(推荐)慢病毒包装简介及应用
2020年慢病毒包装原理-介绍.pdf
慢病毒包装系统简介及应用一、慢病毒包装简介及其用途慢病毒（ Lentivirus ）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
目前慢病毒也被广泛地应用于表达 RNAi 的研究中。
由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的 siRNA 半衰期短，体外合成 siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。
采用事先在体外构建能够表达 siRNA 的载体，然后转移到细胞内转录 siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成 siRNA ，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。
在所构建的 siRNA 表达载体中，是由 RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导 RNA 合成的，这是因为 RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的 RNA 不会带 poly A 尾。
当 RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续 4 个或 5 个 T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物 3' 端形成 1~4 个U 。
U6 和 H1 RNA 启动子是两种 RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～ 21ntRNA 和～ 50ntRNA 茎环结构（ stem loop ）。
在 siRNA 表达载体中，构成 siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成 siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状 RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体包含位于 RNA 聚合酶Ⅲ启动子和 4 ～ 5 T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有 1~4 个 U 3 ' 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成 siRNA 。
慢病毒包装技术和应用
慢病毒包装技术和应用慢病毒载体（lentivirus vector，LV）是实验室常用的病毒包装载体，在基因转染方面具有很多特有的优势，可以转染分裂期和非分裂期的细胞，基因转染效率高，可以导入较大基因片段等。
目前被广泛用于RNAi的研究，为基因功能研究和特定基因表达调节提供了可能性。
另外，慢病毒包装在临床中可作为基因治疗载体发挥重要作用。
慢病毒载体慢病毒属于反转录病毒的一种。
慢病毒载体是在人类免疫缺陷型病毒（HIV-1）基础上构建的载体。
HIV-1包含3个结构基因gag、env和pol，2个调控基因rev、tat，以及4个辅助基因vif、vpr、vpu和nef。
图1. HIV-1的基因结构。
为了提高生物安全性，慢病毒载体的建立经历了四个阶段：1、第一代质粒系统。
去除HIV基因组中的反式作用蛋白基因序列，包装上含有目标基因的重组载体和能为反式提供病毒颗粒所需蛋白的包装质粒，共转染包装细胞。
2、第二代的三质粒系统。
将HIV基因组中的顺式作用序列结构和编码反式作用蛋白的序列去除，分别克隆到独立的质粒中。
三个质粒包括包装质粒（含有CMV启动子）、包膜质粒（含有VSV-G基因，替代env基因，可提高宿主范围）和载体质粒（含有目标基因）。
图2. 第二代慢病毒质粒。
3、第三代三质粒系统。
为了提高安全系数，在第二代的基础上去除了HIV所有辅助基因序列，只保留了gag、pol和rev基因。
4、第四代四质粒系统。
在第三代质粒的基础上，将env基因独立克隆到一个质粒上，另外，除去tat基因。
四个质粒包括pGag/Pol，pRev，pVSV-G，和包含目的基因的载体。
图3. 第三代和第四代慢病毒质粒。
其他病毒载体除了慢病毒载体，常见的，还有腺病毒，腺相关病毒（AAV）等。
腺病毒载体是瞬时表达的首选载体，基因转染效率高，安全性高，缺点是不能整合到宿主细胞基因组，包装周期长，约6-8周。
腺相关病毒安全性高、免疫原性低、具有明显组织嗜性等特点，因此非常适合临床基因治疗，缺点是包装周期较长，约6-8周。
慢病毒包装原理介绍精编WORD版
慢病毒包装原理介绍精编W O R D版IBM system office room 【A0816H-A0912AAAHH-GX8Q8-GNTHHJ8】慢病毒包装系统简介及应用一、慢病毒包装简介及其用途慢病毒（ Lentivirus ）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
目前慢病毒也被广泛地应用于表达 RNAi 的研究中。
由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的 siRNA 半衰期短，体外合成 siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。
采用事先在体外构建能够表达 siRNA 的载体，然后转移到细胞内转录 siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成 siRNA ，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。
