菠萝蛋白酶提取
菠萝蛋白酶纯化方法总结
菠萝蛋白酶的提取方法：（1）沉淀法沉淀法是粗提酶蛋白的方法之一，主要用于前期酶的初步分离和浓缩，常用的方法有盐析法，有机溶剂沉淀法，聚乙二醇沉淀法，等电点沉淀法等。
用新型吸附洗涤沉淀法和单宁沉淀法也可以提取菠萝蛋白酶，操作简单，产率也较高，但酶的产量与单宁的用量密切相关，而且所含单宁有毒，导致这种方法逐渐被淘汰了。
以酒精为沉淀剂提取菠萝蛋白酶时，酒精的加入量会对菠萝蛋白酶产生较大的影响，酒精的浓度太低时，不能使菠萝蛋白酶沉淀下来，浓度太高容易使酶变性失活。
酒精的浓度为80%时，酶的收率最高。
从茶叶中提取的多酚类物质茶多酚也可用于菠萝蛋白酶的分离，用0.5%的茶多酚提取物对菠萝汁中菠萝蛋白酶进行沉淀最多可达78%，其最大沉淀率明显比单宁法高。
（2）离子交换色谱法离子交换色谱层析法是蛋白质研究领域内比较高效的纯化技术，目前国外用于分离菠萝蛋白酶常用的离子交换剂有Sephacryl S-200柱、Mono S阳离子交换剂、S-Sepharose、弱酸性阳离子交换树脂、CM-纤维素阳离子交换柱、Q阴离子交换柱。
国内常用的有羧甲基纤维素（CMC）、二乙胺乙基纤维素（DEAE），酶的纯化过程通常是将若干色谱纯化技术联合使用来实现的。
Ota最早用SephadexG-75结合CM-SephadexC-25柱层析分离得到5种茎酶的组分。
用DEAE-52离子交换柱层析结合Sephadex G-75分子筛柱层析色谱法纯化果酶，能获得比活力为12.5U/mg的单一电泳纯酶制剂。
（3）固定化金属离子亲和色谱法固定化金属离子亲和色谱法是以普通凝胶作为载体，连接上合适的螯合配体和足够暴露的金属离子，制成亲和吸附剂，进行分离纯化蛋白质的方法。
此法介于高特异性的生物亲和分离法和低特异性的离子交换色谱法之间，对组氨酸基团有特异性。
Huali Nie 等（2008）首次应用固定化金属亲和膜（IMAM）—肽-尼龙膜，这是一种将七肽共价固定到复合膜上作为配体的新型尼龙膜，用其从菠萝中分离和提纯菠萝蛋白酶，可使菠萝蛋白酶纯化15.4 倍，回收率达94.6%，而且不会造成任何变性。
菠萝蛋白酶的提取、初级纯化及活性鉴定
2、测酶活试剂 （1）1%酪蛋白（pI4.8）：200ml。
用0.1 mol/L PBS pH7.8配，50-55℃水浴溶解，不停搅 拌，需1h才能溶解。 2g酪蛋白+200ml PBS（0.1 mol/L pH7.8）。
（2）激活剂 100ml（现配现用）
20 mmol/L半胱氨酸-盐酸盐，1 mmol/L EDTA-Na，用 0.1 mol/L pH7.8 PBS配制至100ml。
2、蛋白质的分离纯化方法：
(一)沉淀法 • 盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、聚 乙二醇（PEG）沉淀法等。
• 在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而升 高，这种现象称为盐溶。 • 但当盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐下降， 直到某一浓度时便从溶液中沉出，即为盐析。
•一般进行蛋白质沉淀时，选用的盐是硫酸铵。 优点： ①溶解度大，对温度不敏感； ②分级效果好； ③有稳定蛋白质结构的作用； ④价格低廉。 缺点：盐浓度含量高。
（3）5%TCA（三氯乙酸）：200ml。
3、透析袋处理 • 将10 cm长的透析袋置于1000ml含1mmol/L EDTA-Na2的2%碳酸氢钠溶液中煮沸10min后，用 干净镊子取出，经蒸馏水煮沸、漂洗，即可使用。
四.实验步骤
1、粗酶提取 生菠萝皮（每一组） 30g+50ml PBS 0.1 mol/L pH7.8 ↓ 电动搅拌 ↓ 2～4层纱布过滤于烧杯中 ↓ 分装于离心管（10ml/管） ↓
2、酶活测定方法（每组）
试剂 TCA(ml) 酪蛋白（ml） 酶液（ml） 激活剂（ml） TCA(ml) A275石英比色杯 酶活（U） 酶活（U）平均 值 0 0 对照(调零) 3 1 0.1 0.9 实验1 — 1 0.1 0.9 3 静置 5min 滤纸过滤 实验2 — 1 0.1 0.9 3 实验3 — 1 0.1 0.9 3
从菠萝中提取菠萝蛋白酶
从菠萝中提取菠萝蛋白酶
菠萝蛋白酶是一种有机物，也称为溶菌酶或蛋白水解酶。
它的特点是可以分解蛋白质，具有较强的酸性和碱性环境适应能力，因此，广泛应用于医疗、食品、化妆品等领域中。
从菠萝中提取菠萝蛋白酶是一项艰巨的任务。
以下是一些步骤：第一步是采集新鲜的菠萝果肉。
必须选用成熟度好的金丝菠萝果肉。
应选择外皮金黄色、果肉红黄相间的菠萝果肉。
第二步是制备浸出液。
将新鲜的菠萝果肉去皮、去核，切成小块，加入适量的水，搅拌并煮沸，经过静置、过滤，即可得到浸出液。
第三步是提取菠萝蛋白酶。
将制备好的浸出液冷藏，待其沉淀，将上层的冰冷水慢慢倒出，留下沉淀。
然后，在沉淀中加入适量的酸性酶解剂，轻轻摇晃，放置几小时。
第四步是酶活测定。
将提取的菠萝蛋白酶放在适宜的酶活测定条件下，如适宜的温度和酸碱度等，测定其活性或浓度。
以上是从菠萝中提取菠萝蛋白酶的一些步骤。
菠萝蛋白酶的应用范围广泛，可用于肉制品、啤酒、乳制品、水产品等食品中。
同时，它还能被用于医疗和化妆品领域，例如用于抗肿瘤、消炎、增加皮肤弹性等。
因此，菠萝蛋白酶的提取十分重要，细节决定了酶的纯度和活性，也影响到菠萝蛋白酶在不同领域中的应用。
菠萝蛋白酶的提取与活力测定
上清液 沉淀物
加100ml0.1%EDTA溶液， 200ml1.5%氯化钠液
4200r/min,5min离心
氯 化 钠 溶
酶复合物 10
