仪器分析第四章 高效液相色谱

高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。按照固定相不同 可分为：液液分配色谱；吸附色谱(液固色谱)；离子交换色谱；尺寸排阻色谱 (凝胶渗透色谱)。此外，还有亲和色谱、平板色谱(薄层色谱)等。
早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径1~5cm, 长50~500cm的玻璃 柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的固定相颗粒直径多在150~200m 范围内。即使这样，流速仍然很低(<1mL/min)，分析时间仍然很长！
当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，但柱塔板高度Hmin 也相应增加了！或者说柱效下降了。
为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：最为有效地增加柱效的唯一方 法是减小填充物的粒径（3~10 m ）！
直到60年代，由于在高压下操作的液压设备、高效固定相以及高灵敏检测 器的出现及发展，才彻底解决了分析时间及柱效的问题。即所谓的高效液相色 谱技术才真正得到广泛应用。
的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过 程。对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀， 流量精度和重复性为0.5%左右。
输液泵种类：恒压型和恒流型。
恒压泵(类似于风箱)可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积 大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充 物）变化而变化，现已较少使用。
分离柱
压力计
反压调节
注样阀
过滤器
1. 高压输液系统
1）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔很约2 m，可防 止颗粒物进行泵内。
2）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分 子量小的气体透过膜从溶剂中除去。
3）高压泵： 高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部件之一，其功能是将溶剂贮存器中
（二）固定相载体
由于各种HPLC分离方法的流动相均为液体，因此，HPLC通常是按照固定 相载体或固定液的不同来分类的。 1. 按承受压力分 刚性固体：SiO2为基质，耐压为7.0×108~1.0×109 Pa。可制成直径、形状和孔隙
其它检测器还包括：MS、IR、Evaporative light scattering detector(光 散射)、极谱等。
三、 HPLC流动相和固定相简介
（一）流动相
与GC流动相不同，HPLC流动相为溶剂，它既有运载作用，又和固定相一样， 参予对组分的竞争，因此溶剂的选择对分离十分重要。
理想的溶剂应有下列特性： 1）对待测物具一定极性和选择性； 2）使用UV检测器时，溶剂截止波长要小于测量波长（所谓溶剂的紫外截止波 长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶 剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量）；使用折光率检测器， 溶剂的折光率要与待测物的折光率有较大差别，以达到最高灵敏度。 3）高纯度。由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不 纯的溶剂会引起基线不稳，或产生杂峰（伪峰），同时可使截止波长增加。 4）化学稳定性好； 5）适宜的粘度（粘度适中）。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分 离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度过低的溶剂也不宜采用， 例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。
与GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱本身所产生的峰形展宽相对要小些。 即，HPLC的展宽多因一些柱外因素引起。这些因素包括：进样系统、连接管道及 检测器的死体积。进样装置包括两种。
1）隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但进样量小 且重现性差。
2）高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此 进样准确，重复性好，如图。
梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品中各组
分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。它在液相色谱中所起
的作用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变 化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度程 序）来达到。
2. 进样系统
梯度洗脱装置分为两类：
一类是外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压 泵压至柱系统，仅需一台泵即可。另一类是内梯度装置（又称高压梯度），将 两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再 输至柱系统。如果只有一个泵，可采用低压混合设计（将两种或以上的溶剂按 一定比例混合，再由高压泵输出）；如果有两个或以上泵，调节各自的流量， 在高压下混合。
高输送压力可达4.9107Pa）；色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料 填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万 或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续 检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、分离效能高、自动化等
特点。所以人们称它为高压、高速、高效或现代液相色谱法。
种选择性很强的检测器，其灵敏度比UV检测器高2~3个数量级。
3）示差折光检测器
平面镜
样品
透镜
遮光板
光源
参比
光学零
光电转换 调零
放大器
记录仪
原理：利用两束相同角度的光照射溶剂相和样品+溶剂相，利用二者对光的折 射率不同，其中一束（通常是通过样品+溶剂相）光因为发生偏转造成两束光的强 度差发生变化，将此差示信号放大并记录，该信号代表样品的浓度。
当采用粘度较大的试剂，如CC4，CH3OH, 丙酮，二氧杂环已烷、THF等。 填充方法：
填充时，按上述方法制作匀浆液，用流动相充满色谱柱及其延长管中，然 后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内。要求填充 速度快(防凝聚、沉降或结块)、且无空气进入(影响填充均匀性)。
4. 检测器
装入样品
进样 采样环
进色谱柱
泵入溶剂 出口
3. 色谱柱
1）对色谱柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小。 柱长多为15~30cm，内径为4~5mm(尺寸排阻色谱柱常大于5mm，制备色谱柱内 径更大)；