在所构建的 siRNA 表达载体中，是由 RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导 RNA 合成的，这是因为 RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的 RNA 不会带 poly A 尾。
当 RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续 4 个或 5 个 T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物 3' 端形成 1~4 个U 。
U6 和 H1 RNA 启动子是两种 RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～ 21ntRNA 和～50ntRNA 茎环结构（ stem loop ）。
慢病毒包装
慢病毒包装慢病毒是逆转录病毒的一种，它需要相对较长的孵育时间，所以称之为“慢”病毒，Lenti在拉丁文中就是慢的意思。
它包括人免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒、猿免疫缺陷病毒、牛免疫缺陷病毒等。
其中研究最多的是HIV-1慢病毒。
慢病毒载体是以慢病毒基因组为基础，所需的目的基因取代部分基因构建而成。
目前使用的慢病毒载体多采用HIV-1基因组改造而来。
与一般的逆转录病毒载体相比，慢病毒载体对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力而具有更广的宿主范围。
慢病毒载体还可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而实现持久表达。
在感染能力方面可以有效感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，又很少引发机体免疫反应，能达到良好的基因治疗效果，具有广阔的应用前景。
随着人们对慢病毒载体的深入研究，为了提高慢病毒在临床上使用的安全性，慢病毒载体的优化也在不断的探讨中。
慢病毒载体的发展经历了三个阶段，第一代慢病毒载体系统是以三质粒系统为代表，在构建时把HIV-1基因组中进行包装、逆转录和整合所需的顺式作用原件与编码反式作用蛋白的序列分离，分别构建在三个质粒表达系统上，即包装质粒、包膜质粒和载体质粒。
包装质粒在巨细胞病毒启动子的作用下，控制除env以外所有病毒结构基因的表达；包膜质粒编码水泡口炎病毒G糖蛋白；载体质粒中含有目的基因。
用这三种质粒共转染包装细胞如人胚胎肾293T细胞，在细胞上清中即可收获只有一次感染能力、而无复制能力的慢病毒颗粒。
第一代慢病毒载体系统的特点是在构建三种包装质粒时，为了降低产生有复制能力的病毒的可能性，尽可能减少三种质粒之间的同源序列，但包装质粒中仍然保留HIV的附属基因。
第二代慢病毒载体系统是在第一代的基础上进行改进，在包装质粒中删除了HIV的所有附属基因。
这些附属基因的去除并不影响病毒的滴度和感染能力，同时增加了载体的安全性。
第三代慢病毒载体系统又增加了两个安全特性：一是构建自身失活的慢病毒载体，即删除了U3区的3′LTR, 使载体失去HIV-1增强子及启动子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA；二是去除了tat基因，用异源启动子序列代替，这样原始的HIV基因组中的9个慢病毒载体中只保留了3个。
慢病毒包装
慢病毒包装一、慢病毒服务简介慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷I型病毒(HIV-1)为基础发展起来的基因载体。
它是一种逆转录病毒，能使外源基因整合入宿主的基因组稳定、长期表达，但却比一般的逆转录病毒具有更高的滴度和更广的宿主范围。
携带外源基因的慢病毒载体与包装载体(表达病毒包装所需辅助蛋白)一同转染包装细胞，即可进行病毒的包装；经收集和浓缩的慢病毒液可以直接用于感染宿主细胞或活体动物模型。
辉骏生物使用的慢病毒包装系统是4质粒包装系统，包括1个慢病毒表达载体和3个慢病毒包装载体(分别表达病毒包装必需的蛋白Gag/Pol、Rev和VSV-G)，包装细胞为293T细胞。
辉骏生物提供包含多种荧光基因(如GFP或RFP等)、多种抗性筛选标签和多种启动子的慢病毒载体，可充分满足客户不同实验设计的要求。
二、慢病毒表达系统的特点1> 能将外源基因有效地整合入宿主染色体上，介导目的基因稳定、长期的表达；2> 慢病毒有更广泛的宿主范围，能够有效地感染分裂细胞、非分裂细胞，特别适合于一些难转染的细胞（如原代细胞、干细胞、不分化的细胞）和对腺病毒感染具有较强免疫反应的细胞（如树突状细胞、单核细胞和间充质干细胞）等；3> 适用范围更广，不仅能用于体外实验，还能用于活体动物模型。
4> 不需要转染试剂，转导效率高，目的基因整合到宿主细胞基因组的概率大大增加；5> 可用于研究基因的过表达、microRNA过表达和RNAi等。
6> 利用慢病毒建立稳转细胞株的时间较常规真核表达载体更短，能大大缩短实验周期、提高实验效率。
三、慢病毒技术整体流程A. 慢病毒载体的构建：根据客户的不同需要，将目的基因片段连接至慢病毒载体；B. 慢病毒包装：重组病毒质粒与包装质粒一起转染293T细胞进行包装；收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，浓缩后进行滴度测试，得到滴度≥1×108 TU/mL的慢病毒液；C. 稳转细胞株的建立：分别使用实验组和对照组慢病毒感染细胞，利用抗生素初步筛选稳转细胞株，细胞分选得到单克隆细胞株，建立实验组和对照组的稳转细胞株。
慢病毒包装原理-介绍之欧阳总创编
慢病毒包装系统简介及应用一、慢病毒包装简介及其用途慢病毒（ Lentivirus ）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
目前慢病毒也被广泛地应用于表达 RNAi 的研究中。