在提取菠萝蛋白酶时,添加单宁溶液的浓度为0. 2 %沉淀蛋白的效果最好,同时 果汁的总酸度不大,糖酸比合适,菠萝汁中菠萝蛋白酶的沉淀率达到72%。菠萝蛋 白酶提取时,pH值为6. 5～8.5左右,温度为6 0℃,菠萝蛋白酶的活性最强 ,可作为最 佳提取条件。
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计算酶的比活性 • 酶的比活性 • （F.I.P.-U/mg)=E275/(Ew×0.116×10） • E275——275nm处得吸光度 • Ew——每2.5ml所用酶液中含酶的重量，mg • 0.116——275nm处酪氨酸溶液（1umol酪氨酸/10ml）的吸光度 • 10——反应时间，min
•
温度范围： 50～60℃
•
作用PH值: 6.0～9.0
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三、实验材料和试剂 1、实验材料
新鲜菠萝(下脚料）、0.1mg/ml牛血清蛋白 2、实验试剂 柠檬酸钠 维生素C 单宁 0.1%EDTA溶液 1.5%氯化钠溶液 1%酪蛋白溶液 1mol/L氢氧化钠溶液 0.05mol/L磷酸缓冲液（溶解磷酸二氢钾，加氢氧化钾调PH至7.0） 激活剂（PH7.0，0.05mol/L磷酸缓冲液，内含15mmol/L硫代硫酸钠和6mmol/LEDTA2Na,现配现用）
工艺流程： 菠萝下脚料→压榨→汁液→去杂质→澄清液→超滤浓缩→浓缩液→降温→加有机溶
剂沉淀（ 95%乙醇）→湿酶→减压干燥→酶制品
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谢谢观赏
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二、菠萝蛋白酶在医药、保健品
• 1、抑制肿瘤细胞的生长 • 2、对心血管疾病的防治 • 3、用于烧伤脱痂 • 4、消炎作用
菠萝蛋白酶提取液
菠萝蛋白酶提取液简介：菠萝蛋白酶(Bromelain)简称菠萝酶，亦称凤梨酶、凤梨酵素等，是存在于菠萝植株中的蛋白水解酶，可从菠萝果茎、叶、皮提取出来，经精制、提纯、浓缩、酶固定化、冷冻干燥而得到，菠萝蛋白酶已被广泛应用于食品、医药等行业。
利用吸附力、离子键、共价键等不同的联结方式，将酶与不溶性载体联结，制成固定化酶，可以很好的避免酶的失活，易于储存运输。
Leagene 菠萝蛋白酶提取液主要用于裂解植物组织，提取样品中的菠萝蛋白酶。
该试剂仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：自备材料：1、 蒸馏水2、 离心管或试管操作步骤(仅供参考)：1、取g 菠萝肉或植物组织，切碎后在研钵或匀浆器中加入等体积组织匀浆液进行研磨或匀浆。
2、静置，滤纸过滤或纱布过滤。
3、留取滤液，边搅拌边加入Bromelain Lysis buffer ，搅拌，静置。
4、离心，弃上清液，收集沉淀，加入Bromelain 洗脱液，搅拌洗脱。
5、离心，取上清液，冻存，用于组织匀浆液的检测或其他用途。
计算：组织或植物粗酶液获得率(ml)=上清液体积(ml)/组织或植物质量×100% 注意事项：1、 待测样品中不能含有磷酸酶抑制剂，同时需避免反复冻融。
编号 名称 CS0411 2×500ml Storage 试剂(A): 组织匀浆液 500ml 4℃ 试剂(B): Bromelain Lysis buffer 500ml 4℃ 避光 试剂(C): Bromelain 洗脱液 100ml 4℃ 使用说明书 1份2、所测样本的值高于标准曲线的上限，应用菠萝蛋白酶稀释样品后重新测定。
3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期：6个月有效。
相关：编号名称CC0007 磷酸缓冲盐溶液(10×PBS,无钙镁)CS0001 ACK红细胞裂解液(ACK Lysis Buffer)DC0032 Masson三色染色液DF0135 多聚甲醛溶液(4% PFA)NR0001 DEPC处理水(0.1%)PS0013 RIPA裂解液(强)TC1167 尿素(Urea)检测试剂盒(脲酶波氏比色法)。
菠萝蛋白酶提取
菠萝蛋白酶提取一、实验目的：1、了解菠萝蛋白酶的提取和纯化工艺2、优化和加深熟悉菠萝蛋白酶提取技术二、实验原理：菠萝蛋白酶(Bromelain，简称菠萝酶，亦称为凤梨酶或凤梨酵素)是从菠萝果茎、叶、皮提取出来，经精制、提纯、浓缩、酶固定化、冷冻干燥而得到的一种纯天然植物蛋白酶。
其外观为浅灰色粉末状，分子量为33000 ，等电点为9.55 。
品质最佳的菠萝蛋白酶是利用菠萝的中茎加工,采用超滤方法进行过滤浓缩,低温冷冻干燥而得的。
产品已被广泛应用于食品、医药等行业。
结果表明。
提取菠萝中菠萝蛋白酶最佳提取工艺条件是添加单宁溶液的浓度为0．2％，提取时最适pH值为6．5～8．5左右，而最适提取温度为60℃。
菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化，啤酒澄清，还用于干酪、明胶及水解蛋白的生产。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症；它能迅速溶痂，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中小面积深度烧伤的治疗。
三、实验步骤操作要点：菠萝蛋白酶的提取称取1 kg制备好的鲜果皮汁，加5％苯甲酸钠溶液10 ml搅匀，以4 000 r／min离心7 min，取上清液倒人干净烧杯中。
上清液分装在6个小烧杯中，每个装100 ml菠萝汁，分别缓缓加入空白、0．1％、0．2％、0．3％、0．4％、0．6％单宁溶液10 ml，边加边拌约1 5min，沉淀物析出，静止40 min。