2）柱的填充：主要采用匀浆法。根据使用匀浆试剂的性质不同可分为： 平衡密度法：
即使溶剂密度和填充颗粒密度相近，此时颗粒沉降速度趋于0。常用的匀浆 试剂有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等； 非平衡密度法：
3. HPLC与GC的比较
液相色谱所用基本概念：保留值、塔板数、塔板高度、分离度、选择性 等与气相色谱一致。液相色谱所用基本理论：塔板理论与速率方程也与气相 色谱基本一致。但由于在液相色谱中以液体代替气相色谱中的气体作为流动 相，而液体和气体的性质不相同；此外，液相色谱所用的仪器设备和操作条 件也与气相色谱不同，所以，液相色谱与气相色谱有一定差别，主要有以下 几方面：
a. 分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些 物质只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点化合物、非挥发性物质、 热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物等，这类物质占有机物总数的80%。
b. 流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起 运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合， 可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对 组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改 进分离。另外，液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱等，作 为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能的。
高效液相色谱是在气相色谱和经典色谱的基础上发展起来的。现 代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅是现代液相
色谱比经典液相色谱有较高的效率和实现了自动化 操作。经典的液相
色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长。
而现代液相色谱法引用了气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最
检测器是液相色谱仪的关键部件之一。 对检测器的要求是：灵敏度高，重复性好、 线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的 变化不敏感等。液相色谱检测器包括紫外吸
收、荧光发射、示差折光和安培检测器等。
1）紫外检测器
UV
其检测原理和UV-Vis方法一样。只是，此 时所采用的吸收池为微量吸收池，通常其光
程为2-10mm, 体积约为1~10 L。 HPLC分析中，约有80%的物质可以在254
3. HPLC与GC的比较
c. 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行，一般有利于 色谱分离条件的选择。
d. 柱外扩展：由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质 在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而在气相色谱中， 柱外区域扩张可以忽略不计。
e. 使用成本：液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易， 而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺乏通用的检测 器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术是互 相补充的。
为通用型检测器，灵敏度为10-7g/mL。但对温度变化敏感，且不适于梯度淋洗。
4）安培检测器
由恒电位仪和一薄层反应 池（体积为1~5L）组成。如 图。
接参比电极 和对电极
该检测器是利用待测物流
入反应池时在工作电极表面发
生氧化或还原反应，两电极间
就有电流通过，此电流大小与 待测物浓度成正比。
塑料块
采用安培检测器时，流动
相必须含有电解质，且呈化学
隋性。它最适于与反相色谱匹
1 cm
配。但此检测器只能检测具有
电活性的物质。
接色谱柱
Teflon 工作电极 (Pt, Au, 碳糊)
5）电导检测器
电导检测器主要用于离子色谱的检测。 其原理是基于待测物在一些介质中电离后所产生的电导（电阻的倒数） 变化来测量电离物质的含量。 电导检测器的主要部件是电导池。其响应受温度影响较大，因此需要将 电导池置于恒温箱中。另外，当pH>7时，该检测器不够灵敏。
第四章 高效液相色谱
1. 概述 2. HPLC仪器
包括： 高压输液装置; 进样系统; 分离系统; 检测系统;辅助系统
3. 流动相和固定相简介 4. 高效液相色谱方法各论
分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱
一、 概述
高效液相色谱法是继气相色谱之后，70年代初期发展起来的一种以 液体做流动相的新色谱技术。
综上所述，高效液相色谱法具有高柱效、高选择性、分析速度快、 灵敏度高、重复性好、应用范围广等优点。该法已成为现代分析技术 的重要手段之一，目前在化学、化工、医药、生化、环保、农业等科 学领域获得广泛的应用。
4. 应用
由于HPLC分离分析的高灵
敏度、定量的准确性、适于非
挥发性和热不稳定组分的分析，
因此，在工业、科学研究，尤
其是在生物学和医学等方面应
用极为广泛。如氨基酸、蛋白
质、核酸、烃、碳水化合物、
分 子
药品、多糖、高聚物、农药、 量
抗生素、胆固醇、金属有机物
等 分 析 ， 大 多 是 通 过 HPLC 来
完成的。
右图是各种HPLC方法的应
用范围及对象
极性增加 不溶于水 非极性
非离子极性
溶于水 离子
吸附
分配
Hale Waihona Puke Baidu
反向分配
正向分配 离子交换
nm或280nm处产生紫外吸收。因此该类检测 器应用很广。
在选择测量波长时注意：溶剂必须能让
所选择的光透过，即所选波长不能小于溶剂
的最低使用波长。
接色谱柱
石英窗
光电倍增管
废液
皮质酮
可的松
氟美松
波长
快速扫描—光电二极管阵列（PDA）检测所获得的三维色谱-光谱图
2）荧光检测器
许多有机物具荧光活性，尤其是芳香族化合物具有很强的活性。荧光检测器是一
凝胶渗透
尺寸排阻
凝胶过滤
二、HPLC仪器
HPLC仪器包括： 1. 高压输液装置; 2. 进样系统; 3. 分离系统; 4. 检测系统; 5. 此外还配有梯度淋洗、 自动进样和数据处理装置。
其工作过程如图所示。
He
HPLC仪器详解
出口检查
储液瓶 分布器 过滤 2m
高压泵
脉流消除
入口检查
抽气
到检测器
恒流型溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。有机械注射式和机 械往复式两种。应用最多的是机械往复式恒流泵(见下图。每分钟往复25~100次， 因此脉动小。对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰，此时可连接一脉动阻 尼器)。
马达
密封
往复式拉动
到色谱柱 脉动阻 尼器
球阀
溶剂
机械往复柱塞泵示意图
4）梯度洗脱：梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按 一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子 强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。