由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的 siRNA 半衰期短，体外合成 siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。
采用事先在体外构建能够表达 siRNA 的载体，然后转移到细胞内转录 siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成 siRNA ，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。
在所构建的 siRNA 表达载体中，是由 RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导 RNA 合成的，这是因为 RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的 RNA 不会带 poly A 尾。
当 RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续 4 个或 5 个 T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物 3' 端形成 1~4 个U 。
U6 和 H1 RNA 启动子是两种RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～ 21ntRNA 和～ 50ntRNA 茎环结构（ stem loop ）。
在 siRNA 表达载体中，构成 siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成 siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状 RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体包含位于 RNA 聚合酶Ⅲ启动子和4 ～5 T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有 1~4 个 U 3 ' 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成 siRNA 。
慢病毒包装原理-介绍
缓病毒包拆系统简介及应用之阳早格格创做一、缓病毒包拆简介及其用途缓病毒（ Lentivirus ）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷 I 型病毒）为前提死少起去的基果治疗载体.辨别普遍的顺转录病毒载体，它对付团结细胞战非团结细胞均具备熏染本领.缓病毒载体的钻研死少得很快，钻研的也非常深进.该载体不妨将中源基果灵验天调整到宿主染色体上，进而达到少期性表黑.正在熏染本领圆里可灵验天熏染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、搞细胞等多种典型的细胞，进而达到良佳的的基果治疗效验，正在好国已经开展了临床钻研，效验非常理念，果此具备广阔的应用前景.暂时缓病毒也被广大天应用于表黑 RNAi 的钻研中.由于有些典型细胞脂量体转染效验好，变化到细胞内的 siRNA 半衰期短，体中合成 siRNA 对付基果表黑的压制效用常常是短促的，果而使其应用受到较大的节制.采与预先正在体中构修不妨表黑 siRNA 的载体，而后变化到细胞内转录siRNA 的战术，没有单使脂量体灵验转染的细胞种类减少，而且对付基果表黑压制效验也没有逊色于体中合成siRNA ，正在少暂宁静表黑载体的细胞中，以至不妨收挥少暂阻断基果表黑的效用.正在所构修的 siRNA 表黑载体中，是由 RNA 散合酶Ⅲ开用子去指挥 RNA 合成的，那是果为 RNA 散合酶Ⅲ有粗确的起初战终止序列，而且合成的RNA 没有会戴 poly A 尾.当 RNA 散合酶Ⅲ逢到连绝 4 个或者 5 个 T 时，它指挥的转录便会停止，正在转录产品 3' 端产死 1~4 个U . U6 战 H1 RNA 开用子是二种 RNA 散合酶Ⅲ依好的开用子，其个性是开用子自己元素均位于转录区的上游，切合于表黑～ 21ntRNA 战～ 50ntRNA 茎环结构（ stem loop ）.正在 siRNA 表黑载体中，形成 siRNA 的正义与反义链，可由各自的开用子分别转录，而后二条链互补分散产死 siRNA ；也可由载体曲交表黑小收卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体包罗位于 RNA 散合酶Ⅲ开用子战 4 ～ 5 T转录终止位面之间的茎环结构序列，转录后即可合叠成具备 1~4 个 U 3 ' 超过端的茎环结构，正在细胞内进一步加工成 siRNA .构修载体前常常要通过合成siRNA 的要领，觅找下效的 siRNA ，而后从中选择切合载体央供的序列，将其引进 siRNA 表黑载体.缓病毒载体（ Lentiviral vector ）较顺转录病毒载体有更广的宿主范畴，缓病毒不妨灵验熏染非周期性战有丝团结后的细胞.缓病毒载体不妨爆收表黑 shRNA 的下滴度的缓病毒，正在周期性战非周期性细胞、搞细胞、受粗卵以及瓦解的后代细胞中表黑 shRNA ，真止正在多种典型的细胞战转基果小鼠中特同而宁静的基果表黑的功能性重默，为正在本代的人战动物细胞构制中赶快而下效天钻研基果功能，以及爆收特定基果表黑落矮的动物提供了大概性.缓病毒表黑载体包罗了包拆、转染、宁静调整所需要的遗传疑息.缓病毒包拆量粒可提供所有的转录并包拆 RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅帮蛋黑.为爆收下滴度的病毒颗粒，需要利用表黑载体战包拆量粒共时共转染细胞，正在细胞中举止病毒的包拆，包拆佳的假病毒颗粒分泌到细胞中的培植基中，离心博得上浑液后，不妨曲交用于宿主细胞的熏染，手段基果加进到宿主细胞之后，通过反转录，调整到基果组，进而下火仄的表黑效力分子.