虹吸除去上清废液，把酶复合沉淀物倒入离心杯中，以4 000 r／min。
离心5 min，倒掉上清废液，得到酶糊复合物。
分离、洗涤和保护把提取的蛋白酶糊倒人烧杯中，加0．1％EDTA溶液100 ml搅匀，再将1．5％氯化钠溶液200 ml倒人烧杯中搅匀，以4 000 r／min离心7 min，倒掉上清废液，得到洗涤剂I酶复合沉淀物。
把洗涤剂I酶复合沉淀物倒入烧杯中，加0．5％乙酸锌溶液20 min，搅拌均匀，静止5 min，加0．06％抗坏血酸溶液30 ml，搅匀，静止5 rain，加1．5％氯化钠溶液20 ml，搅匀，静止5 min，最后再加0．5％EDTA溶液20 ml，搅匀，静止5min，以4 000 r／min离心7 min，把上清废液倒掉，得到洗涤剂Ⅱ酶复合沉淀物。
菠萝蛋白酶提取
菠萝蛋白酶提取摘要：，运用盐析法从菠萝皮中提取菠萝蛋白酶，对菠萝蛋白酶的提取工艺及其影响因素进行了研究，并对提取后得到的菠萝蛋白酶进行测定。
关键词：菠萝皮，菠萝蛋白酶，白陶土吸附，盐析法一目的要求：学习盐析法提取菠萝蛋白酶的方法二实验原理菠萝蛋白酶(bromelain)是从菠萝植株中提取的一类蛋白水解酶的总称, 主要存在于菠萝茎和果实中,根据提取部位的不同, 分为茎菠萝蛋白酶和果菠萝蛋白酶。
物理性质：白色至浅棕黄色无定形粉末。
溶于水，水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚。
是一种糖蛋白, 一般提取用的酶源是凤梨，但是价格较贵。
而用菠萝皮，不但可以减少资源的浪费，降低费用，又能减少环境的污染。
蛋白质在水溶液中的溶解度由蛋白质周围。
集聚而沉淀（实验书第3页）盐析法提取菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶是典型的巯基蛋白酶，是一种分子量为33000u的蛋白质，硫酸铵是强电解质，有强烈的水化作用，可破坏蛋白质颗粒表面的水化膜，并能中和蛋白质颗粒所带的电荷，使蛋白质在溶液中凝聚而析出但只有达到蛋白质等电点时，其才易于沉淀对于菠萝蛋白酶来说，使用盐析法提取是比较理想的一种方法，也使用得最广泛。
其基本原理是：因不同的蛋白质在高浓度的盐溶液中溶解度不同而能分离。
此法简便、安全白色至浅棕黄色无定形粉末。
溶于水，水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚。
属糖蛋白。
三实验材料1试剂70%-80%成熟度的无刺卡因品种菠萝皮20g 高岭土化学纯品(用于作为吸附剂)、95%乙醇无水乙醇碳酸钠饱和溶液硫酸铵粉末14% NaCl溶液0.05%的苯甲酸钠(作为防腐剂)2实验仪器天平，砝码一套100ml量筒一个，50ml烧杯4个，滴管，玻璃棒，离心管2支高速组织捣碎机低速离心机一台四实验方法（1）滤液制备以全班为单位，选取干净的菠萝皮160g，除杂，在清水中漂洗三次，沥干，放入冰箱4℃冷冻备用-------用不锈钢剪刀将菠萝皮剪成碎片，放入高速组织捣碎机中，制备匀浆，打碎后的匀浆用纱布过滤，并150ml 95%乙醇进行第二次浸提、过滤合并两次滤液,滤液添加lml0.05%的苯甲酸钠，实验两人一组，每组取10ml左右于50ml小烧杯中（2）吸附、洗脱滤液置于冰水浴中，不断搅拌，加入汁液量 4%的白陶土搅拌20min，在10℃吸附15~20min ，于冰箱中4℃静置过夜，次日清晨虹吸除去上清液，留下湿陶土，加入冰冷的碳酸钠饱和液调节 PH6.5~7，再加入吸附物重50%的硫酸铵粉末，于冰水浴中振摇 40min进行洗脱，然后压滤，弃去杂物，收集洗脱滤液(3) 待测酶制备将上述洗脱液分装入2支离心管中，每两管天平平衡，3000转离心20min，用吸管吸取下层清液弃去，加入等体积14%NaCl沉淀（盐析），5min后2000r/min 离心10min，弃上清液，用95%乙醇沉淀洗涤一次，2000转离心10min，弃去上清液，用用无水乙醇沉淀洗涤一次，2000转离心10min，弃去上清液，用保鲜膜封口，膜上扎5~10个小孔，放入真空干燥器中干燥。
[菠萝蛋白酶提取]果菠萝蛋白酶的提取失败原因
![[菠萝蛋白酶提取]果菠萝蛋白酶的提取失败原因](https://img.taocdn.com/s3/m/8ea02ca0ed630b1c59eeb5dd.png)
[菠萝蛋白酶提取]果菠萝蛋白酶的提取失败原因菠萝蛋白酶提取一、实验目的：1、了解菠萝蛋白酶的提取和纯化工艺2、优化和加深熟悉菠萝蛋白酶提取二、实验原理：菠萝蛋白酶(Bromelain，简称菠萝酶，亦称为凤梨酶或凤梨酵素)是从菠萝果茎、叶、皮提取出来，经精制、提纯、浓缩、酶固定化、冷冻干燥而得到的一种纯天然植物蛋白酶。
其外观为浅灰色粉末状，分子量为 33000 ，等电点为 9.55 。
品质最佳的菠萝蛋白酶是利用菠萝的中茎加工,采用超滤方法进行过滤浓缩,低温冷冻干燥而得的。
产品已被广泛应用于食品、医药等行业。
结果表明。
提取菠萝中菠萝蛋白酶最佳提取工艺条件是添加单宁溶液的浓度为0．2％，提取时最适pH值为6．5～8．5左右，而最适提取温度为60℃。
菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化，啤酒澄清，还用于干酪、明胶及水解蛋白的生产。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症；它能迅速溶痂，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中小面积深度烧伤的治疗。
三、实验步骤操作要点：菠萝蛋白酶的提取称取1 kg制备好的鲜果皮汁，加5％苯甲酸钠溶液10 ml搅匀，以4 000 r／min离心7 min，取上清液倒人干净烧杯中。
