慢病毒包装简介及应用

慢病蠹包装系统简介及应用

、慢病蠹包装简介及其用途

慢病蠹(Lentivirus )载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷I型病蠹)为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病蠹载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病蠹载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。

目前慢病蠹也被广泛地应用丁表达RNAi的研究中。由丁有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体，然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色丁体外合成siRNA ,在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶用启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶用有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶用遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3'端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶m依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位丁转录区的上游，适合丁表达〜21ntRNA和〜50ntRNA茎环结构(stem loop )。在siRNA 表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成siRNA ;也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA),载体包含位丁RNA聚合酶用启动子和4〜5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4个U 3 '突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA ,然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体。

慢病蠹载体(Lentiviral vector )较逆转录病蠹载体有更广的宿主范围，慢病蠹能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病蠹载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病蠹，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA ,实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。

慢病蠹表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病蠹包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病蠹载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病蠹颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病蠹的包装，包装好的假病蠹颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上活液后，可以直接用丁宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平■的表达效应分子。

二、这一系统的目的，主要是为了解决以下问题：

1. 对丁一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi, cDNA克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。

2. 进行稳转细胞株的筛选；

3. 为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病蠹液；

在细胞相关的实验操作中，对丁一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细

胞，通过病蠹介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效

瞬时表达。

三、慢病蠹载体介绍

慢病蠹载体（Lentiviral vector, LVs ）是在HIV-1病蠹基础上改造而成的病蠹载体系统，它能高效的将目的基因（或RNAi）导入动物和人的原代细胞或细胞系。慢病蠹载体基因组是正链RNA,其基因组进入细胞后，在细胞浆中被其自身携带的反转录酶反转为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录mRNA,回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生RNAi干扰。

慢病蠹载体介导的基因表达或RNAi干扰作用持续且稳定，原因是目的基因整合到宿主细胞基因组中，并随细胞基因组的分裂而分裂。另外，慢病蠹载体能有效感染并整合到非分裂细胞中。以上特性使慢病蠹载体与其它病蠹载体相比，比如不整合的腺病蠹载体、整合率低的腺相关病蠹载体、只整合分裂细胞的传统逆转录病蠹载体，有鲜明的特色。大量文献研究表明，慢病蠹载体介导的目的基因长期表达的组织或细胞包括脑、肝脏、肌肉、视网膜、造血干细胞、骨髓问充质干细胞、巨噬细胞等。

慢病蠹载体不表达任何HIV-1蛋白，免疫原性低，在注射部位无细胞免疫反应，体液免疫反应也较低，不影响病蠹载体的第2次注射。

四、慢病蠹载体的构建

1. 构建原理

慢病蠹届丁逆转录病蠹科，但其基因组结构复杂，除gag、pol和env这3 个和单纯逆转录病蠹相似的结构基因外,还包括4个辅助基因，vif、vpr、nef、vpu和2个调节基因tat和rev。HIV 21是慢病蠹中最具特征性的病蠹，第一个慢病蠹载体系统即以此病蠹为基础进行构建的。慢病蠹载体的构建原理就是将HIV 21基因组中的顺式作用元件（如包装信号、长末端重复序列）和编码反式作用蛋白的序

列进行分离。载体系统包括包装成分和载体成分：包装成分由HIV 21 基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能反式提供产生

病蠹颗粒所需的蛋白；载体成分与包装成分互补，含有包装、逆转录和整合所需的HIV 21顺式作用序列。同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。为降低两种成分同源重组产生有复制能力的病蠹(RCV)的可能性，将包装成分的5 ' LT颇成巨细胞病蠹(CMV)立即早期启动子，3 ' LT觑成SV40