二、那一系统的手段，主假如为了办理以下问题：1. 对付于一些较易转染的细胞，如本代细胞、搞细胞、没有瓦解的细胞等，能大大普及手段基果转导效用，而且手段基果调整到宿主细胞基果组的几率大大减少，那便为RNAi，cDNA 克隆以及报告基果的钻研提供了一个有利的道路.2. 举止稳转细胞株的筛选；3. 为活体动物模型真验提供下品量的包罗手段基果的病毒液；正在细胞相闭的真验支配中，对付于一些按惯例要领易以转染以至无法转染的细胞，通过病毒介导的真验不妨大大普及基果的转导效用，以达到手段基果的下效瞬时表黑.三、缓病毒载体介绍缓病毒载体（ Lentiviral vector, LVs ）是正在 HIV-1 病毒前提上变革而成的病毒载体系统，它能下效的将手段基果（或者 RNAi ）导进动物战人的本代细胞或者细胞系.缓病毒载体基果组是正链 RNA ，其基果组加进细胞后，正在细胞浆中被其自己携戴的反转录酶反转为 DNA ，产死 DNA 调整前复合体，加进细胞核后， DNA 调整到细胞基果组中.调整后的 DNA 转录 mRNA ，回到细胞浆中，表黑手段蛋黑；或者爆收 RNAi 搞扰.缓病毒载体介导的基果表黑或者 RNAi 搞扰效用持绝且宁静，本果是手段基果调整到宿主细胞基果组中，并随细胞基果组的团结而团结.其余，缓病毒载体能灵验熏染并调整到非团结细胞中.以上个性使缓病毒载体与其余病毒载体相比，比圆没有调整的腺病毒载体、调整率矮的腺相闭病毒载体、只调整团结细胞的保守顺转录病毒载体，有明显的个性.洪量文件钻研标明，缓病毒载体介导的手段基果少暂表黑的构制或者细胞包罗脑、肝净、肌肉、视网膜、制血搞细胞、骨髓间充量搞细胞、巨噬细胞等.缓病毒载体没有表黑所有 HIV-1 蛋黑，免疫本性矮，正在注射部位无细胞免疫反应，体液免疫反应也较矮，没灵验率病毒载体的第 2 次注射.四、缓病毒载体的构修1. 构修本理缓病毒属于顺转录病毒科，但是其基果组结构搀杂，除gag、pol 战 env 那 3 个战简单顺转录病毒相似的结构基果中，还包罗 4 个辅帮基果，vif、vpr、nef、vpu 战 2 个安排基果 tat 战 rev . HIV 21 是缓病毒中最具个性性的病毒，第一个缓病毒载体系统即以此病毒为前提举止构修的.缓病毒载体的构修本理便是将 HIV 21 基果组中的顺式效用元件( 如包拆旗号、少终端重复序列 ) 战编码反式效用蛋黑的序列举止分散.载体系统包罗包拆身分战载体身分：包拆身分由 HIV 21 基果组去除了包拆、顺转录战调整所需的顺式效用序列而构修，能反式提供爆收病毒颗粒所需的蛋黑；载体身分与包拆身分互补，含有包拆、顺转录战调整所需的HIV 21顺式效用序列.共时具备同源开用子统制下的多克隆位面及正在此位面拔出的手段基果.为落矮二种身分共源重组爆收有复制本领的病毒 (RCV ) 的大概性，将包拆身分的5 ′ LTR 换成巨细胞病毒 (CMV ) 坐时早期开用子，3 ′ LTR 换成 SV 40 polyA 位面等.将包拆身分分别构修正在二个量粒上，即一个表黑 gag 战 pol、另一个表黑 env .根据那个本理，Naldini 战 Kafri 等构修了三量粒表黑系统.2. 三量粒表黑系统三量粒表黑系统包罗包拆量粒、包膜蛋黑量粒战变化量粒.其中包拆量粒正在 CMV 开用子的统制下，表黑 HIV 21 复制所需的局部反式激活蛋黑，但是没有爆收病毒包膜蛋黑及辅帮蛋黑 vpu；包膜蛋黑量粒编码火泡性心炎病毒 G 蛋黑 (V SV 2G)，应用 VSV 2G 包膜的假构型缓病毒载体夸大了载体的靶细胞嗜性范畴，而且减少了载体的宁静性，允许通过下速离心对付载体举止浓缩，普及了滴度；变化量粒中除含有包拆、顺转录及调整所需的顺式序列，还死存350 bp 的 gag 战 RRE，并正在其中拔出手段基果或者标记基果 ( 绿色荧光蛋黑 GFP) .将载体系统分成三个量粒最大的益处是使序列重叠的机会大大缩小，缩小载体重组历程中爆收 RCV 的大概性.通过三量粒共转染 293T 细胞，超速离心后病毒滴度可达 109IU /m l .3. 四量粒表黑系统为了缩小 HIV 21 包拆结构的序列共源性，进一步缩小重组成 RCV 的大概性，Dull 等人将辅帮基果去除.但是由于gag2pol 的转运需要 rev，果此，正在上述的三量粒系统的前提上，构修成四量粒表黑系统，该系统加上含 rev 的量粒缩小了爆收 RCV 的大概性，而且对付非团结期细胞转导效用无效用.五、缓病毒载体应用1. 将手段基果 /RNAi 基果转进易以转染的细胞，比圆神经元细胞、搞细胞或者其余本代细胞；2. 将手段基果 /RNAi 基果转进动物构制，以期赢得少暂表黑；3. 构修宁静表黑手段蛋黑 /RNAi 的细胞系，再用exvivo的要领导进动物体内；4. 基果治疗；5. 转基果动物；6. 基果敲除；7. 药物钻研：构修表黑受体蛋黑的细胞系，钻研药物的效用；8. 赶快修坐死产手段蛋黑的细胞系，非常有前途的真核细胞表黑要领.。
关于慢病毒包装的简介
关于慢病毒包装的简介1、技术原理：慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷1型病毒）为基础，使用疱疹病毒VSVG 外壳蛋白发展起来的工具载体。
其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。
慢病毒具有感染谱广泛特点，并且可以有效感染分裂和非分裂细胞。
慢病毒可以把外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达；因此成为导入外源基因的有力工具。
现在慢病毒系统已经被广泛应用到各种细胞系的基因敲除/敲入、基因过表达、RNA干扰、microRNA 研究以及活体动物实验中。
2、技术优势：慢病毒与其他病毒比较，具有以下优势：① 表达时间长：慢病毒通过将外源基因整合到宿主细胞基因组上，可实现目的基因长时间稳定的表达，不随着细胞分裂传代而丢失，是细胞实验的首选；② 免疫原性低：直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验；③ 安全性高：未发现致病性，已被用于CAR-T 治疗作用于人体。