上清液分装在6个小烧杯中，每个装100 ml菠萝汁，分别缓缓加入空白、0．1％、0．2％、0．3％、0．4％、0．6％单宁溶液10 ml，边加边拌约1 5min，沉淀物析出，静止40 min。
虹吸除去上清废液，把酶复合沉淀物倒入离心杯中，以4 000 r／min。
离心5 min，倒掉上清废液，得到酶糊复合物。
分离、洗涤和保护把提取的蛋白酶糊倒人烧杯中，加0．1％EDTA溶液100 ml搅匀，再将1．5％氯化钠溶液200 ml倒人烧杯中搅匀，以4 000 r／min离心7 min，倒掉上清废液，得到洗涤剂I酶复合沉淀物。
把洗涤剂I酶复合沉淀物倒入烧杯中，加0．5％乙酸锌溶液20 min，搅拌均匀，静止5 min，加0．06％抗坏血酸溶液30 ml，搅匀，静止5 rain，加1．5％氯化钠溶液20 ml，搅匀，静止5 min，最后再加0．5％EDTA溶液20 ml，搅匀，静止5min，以4 000 r／min离心7 min，把上清废液倒掉，得到洗涤剂Ⅱ酶复合沉淀物。
菠萝中提取蛋白酶
注意事项
菠萝蛋白酶易受热失活，应低温短时生产， 一般在0℃左右进行。 某些化学药品和金属离子易引起菠萝蛋白酶 失活，生产过程忌碱、忌强酸作用，勿与铁、 铜等重金属接触。 菠萝蛋白酶是一种胶体，生产过程中易产生 气泡造成损失，所以生产过程应注意操作。
THE END 谢谢欣赏！
准备知识
菠萝茎和菠萝皮的含水量都达到85％以上， 但菠萝茎的榨汁率比菠萝皮的榨汁率低。菠萝皮 和菠萝茎中的糖分含量占总干重的80％左右，其 中菠萝茎中淀粉占总糖份量的一半。离心可以有 效去除榨汁中的不溶物质及菠萝茎中的淀粉，能 部分去除果胶，对一些大分子悬浮物质去除困难。
背景知识
菠萝蛋白酶在避光、低温条件下贮藏的酶活 力损失最小。在55℃时具有最高的蛋白酶活 性，40℃以上条件下酶活半衰期在2h以内， 其热变性温度在55℃和60℃之间。 金属离子对菠萝蛋白酶的酶活力具有影响， Ca2+引起的酶的失活速度最快；Fe2+和Cu2+对 酶活力影响最大。
结果讨论
3、菠萝蛋白酶对热不稳定，试验中温度的控制是否 、菠萝蛋白酶对热不稳定， 合理； 合理； 4、在活力测定的步骤中所加入的酪蛋白的量不足， 、在活力测定的步骤中所加入的酪蛋白的量不足， 导致结果偏低； 导致结果偏低；
从菠萝中提取菠萝蛋白酶
从菠萝中提取菠萝蛋白酶
菠萝蛋白酶是一种常见的蛋白酶，它可以在菠萝中找到。
菠萝蛋白酶可以分解蛋白质，因此在食品、医药和日化等行业中有广泛的应用。
提取菠萝蛋白酶的方法有很多种，其中最常用的是浸提法和萃取法。
浸提法是将菠萝切碎，放入含有酸性物质的溶液中浸泡，使菠萝蛋白酶释放出来。
萃取法则是利用有机溶剂将菠萝中的菠萝蛋白酶提取出来。
提取菠萝蛋白酶后，可以通过一系列的分离纯化步骤来获得高纯度的菠萝蛋白酶。
这些步骤包括超滤、离子交换层析和凝胶过滤等。
除了用于医药和食品工业中，菠萝蛋白酶还可以用于日常生活中，例如在洗涤剂中添加菠萝蛋白酶可以去除衣物表面的蛋白质污渍，同时不会损伤衣物。
因此，提取菠萝蛋白酶对于提高生活质量和促进工业发展来说都具有重要意义。
- 1 -。
菠萝蛋白酶的提取实验报告
菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定12食安2班陈志廉摘要本文阐述了通过运用高速离心法提取粗酶，盐析分离提纯，透析除杂等方法提取出了菠萝蛋白酶并将其初步分离纯化且测定了各个步骤的酶活性的过程。
关键词菠萝蛋白酶纯化酶活性前言菠萝蛋白酶（Bromelain，EC3.4.22.3）简称菠萝酶，是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶，1891年Mercaro于菠萝的汁中首先发现。
在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。
菠萝蛋白酶来可以用来增加豆饼和豆粉的PDI值和NSI值，从而生产出可溶性蛋白制品及含豆粉的早餐、谷类食物和饮料。
其它还有生产脱水豆类、婴儿食品和人造黄油；澄清苹果汁；制造软糖；为病人提供可消化的食品；给日常食品添味等。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症，并有助消化，健胃消食等功能。
菠萝蛋白酶属于糖蛋白，是由巯基蛋白酶和非蛋白酶组分构成的复杂复合物，因含有一个不稳定的游离巯基，所以菠萝蛋白酶极易被氧化而使其酶活下降。
本文主要验证了从新鲜菠萝皮中提取菠萝蛋白酶并将之纯化的方法，以求改进工艺等。
1实验材料与仪器1.1实验材料与试剂新鲜菠萝、0.1mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、0.01mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、1％酪蛋白、激活剂、10％三氯乙酸(TCA)、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G2501.2实验仪器722型可见光分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；752型光栅分光光度计：北京光学仪器厂；TDL-60B台式离心机：上海安宁科学仪器厂；D5M离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司；DK-8D电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；可控硅恒温水浴锅：上海锦屏仪器仪表有限公司；AMPUT电子天平：深圳安普特科技有限公司；BS110S分析天平北京赛多利斯天平有限公司；DS-1型高速组织捣碎机：上海标本模型厂；HZS-H型水浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司2实验方法2．1菠萝蛋白酶的粗酶提取称取菠萝皮材料30g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高速搅拌机中，加入约60mL预冷的0.1mo1/L pH7.8PBS，持续搅拌10~15min至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4°C3000rpm 离心6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性。
