 食品 、海水、动物、植物、极端环境
根据微生物的营养类型采样
森林土中有相当多枯枝落叶和腐烂的木头，富含纤维素， 肉类加工厂附近、饭店排污沟，易分离到蛋白酶和脂肪酶 适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长。 产生菌。 根据微生物的生理特性采样 面粉加工厂等场所易分离到产淀粉酶、糖化酶的菌 筛选高温酶产生菌通常从温泉、火山爆发处、堆肥等采样； 筛选产低温酶的微生物，可从冰窖、南极、深海等采样
Chapter 2 continued
第二节 菌种来源
生产菌种的性能 微生物工程工业生产水平 的三个决定要素: 发酵和提取工艺条件 生产设备
获得优良的生产菌种是实现高水平微生物工程工业生产的 第一环节.
一、菌种分离与筛选工作程序
发酵工业上使用的微生物菌种，最初都是从自然界中 分离筛选出来的。 分离与筛选菌种的具体做法一般分4个步骤： 样品采集 增殖培养 纯种分离 生产性能测定
自然选育 诱变育种 杂交育种 (有性、准性) 原生质体融合育种 基因工程育种
一、自然选育
在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变 而进行菌种筛选的过程叫自然选育。 自发突变(spontaneous mutation)，也称自然突变，指某些 微生物在没有人工参与下所发生的那些突变，但这决不意味 着这种突变是没有原因的。
生物诱变剂
诱变处理
确定诱变剂后，诱变剂剂量的选择也是育种工作的一个关键问题。 通常在诱变处理之前，做诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线， 从而选择合适的处理剂量。
对一般微生物而言，突变率往往随诱变剂剂量的增高而 增高，但达到一定程度后，再提高剂量，反而会使诱变率 下降。 处理高剂量致死率90-99.9%；低剂量到70-80%；更低剂 量30%-70% 凡既能增加变异幅度，又能促使变异向正变范围移动 的剂量就是合适剂量。
定义：
菌种选育
应用微生物遗传和变异理论，用人工方法(或自然变异的 方法)造成变异，再经过筛选以得到人们所需菌种的过程 。 菌种选育的目的是：a.为了不断提高发酵工业产品的产 量和质量；b.增强对所用原辅料的适应性；c.增强对不良 培养条件的抵抗；d.缩短生产周期；e.简化发酵和下游处 理工艺。 菌种选育的方向是选育“吃粗粮”、耐高温、生长快、 代谢旺、产量高、质量好、无毒性的优良菌株。
第二 轮：
诱变处理 5个出发菌株
40株 40株 40株 40株 40株 每株1瓶 初筛 50 株 每株4瓶 复筛 5株
三、杂交育种（hybridization）
定义：一般指人为利用真核微生物的有性生殖 或准性生殖，或原核微生物的接合、F因子转 导、转导和转化等过程，促使两个具不同遗传 形状的菌株发生基因重组，以获得性能优良的 生产菌株。
自然选育的最大缺点是效率低、进展慢，很难 使生产水平大幅度提高。
二、 诱变育种
诱变育种就是利用物理或化学诱变剂等处理均匀分散
的微生物细胞群，促使其突变率大幅度提高，然后采用简 便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目标 的突变株用于生产和研究。 诱变育种不仅可以提高菌种的生产能力，且可改进产品 质量、扩大品种和简化生产工艺。 目前发酵工业中应用的生产菌株大部分是诱变育种得来 的。以青霉素为例，1943年开始生产时的效价仅为20U/ml，通 过多次诱变育种现已达50000-100000U/ml。 虽然遗传工程等新的育种方法迅速发展，但诱变育种仍是目 前广泛使用的育种手段。
二、分离与筛选的设计要求
在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标：
1、菌的营养特征 2、菌的生长温度 3、菌的稳定性
一般要求采用廉价的培养基或使用来源丰 富的原料
4、菌的产物得率和产物在培养液中的浓度 5、菌对所采用的设备和生产过程的适应性 6、容易从培养液中回收产物 3-6是用来衡量菌种的生产性能，如能满足这几条，便 有希望成为效益高的生产菌株
处理前，细胞应尽可能达到同步生长状态 细胞菌龄一般在对数期， 霉菌的Baidu Nhomakorabea丝一般是多核的，所以对霉菌的处理一 般应采用孢子悬浮液。 表型迟延现象：指某一突变在DNA复制和细胞分裂后， 才在细胞表型上显示出来，造成不纯的菌落的现象。 （如多核） 生理性延迟现象：菌体虽然发生了突变，并且突变基 因由杂合状态变成了纯合状态，但仍然不表现突变形 状。如营养缺陷型
其要领是提供一些有利于所需菌株生长或不利于其 他菌型生长的条件，例如，供给特殊的基质或加入某些 抑制剂。 控制氧可将好氧微生物和厌氧微生物分开； 在分离培养中加入抗生素或某试剂可增加选择性 高温下培养可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开； 如分离真菌可在土豆培养基中加入链霉素； 控制pH可分离嗜酸或嗜碱微生物； 分离细菌或放线菌可在培养基中加入制霉菌素等 高糖或高盐培养基可分离耐高渗透压微生物；
4、抑菌圈法
常用于抗生素产生菌的分离筛选 据估计，筛选1万个菌株才能得到1株有用的抗生素 指示菌采用抗生素的敏感菌 产生菌；因此，设计一个准确、快速的筛选模型十 分重要。 抑菌圈法是常用的初筛方法 若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等， 便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈
第三节
复
筛
在初筛缩小了的范围中选出产量最高的1-2个菌株，主 要着眼于在接近生产条件的情况下精确地测定出菌株的生 产性状。 复筛一般是将初筛所得到的菌株接种到三角瓶中做 摇瓶培养，然后对其培养液进行定量分析测试。
第一 轮：
诱变处理 1个出发菌株 200个单细胞菌株 每株1瓶 初筛 50 株 每株4瓶 复筛 5株
• 涂布法
将菌液梯度稀释后以灭菌的涂布器涂布于平板培养 基表面。（易污染菌落，且一种菌/平板）
• 影印平板法
把长有许多菌落的母培养皿倒置于包有灭菌丝绒布 的圆木柱上，然后把这一“印章”上的细菌一次接种 到一系列选择培养基平板上。（不适用不长孢子的 链霉菌和游动细菌）
不管是哪种方法，都有其优缺点；故要根据 自己的实验目的设计一种更为有效的分离筛选新 菌种的方法。
处 理 方 法 单一诱变剂处理 1）两种或多种诱变剂先后使用 2）同一诱变剂重复处理 3）两种或多种诱变剂同时使用
复合处理
诱变剂的复合处理及其协同效应 菌种 单独处理 诱变剂 突变率 （%） 紫外线 X-射线 氮芥 （0.1%） 紫外线 链霉菌 金色链霉菌 紫外线 γ-射线 二乙烯三胺 硫酸二乙酯 紫外线 31.0 35.0 6.06 1.78 12.5 紫外线+γ-射线 二乙烯三胺+紫外线 硫酸二乙酯+紫外线 43.6 26.6 35.9 21.3 19.7 不明显 4.7 复合处理 突变率 42.8 11.0