3、质量控制：① 基因序列测序② 载体酶切鉴定③ 慢病毒通过qPCR对病毒基因拷贝进行测定④ 一般情况下，慢病毒的滴度在108~109TU/ml4、应用：细胞感染：慢病毒可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，为神经领域、心血管领域、肝脏、肌肉、眼、肺、肿瘤及其他领域的科研工作者们提供更强有力的基因研究工具。
体内注射：神经系统病毒图片来源百度※独有的病毒分级纯化工艺，满足您从永生化细胞到原代细胞和干细胞，到动物体内水平等不同实验需求。
①基因过表达慢病毒服务②基因干扰慢病毒服务③ MicroRNA研究慢病毒服务④ CRISPR/Case9慢病毒服务。
慢病毒包装原理-介绍之欧阳育创编
慢病毒包装系统简介及应用一、慢病毒包装简介及其用途慢病毒（ Lentivirus ）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
目前慢病毒也被广泛地应用于表达 RNAi 的研究中。
由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的 siRNA 半衰期短，体外合成 siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。
采用事先在体外构建能够表达siRNA 的载体，然后转移到细胞内转录 siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成 siRNA ，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。
在所构建的 siRNA 表达载体中，是由 RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导 RNA 合成的，这是因为 RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的 RNA 不会带 poly A 尾。
当 RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续 4 个或 5 个 T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物 3' 端形成 1~4 个U 。
U6 和 H1 RNA 启动子是两种 RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～ 21ntRNA 和～ 50ntRNA 茎环结构（ stem loop ）。
在siRNA 表达载体中，构成 siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成 siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状 RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体包含位于 RNA 聚合酶Ⅲ启动子和 4 ～ 5 T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有 1~4 个 U 3 ' 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成 siRNA 。
最新慢病毒包装原理-介绍
慢病毒包装系统简介及应用一、慢病毒包装简介及其用途慢病毒（ Lentivirus ）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
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目前慢病毒也被广泛地应用于表达 RNAi 的研究中。
由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的 siRNA 半衰期短，体外合成 siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。
采用事先在体外构建能够表达 siRNA 的载体，然后转移到细胞内转录 siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成 siRNA ，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。
在所构建的 siRNA 表达载体中，是由 RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导 RNA 合成的，这是因为 RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的 RNA 不会带 poly A 尾。
当 RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续 4 个或 5 个 T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物 3' 端形成 1~4 个U 。
U6 和 H1 RNA 启动子是两种 RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～ 21ntRNA 和～ 50ntRNA 茎环结构（ stem loop ）。