菠萝蛋白酶提取纯化及化学修饰对其活性的影响
菠萝蛋白酶提取纯化及化学修饰对其活性的影响中国药科大学药学院 09级药化一、实验目的1、了解菠萝蛋白酶的提取方法2、研究菠萝蛋白酶的稳定性3、了解菠萝蛋白酶的纯化4、了解菠萝蛋白酶的化学修饰5、修饰酶与未修饰酶的活性比较二、实验原理菠萝蛋白酶是典型的巯基蛋白质,广泛存在于菠萝果实、芽、叶、茎中,分子量为33 000 , 等电点为9.55，白色至浅棕黄色无定形粉末，溶于水。
水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚。
属糖蛋白，能分解蛋白质、脂类和酰胺等。
它作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化、啤酒澄清. 还用于明胶、水解蛋白的生产,在医药上它可在生物体内溶解纤维蛋白及血凝块。
因此可以治疗水肿及多种炎症,它能迅速溶痂。
对正常组织无害,不影响植皮,适用于中小面积深度烧伤的治疗。
本实验先从新鲜的菠萝汁中使用有机酸（单宁）沉淀法提取菠萝蛋白酶，糖类、多元醇使得酶的稳定性得到增强。
三、实验材料1、材料：新鲜的成熟菠萝2、仪器：榨汁机、离心机、紫外分光光度计、恒温水浴锅、氯化钙的干燥器、CM Sepharose FF 凝胶（1.1cm×30.0cm）、研钵、滴管（大、小）、烧杯（大、中、小）、试管、具塞试管、白瓷板、温度计、PH计、搅拌棒3、试剂：0.2%单宁、5 %苯甲酸钠溶液、0. 1 %/0.5%EDTA 溶液、1. 5%氯化钠溶液、0. 5%乙酸锌溶液、0.06 %抗坏血酸溶液、0. 5%硫代硫酸钠、1 %L - 半胱氨酸溶液、20mM pH4.0 的醋酸缓冲液、1MNaCl~20mM pH4.0 醋酸缓冲液（含0.01%EDTA）、双缩脲试剂、pH7.0 的干酪素溶液、酶液激活液（pH4.5 ，L-cys 和EDTA-2Na 配制）、三氯乙酸溶液、标准酪蛋白试剂、0.1M盐酸、0.1M氢氧化钠、50%乙二醇、50%甘露醇、50%葡萄糖、50%甘油、O．1mol/L 柠檬酸盐缓冲液(pH 3．0)、NEM四、实验过程1、提取：菠萝洗净榨汁。
从菠萝中提取菠萝蛋白酶
从菠萝中提取菠萝蛋白酶
菠萝蛋白酶是一种酶类蛋白质，可分解蛋白质成分。
菠萝是其主要来源之一，因此，从菠萝中提取菠萝蛋白酶成为一种常见的方法。
提取菠萝蛋白酶的方法可以通过多种方式实现，其中包括机械压榨、超声波处理、低温浸泡、固相萃取和酵素技术等。
不同的方法会对提取效果产生不同的影响。
机械压榨是最简单的提取方法之一，通过将菠萝果肉或茎汁挤压后，分离出含有菠萝蛋白酶的液体。
超声波处理则是一种快速、高效的提取方法，它利用超声波能量刺激菠萝细胞释放菠萝蛋白酶。
低温浸泡是一种保留菠萝蛋白酶活性的提取方法，通过在低温下将菠萝浸泡一段时间，可提高菠萝蛋白酶的纯度和活性。
固相萃取是一种常用的精细化提取方法，它将菠萝蛋白酶从其他成分中分离出来，通过针对菠萝蛋白酶特异性的化学反应，可将菠萝蛋白酶浓缩，从而得到纯度高的菠萝蛋白酶。
酵素技术则是利用大肠杆菌等细菌表达人造菠萝蛋白酶，通过纯化酶产物得到菠萝蛋白酶。
总之，从菠萝中提取菠萝蛋白酶是一种常见的方法，通过不同的提取技术可以得到不同品质的菠萝蛋白酶。
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从菠萝中提取菠萝蛋白酶
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4.保温后，加同样预热的1%酪蛋白溶液， 混匀，37℃下10min,加入8ml1mol/ml 氢氧化钠溶液，迅速摇匀，室温放置 30min; 5.取上清液于275nm波长下测定OD值； 6.做考马斯亮蓝法测蛋白质含量的标准 曲线。
含量的测定
0.1M的牛血清蛋白
浓度mg/ml 0 0.002 0.004 0.008 0.012 0.016 0.02
0.132
0.215
0.326
0.357
0.388
0.61
标准曲线
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标准曲线
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结果分析及结论
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1.所得粗产品占总菠萝的百分数： 所得沉淀质量/菠萝总质量 =1.1g/0.89kg×100%=0.124% 2.OD275=0.247(在上述条件下，单位时间内光吸 收单位的变化值为待测溶液酶的活力） 所得酶的活力：0.247/10=0.0247u 3.在595nm下的吸光度：0.610 由图和公式的蛋白的浓度：0.027mg/ml
