PCR体系

目前有两种Taq DNA 聚合酶供应,一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种 为大肠菌合成的基因工程酶。 催化一典型的PCR 反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul 时)，浓度过高可引起 非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
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PCR 反应体系
模板：单链或双链DNA
引物：1对长16-30bp 的寡核苷酸(决定扩增 产物特异性的关键)
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PCR反应体系的五要素：
DNA聚合酶：耐热 的DNA聚合酶(常用 Taq酶或Pfu酶)
底物：四种脱氧三 磷酸核苷
dNTP: dATP、 dTTP、dCTP、 dGTP
Mg2+： DNA聚 合酶的激活剂
多次冻融会使dNTP 降解。如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)， 就会引起错配。浓度过低又会降低PCR 产物的产量。
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③引物(Primer)： 1μM/L
• 上游引物：与目的序列5’端相同 • 下游引物：与目的序列3’端互补
注：当双链解开成单 链后，引物总是结合 于靶序列的3’端。
下游引物
通用PCR反应体系
组分
终浓度
10×PCR buffer MgCl2 dNTP
1× 1-4mM （常用1.5mM） 0.2mM each（200uM each）
Primer F
0.1-1.0uM
Primer R
0.1-1.0uM
Template DNA
0.01-10ng
Taq (Pfu)
0.2-1U
ddH2O Total volume
Up to final volume 15-50uL
某些公司生产的buffer会预先含有Mg离子，因此不必额外再添加Mg离子。
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①缓冲液(buffer)：提供合适的pH值和DNA聚合酶的激活剂 10mM Tris·HCl （ pH8.3-9.0），1.5mM MgCl2，50mM K+
Mg2+浓度过高，反应特异性降低,出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA 聚 合酶的活性,使反应产物减少。
②dNTP（底物）：等摩尔浓度的 4 种 dNTP（即 dATP、 dTTP、dCTP和dGTP），终浓度一般为 0.2mM（即饱和浓 度）， dNTP 的浓度会影响扩增的产量、特异性和保真度。
上游引物
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④模板：单、双链DNA均可。 模板的纯度要求不是很高，但其数量会直接影响扩增的效果。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
⑤DNA聚合酶：
最常用的是Taq DNA聚合酶，最适反应温度75℃。 Pfu DNA聚合酶：是目前使用最广泛的具有 3’-5’ 外切酶
活性（高保真）的 PCR 酶，目前为止错配率最低的耐高温 DNA聚合酶。