在 siRNA 表达载体中，构成 siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成 siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状 RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体包含位于 RNA 聚合酶Ⅲ启动子和 4 ～ 5 T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有 1~4 个 U 3 ' 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成 siRNA 。
慢病毒包装原理介绍定稿版
慢病毒包装原理介绍 HUA system office room 【HUA16H-TTMS2A-HUAS8Q8-HUAH1688】慢病毒包装系统简介及应用一、慢病毒包装简介及其用途慢病毒（ Lentivirus ）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
目前慢病毒也被广泛地应用于表达 RNAi 的研究中。
由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的 siRNA 半衰期短，体外合成 siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。
采用事先在体外构建能够表达 siRNA 的载体，然后转移到细胞内转录 siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成 siRNA ，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。
在所构建的 siRNA 表达载体中，是由 RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导 RNA 合成的，这是因为 RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA 不会带 poly A 尾。
当 RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续 4 个或 5 个 T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物 3' 端形成 1~4 个U 。
U6 和 H1 RNA 启动子是两种 RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～ 21ntRNA 和～ 50ntRNA 茎环结构（ stem loop ）。
慢病毒包装原理-介绍之欧阳与创编
慢病毒包装系统简介及应用一、慢病毒包装简介及其用途慢病毒（ Lentivirus ）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
目前慢病毒也被广泛地应用于表达 RNAi 的研究中。
由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的 siRNA 半衰期短，体外合成 siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。
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当 RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续 4 个或 5 个 T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物 3' 端形成 1~4 个U 。
U6 和 H1 RNA 启动子是两种 RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～ 21ntRNA 和～ 50ntRNA 茎环结构（ stem loop ）。
在 siRNA 表达载体中，构成siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成 siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状 RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体包含位于 RNA 聚合酶Ⅲ启动子和 4 ～ 5 T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个 U 3 ' 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成 siRNA 。
慢病毒包装原理介绍
慢病毒包装原理介绍慢病毒包装系统简介及应用、慢病毒包装简介及其用途慢病毒(Lentivirus )载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
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在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成siRNA ;也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体包含位于RNA聚合酶川启动子和4?5 T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4个U 3 ' 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。
慢病毒包装原理 介绍
精品文档慢病毒包装系统简介及应用一、慢病毒包装简介及其用途型病毒）为基础发展起来的基 I HIV-1 （人类免疫缺陷慢病毒（ Lentivirus ）载体是以慢它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
因治疗载体。
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病毒载体的研究发展得很快，心肌从而达到持久性表达。