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5.除去上清液，以4000r/min离心5min丢掉上 清液； 6.把提取的蛋白酶糊倒入烧杯中，加 0.1%EDTA溶液100ml搅匀，再把1.5%氯化 钠溶液200ml倒入烧杯中搅匀，以 4000r/min离心7min，倒掉上清液，得到洗 涤剂I酶复合沉淀物。
质量检测
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1.得到洗涤剂I酶复合沉淀物后加磷酸缓 冲液定溶至10ml； 2.以4000r/min离心5min收集上清液； 3.取1ml溶液酶加入0.9ml激活剂与37℃ 水浴中保温；
背景介绍
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二、菠萝蛋白酶在医药保健品业的应用
1、抑制肿瘤细胞的生长 2、对心血管疾病的防治：能抑制血小板聚集 引起的心脏病发作和中风, 缓解心绞痛症状, 缓和动脉收缩, 加速纤维蛋白原的分解。 3、用于烧伤脱痂 ：菠萝蛋白酶能选择性地 除皮使新皮移植得以尽早行。
菠萝蛋白酶提取方法的研究
菠萝蛋白酶提取方法的研究一、本文概述Overview of this article菠萝蛋白酶是一种从菠萝茎部提取的巯基蛋白酶，具有广泛的生物活性，包括抗炎、抗水肿、抗凝血、抗肿瘤等作用。
由于其独特的生物活性，菠萝蛋白酶在医药、食品、饲料、纺织、制革、造纸和化妆品等行业中具有广泛的应用前景。
因此，研究菠萝蛋白酶的提取方法对于其工业化生产和应用具有重要意义。
Pineapple protease is a thiol protease extracted from the stem of pineapple, which has a wide range of biological activities, including anti-inflammatory, anti edema, anticoagulant, and anti-tumor effects. Due to its unique biological activity, bromelain has broad application prospects in industries such as medicine, food, feed, textiles, leather making, papermaking, and cosmetics. Therefore, studying the extraction method of bromelain is of great significance for its industrial production and application.本文旨在研究菠萝蛋白酶的提取方法，通过对不同提取方法进行比较和优化，找出最佳提取工艺条件，以提高菠萝蛋白酶的提取效率和纯度。
本文首先介绍了菠萝蛋白酶的基本性质和应用领域，然后详细阐述了各种提取方法的原理、操作步骤和优缺点，包括传统提取方法、超声波提取法、微波提取法、酶解法等。
菠萝蛋白酶提取
菠萝蛋白酶提取一．实验目的:1.了解菠萝蛋白酶的基本性质，设计提取方法并测性其蛋白总量及酶活性；2.计算从菠萝中提取菠萝蛋白酶时每步的回收率，判断提取方法的优劣。
二．实验原理：菠萝蛋白酶外观为白色至浅棕黄色无定形粉末；可溶于水，水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚；属糖蛋白。
主要作用原理是使多肽类水解为低分子量的肽类，尚有水解酰胺基键和酯类的作用。
其作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化,啤酒澄清,还用于干酪、明胶及水解蛋白的生产。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症；它能迅速溶痂,对正常组织无害,不影响植皮,适用于中小面积深度烧伤的治疗。
提取菠萝蛋白酶的传统工艺是高岭土吸附法和单宁沉淀法。
高岭土吸附法生产工艺和操作都比较复杂,原材料消耗多,所需设备也多,酶活总回收率低,但产品质量较好,纯度较高,单宁沉淀法工艺和操作比高岭土法简单,原材料消耗少,所需设备少,但酶活回收率低。
有些研究用超滤法对传统工艺进行了改革,不仅使菠萝蛋白酶产品更纯,而且酶粉得率比传统工艺高,但超滤法生产工艺和和操作比上述两种方法复杂,工人素质要求高,且设备一次性投资大。
本实验采用新型吸附法提取菠萝蛋白酶,步骤简单,产率比传统方法有所提高,是一种有发展的方法。
在新型吸附沉淀法提取菠萝蛋白酶中,所使用的锌离子对酶有激活作用,乙二胺四乙酸是一种螯合物,可有效地螯合原料中某些重金属离子,以避免其与酶结合而使酶失去活性,抗坏血酸则具有还原性,分子上的活泼羟基氢可使酶活性中心保持还原状态,从而有效地保持酶活性,其中以EDTA 和L2半胱氨酸组合,效果最佳。
单宁用量多少会直接影响酶产量,一般范围0. 15 %～0. 25 %的浓度。
采用Folin-酚法测定蛋白酶含量，发生双缩脲反应的蛋白中酚基（酪氨酸），在碱性条件下将磷钼酸和磷钨酸还原成钼酸和钨酸，呈蓝色，在650nm和66onm处有最大吸收值。
Folin-酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。
菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的阻碍
菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的阻碍一、实验目的一、把握从原料物中提取活化别离菠萝蛋白酶的方式。
二、学习酶活力测定的方式。
3、了解某些因素对菠萝中菠萝蛋白酶热稳定性的影响。
