实验五过氧化物同工酶PAG讲义E分析

四、操作步骤
装槽、上样
30-50μL
四、操作步骤
电泳 接好电源线(上槽接负极，下槽接正极)。
打开电源开关，调节电压，以10V/cm稳 定电压电泳，待前沿指示染料溴酚蓝下行 至距胶板末端1-2 厘米处，即可停止电泳。
四、操作步骤
剥胶、染色
电泳结束之后，将垂直板从电泳槽上取 下，小心地将两块玻璃板分开，并小心地 将凝胶置于染色盒中，进行染色反应，染 色10min，用蒸馏水漂洗1-2次。
浓缩效应：凝胶为不连续系统（凝胶层、pH、 电位梯度均不连续），从而使样品浓缩在一个 极窄的起始区带，即所谓浓缩效应，提高了条 带分辩率。（只有不连续凝胶具有此效应）
（二）过氧化物同工酶及其活性染色（P98）
同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的 分子结构及其理化性质不同的一组酶。
同功酶是机体调节酶活性的一种方式，在各种生物体中 广泛存在。
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。 它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。 在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。因Байду номын сангаас， 测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某 一时期植物体内代谢的变化。
（二）过氧化物同工酶及其活性染色（P98）
聚丙烯酰胺凝胶配方
成分
含量
作用
A液（30%Acr-0.8%Bis） 2.65mL
交联剂
B液（Tris+EDTA） 4.75mL
缓冲液
C液（TEMED）
10μL
加速剂
D液（10% AP）
50μL
催化剂
四、操作步骤
样品制备 称取小麦幼苗叶片0.5 克，放入研钵内，
加 pH8.0 样品提取液1mL，于冰浴中研 成匀浆，转入离心管，在高速离心机上以 8000rpm 离心 10 分钟，倒出上清液， 以等量 40%蔗糖混合，并加2滴溴酚蓝， 即为样品液。
实验五过氧化物同工酶PAGE分析
一、目的
掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术 的原理和操作方法
掌握PAGE法分离过氧化物同工酶的原理 和方法
二、原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 过氧化物同工酶及活性染色
（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） P20
1.电泳概念
电泳：带电粒子在电场中向与其电性 相反的电极移动的现象。
三、材料、仪器和试剂
试剂：
A液：30%Acr-0.8%Bis B液：Tris+EDTA C液：TEMED D液：10%AP 电极缓冲液：硼酸钠-硼酸（pH8.3） 0.5%溴酚蓝 染色液：0.1%联苯胺 样品提取液：pH8.0Tris-HCl缓冲液 40%蔗糖溶液
四、操作步骤
凝胶制备
反应过程
TEMED催化AP生成硫酸自由基
S2O82－
2SO4·¯
硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体 长链：
Bis将单体长链间连成网状结构：
PAGE法分离蛋白质的三种效应
电荷效应：各种蛋白质分子所带电荷不同，在 同一电场中泳动率不同；
分子筛效应；蛋白质分子大小和形状各不相同， 在通过一定浓度（一定孔径）凝胶时受阻力各 不相同，泳动率也不相同；
五、结果与分析
结果 电泳图或模式图
分析 过氧化物同工酶的种类及活力大小
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（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
2.电泳分类 显微电泳 自由界面电泳 区带电泳
– 纸电泳 – 醋酸薄膜电泳 – 琼脂糖凝胶电泳 – 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
3.电泳法原理
在一定条件下，任何带点颗粒都有自己特定的 电泳迁移率。影响电泳迁移率的因素： 颗粒性质：
本实验采用PAGE技术，分离小麦幼苗过氧化物 酶同工酶，根据酶的生物化学反应，通过染色方 法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化 物酶同工酶。
H2O2
过氧化物+过氧化物酶 → 复合物
复合物+DH2 → 过氧化物酶 +H2O+联D苯胺
棕色物质
三、材料、仪器和试剂
材料：小麦幼苗
仪器：电泳仪、 电泳槽、高速离 心机、量筒、烧 杯、微量注射器、 研钵、染色盒
– 净电荷数目 – 颗粒大小 – 颗粒形状
电场强度：V/cm 溶液性质：
– 缓冲液的pH – 离子强度 – 溶液黏度 – 电渗：液体对固体支持物的相对移动
（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
4.聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联 剂N,N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）和催化剂过硫 酸铵（AP）的作用下聚合交联成三维网状结构的 凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝 胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis， 简称PAGE)