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的研究中。
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慢病毒包装系统简介及应用一、慢病毒包装简介及其用途慢病毒（Lentivirus ）载体是以HIV-1 （人类免疫缺陷I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
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在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
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在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
目前慢病毒也被广泛地应用于表达 RNAi 的研究中。
由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的 siRNA 半衰期短，体外合成 siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。
采用事先在体外构建能够表达 siRNA 的载体，然后转移到细胞内转录 siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成 siRNA ，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。
在所构建的 siRNA 表达载体中，是由 RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导 RNA 合成的，这是因为 RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的 RNA 不会带 poly A 尾。
当 RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续 4 个或 5 个 T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物 3' 端形成 1~4 个U 。
U6 和 H1 RNA 启动子是两种 RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA 和～ 50ntRNA 茎环结构（ stem loop ）。
在siRNA 表达载体中，构成 siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成 siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状 RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体包含位于 RNA 聚合酶Ⅲ启动子和 4 ～ 5 T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个 U 3 ' 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA 。
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慢病毒包装系统简介及应用
一、慢病毒包装简介及其用途
慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。
由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。
采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体，然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成 siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。
在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。
当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物 3' 端形成1~4个U。
U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA 茎环结构（stem loop）。
在siRNA表达载体中，构成 siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成 siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4
个U 3 '突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。
构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体。
慢病毒载体（Lentiviral vector）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。
慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。
慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。
慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。