4、掌握用聚乙二醇对菠萝蛋白酶进展化学修饰的原理。
5、比拟修饰酶与未修饰酶的活力。
二、实验原理菠萝蛋白酶(Bromelain，简称菠萝酶，亦称为凤梨酶或凤梨酵素)是从菠萝果茎、叶、皮提掏出来，经精制、提纯、浓缩、酶固定化、冷冻枯燥而取得的一种纯天然植物蛋白酶。
分子量为33 000 , 等电点为，白色至浅棕黄色无定形粉末，溶于水。
水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚。
属糖蛋白，能分解蛋白质、脂类和酰胺等。
品质最正确的菠萝蛋白酶是利用菠萝的中茎加工,采纳超滤方式进展过滤浓缩,低温冷冻枯燥而得的。
它作为一种食物添加剂可用于肉质嫩化、啤酒澄清. 还用于明胶、水解蛋白的生产,在医药上它可在生物体内溶解纤维蛋白及血凝块。
因此能够医治水肿及多种炎症,它能迅速溶痂。
对正常组织无害,不阻碍植皮,适用于中小面积深度烧伤的医治。
一、本实验先从头鲜的菠萝汁中利用单宁沉淀法提掏出菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶将酪蛋白水解产生酪氨酸，通过测定吸光度的转变，能够测得菠萝蛋白酶的活力。
2、本实验采纳离子互换技术纯化菠萝蛋白酶。
与化学方式相较，它别离条件温和，不引发分子构造的转变。
它用于纯化菠萝蛋白酶的关键问题是选择适合的互换树脂及相应的互换条件。
3、菠萝蛋白酶活性单位的概念：一个酶活力单位〔U〕概念为特定条件下[，(37±1℃)]酶作用于干酪素底物1min产生1μg酪氨酸所需的酶量。
菠萝蛋白酶将酪蛋白分解，生成在三氯乙酸溶液中不沉淀的多肽，并在275 nm处有吸收峰，除去未被消化的酪蛋白，用分光光度计(275 nm)测定溶液中所含肽的数量。
菠萝蛋白酶酶活计算公式参照何铁剑的方式 [91]。
每毫升酶液活性单位〔U/ml〕=A-A0/Aw×M 标×V/t×样品稀释倍数/供测体积式中：( A - A0) 为275nm 波长下待测酶液与对照的光密度差值；Aw 指以水为对照，275nm 波长下50μg/mL 标准酪氨酸光密度值；M 标为标准酪氨酸溶液浓度；V 为反映体系整体积〔mL〕；t 为反映时刻10min。
菠萝蛋白酶的提取与活力测定
菠萝蛋白酶的提取方法
1、高岭土吸附法 2、单宁沉淀法 3、超滤法 （主要介绍单宁沉淀法）
实验材料及试剂
（一）材料 菠萝下脚料（菠萝果实或菠萝果皮） （二）试剂 苯甲酸钠（防腐） 0.05%的EDTA 0.06%的二氧化硫 的维生素C（作为稳定剂） 单宁 抗坏血酸（或1:3的盐酸）
菠萝蛋白酶的提取
生化121
菠萝蛋白酶简介
菠萝蛋白酶广泛存在于菠萝的果实，芽，叶， 茎中，从菠萝的果实中提取的称为果菠萝蛋白 酶，从菠萝的茎中提取的称为茎菠蛋白酶。 菠萝蛋白酶的分子量为33000，是典型的矿矿 疏基蛋白酶，能分解蛋白质，肽，酯，酰胺。 它的水解蛋白的活性比木瓜蛋白酶的活性高十 倍以上，因此有着广泛的用途。
5、按下表操作
试管号 1 ① 1%酪蛋 0.2 白(ml) 2 ② 0.4 3 ③ 0.6 4 ④ 0.7 5 ⑤ 0.8
6、按步骤5混匀，在37℃水浴下反应10min； 7、向10支试管中各加入8ml1mol∕L的氢氧化钠 溶液，摇匀，于室温放置30min； 8、取各自对应的试管在275nm波长下测定吸 光度 9、测定结果如下
菠萝蛋白酶活力的测定
1、取酶制品溶解于0.05mol∕L磷酸缓冲溶液 （PH7.0）至10ml，离心得上清液； 2、取5支试管，分别标号1、2、3、4、5，各 加1ml溶液酶和0.9ml激活剂； 3、另取5支试管，分别对应标号①、②、③、 ④、⑤，各加1ml缓冲液和0.9ml激活剂； 4、将10支试管置于37℃水浴；
0.02%
单宁沉淀法的工艺流程
菠萝下脚料
压榨 去杂质
液汁
菠萝蛋白酶提取纯化及化学修饰对其活性的影响
菠萝蛋白酶提取纯化及化学修饰对其活性的影响一、实验目的1、掌握菠萝蛋白酶的提取和纯化方法2、研究菠萝蛋白酶的稳定性3、掌握菠萝蛋白酶的化学修饰并对修饰酶与未修饰酶的活性比较二、实验原理菠萝蛋白酶（Bromelain,EC 3.4.22.3）是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶。
菠萝蛋白酶属于糖蛋白，分子量约为33000D，等电点为9.55，白色至浅棕黄色无定形粉末，溶于水。
水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚。
菠萝蛋白酶是典型的巯基蛋白酶，能分解蛋白质，肽，酯，酰胺。
它的水解蛋白的活性比木瓜蛋白酶的活性高十倍以上，因此有着广泛的用途。
它作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化、啤酒澄清，还用于干酪、明胶、水解蛋白酶的生产。
在医药上它可用于生物体内溶解纤维蛋白及血凝块，因此可用于治疗水肿及多种炎症；它能迅速溶痂，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中小面积深度烧伤的治疗。
菠萝蛋白酶的最适温度范围比较稳定，最稳定范围是55℃~65℃。
菠萝蛋白酶的最适 pH 在7.1 左右，呈现中性。
金属盐离子中 NaCl、KCl对酶活的影响不是很大，较高浓度的 MgCl2、CaCl2对菠萝蛋白酶单宁复合物有一定程度的抑制作用，尤其在浓度较高的情况下对菠萝蛋2+白游离酶酶活的影响更大。
Zn的作用中以醋酸锌的作用更为显著，极低的浓度即能促使菠萝蛋白酶的酶活性明显提高。
较低浓度的 ZnCl2也能使酶的稳定性有所提高。
维生素 C、半胱氨酸、硫代硫酸钠、2-巯基乙醇是菠萝蛋白酶的稳定剂，都能使酶分子中巯基基团维持还原态，能够作为还原剂来提高酶活力。