为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。
二、这一系统的目的，主要是为了解决以下问题：
1. 对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi，cDNA克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。
2. 进行稳转细胞株的筛选；
3. 为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液；
在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。
三、慢病毒载体介绍
慢病毒载体（Lentiviral vector, LVs）是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效的将目的基因（或RNAi）导入动物和人的原代细胞或细胞系。
慢病毒载体基因组是正链RNA，其基因组进入细胞后，在细胞浆中被其自身携带的反转录酶反转为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后， DNA 整合到细胞基因组中。
整合后的DNA转录 mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生RNAi干扰。
慢病毒载体介导的基因表达或RNAi干扰作用持续且稳定，原因是目的基因整合到宿主细胞基因组中，并随细胞基因组的分裂而分裂。
另外，慢病毒载体能有效感染并整合到非分裂细胞中。
以上特性使慢病毒载体与其它病毒载体相比，比如不整合的腺病毒载体、整合率低的腺相关病毒载体、只整合分裂细胞的传统逆转录病毒载体，有鲜明的特色。
大量文献研究表明，慢病毒载体介导的目的基因长期表达的组织或细胞包括脑、肝脏、肌肉、视网膜、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、巨噬细胞等。
慢病毒载体不表达任何HIV-1蛋白，免疫原性低，在注射部位无细胞免疫反应，体液免疫反应也较低，不影响病毒载体的第2次注射。
四、慢病毒载体的构建
1. 构建原理
慢病毒属于逆转录病毒科，但其基因组结构复杂，除gag、pol和env这3个和单纯逆转录病毒相似的结构基因外，还包括4个辅助基因，vif、vpr、nef、vpu和2个调节基因tat和rev。
HIV 21是慢病毒中最具特征性的病毒，第一个慢病毒载体系统即以此病毒为基础进行构建的。
慢病毒载体的构建原理就是将HIV 21基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列)和编码反式作用蛋白的序列进行分离。
载体系统包括包装成分和载体成分：包装成分由HIV 21基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能反式提供产生
病毒颗粒所需的蛋白；载体成分与包装成分互补，含有包装、逆转录和整合所需的
HIV 21顺式作用序列。
同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。
为降低两种成分同源重组产生有复制能力的病毒(RCV)的可能性，将包装成分的5 ′ LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子，3 ′ LTR 换成SV40 polyA位点等。
将包装成分分别构建在两个质粒上，即一个表达gag 和pol、另一个表达env。
根据这个原理，Naldini和Kafri等构建了三质粒表达系统。
2. 三质粒表达系统--三质粒来包装产生重组慢病毒：
三质粒表达系统包括包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒。
其中包装质粒在CMV启动子的控制下，表达HIV 21复制所需的全部反式激活蛋白，但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白vpu；包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒G蛋白(VSV 2G)，应用 VSV 2G包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性，允许通过高速离心对载体进行浓缩，提高了滴度；转移质粒中除含有包装、逆转录及整合所需的顺式序列，还保留350 bp的gag和RRE，并在其中插入目的基因或标志基因 (绿色荧光蛋白GFP)。
将载体系统分成三个质粒最大的益处是使序列重叠的机会大大减少，减少载体重组过程中产生RCV的可能性。
通过三质粒共转染 293T 细胞，超速离心后病毒滴度可达109IU /ml。
3. 四质粒表达系统
为了减少HIV 21包装结构的序列同源性，进一步减少重组成RCV的可能性，Dull等人将辅助基因去除。
但由于gag2pol的转运需要rev，因此，在上述的三质粒系统的基础上，构建成四质粒表达系统，该系统加上含rev的质粒减少了产生RCV的可能性，而且对非分裂期细胞转导效率无影响。
五、慢病毒载体应用
1. 将目的基因/RNAi基因转入难以转染的细胞，比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞；
2. 将目的基因/RNAi基因转入动物组织，以期获得长期表达；
3. 构建稳定表达目的蛋白/RNAi的细胞系，再用exvivo的方法导入动物体内；
4. 基因治疗；
5. 转基因动物；
6. 基因敲除；
7. 药物研究：构建表达受体蛋白的细胞系，研究药物的作用；
8. 快速建立生产目的蛋白的细胞系，非常有前途的真核细胞表达方法。
（注：专业文档是经验性极强的领域，无法思考和涵盖全面，素材和资料部分来自网络，供参考。
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