0.05%的苯甲酸钠即能使氧化脱氢酶的活性得到抑制，对酶起到保护作用。
对酶活有影响的金属离子，EDTA 能通过螯合而保护菠萝蛋白酶，消除其对酶的失活作用。
其它试剂如 50%的甘油、葡萄糖、40%的半乳糖都能使菠萝蛋白酶的半衰期延长，蔗糖、麦芽糖、棉籽糖、松三糖、乙二醇和甘露醇均对菠萝蛋白酶有一定的保护作用。
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菠萝蛋白酶提取
一．实验目的:
1.了解菠萝蛋白酶的基本性质，设计提取方法并测性其蛋白总量及酶活性；
2.计算从菠萝中提取菠萝蛋白酶时每步的回收率，判断提取方法的优劣。
二．实验原理：
菠萝蛋白酶外观为白色至浅棕黄色无定形粉末；可溶于水，水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚；属糖蛋白。
主要作用原理是使多肽类水解为低分子量的肽类，尚有水解酰胺基键和酯类的作用。
其作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化,啤酒澄清,还用于干酪、明胶及水解蛋白的生产。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症；它能迅速溶痂,对正常组织无害,不影响植皮,适用于中小面积深度烧伤的治疗。
提取菠萝蛋白酶的传统工艺是高岭土吸附法和单宁沉淀法。
高岭土吸附法生产工艺和操作都比较复杂,原材料消耗多,所需设备也多,酶活总回收率低,但产品质量较好,纯度较高,
单宁沉淀法工艺和操作比高岭土法简单,原材料消耗少,所需设备少,但酶活回收率低。
有些研究用超滤法对传统工艺进行了改革,不仅使菠萝蛋白酶产品更纯,而且酶粉得率比传统工艺高,但超滤法生产工艺和和操作比上述两种方法复杂,工人素质要求高,且设备一次性投资大。
本实验采用新型吸附法提取菠萝蛋白酶,步骤简单,产率比传统方法有所提高,是一种有发展的方法。
在新型吸附沉淀法提取菠萝蛋白酶中,所使用的锌离子对酶有激活作用,乙二胺四乙酸是一种螯合物,可有效地螯合原料中某些重金属离子,以避免其与酶结合而使酶失去活性,抗坏血酸则具有还原性,分子上的活泼羟基氢可使酶活性中心保持还原状态,从而有效地保持酶活性,其中以EDTA 和L2半胱氨酸组合,效果最佳。
单宁用量多少会直接影响酶产量,一般范围0. 15 %～0. 25 %的浓度。
采用Folin-酚法测定蛋白酶含量，发生双缩脲反应的蛋白中酚基（酪氨酸），在碱性条件下将磷钼酸和磷钨酸还原成钼酸和钨酸，呈蓝色，在650nm和66onm处有最大吸收值。
Folin-酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。
甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠（KNaC4H4O6•4H2O）组成。
多肽中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物。
乙试剂是由磷钼酸、磷钨酸、硫酸和溴等组成。
此试剂在碱性条件下，易被多肽中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与多肽含量成正比。
活性测定方法是以酪蛋白水解释放的氨基酸在275nm的吸收值为基础。
酶活单位定义为在37℃，pH7.0的条件下，每分钟水解酪蛋白所产生的酪氨酸的微克数为一个菠萝蛋白酶单位。
pH 值对酶活力有很大的影响,大多数的酶在酸性条件下活力最强,最适合菠萝蛋白酶的pH 为7. 4 ,在碱性条件下就会失活,在操作过程中应注意pH 值的变化。
从温度2酶活力曲线上可以看出,温度也是影响酶活力的重要因素之一,最适合的温度为45 ℃。
三．实验步骤：
（1）新型吸附法提取菠萝蛋白酶的过程：
菠萝压榨得汁液, 按压出汁液的体积量加10 %氯化钠,在室温下自然沉降120 h ,弃去沉淀物,得澄清液。
将澄清液移入烧杯中,在搅拌条件下,按澄清液体积加入0. 05 %EDTA22Na 、0. 02 %维生素C ,立刻加入0. 1 %的单宁和自制的吸附剂,在4 ℃下静置1 h ,离心弃去上清液,收集沉淀物,加入2～3 倍pH 值为4. 5 的抗坏血酸溶液,静止30 min。
离心14 min ,弃去沉淀物,收集滤液,用冷冻真空干燥即得菠萝酶。
（2）蛋白质含量的测定过程：
取12 支试管,分别加入0 ,0. 20 ,0. 40 ,0. 60 ,0. 80 ,1. 00 mL 标准牛血清溶液(500μg/ L ,用水补足1. 00mL ,以上每种浓度各做一份重复,即平行做两份,按顺序向各管加入5 mL Folin-酚试剂甲,混匀。
室温下放置10 min 后,再依次向各管加入0. 5 mL Folin-酚试剂乙,
立即摇匀,在30 ℃保温(或室温下放置) 30 min。
然后,在721 型分光光度计上进行比色测定。
以光密度(O.D. )为纵坐标,以牛血清溶液浓度为横坐标,绘制出牛血清的标准曲线。
未知的菠萝蛋白酶的蛋白质含量在曲线中得到。
（3）菠萝蛋白酶活力测得的实验过程：
分别取酶制品0. 15 g 克加入pH7. 0 , 0. 05mol/ L 磷酸缓冲溶液定容至100 mL ,过滤,此滤液为溶液酶制剂。
取1 mL 溶液酶加入0. 9 mL 激活剂(pH7. 0 , 0. 05 mol/ L 磷酸缓冲溶液, 内含15mmol/ L 硫代硫酸钠及6 mmol/ L EDTA22Na) ,于37 ℃水浴中保温恒定后,加入同样预热的1 %酪蛋白溶液,混匀,在37 ℃下准确反应10 min ,加入8mL 1N 氢氧化钠溶液,迅速摇匀,于室温放置半小时。
取上清液于275 nm 波长下测定OD 值。
计算溶液酶的活力。