仪器分析 高效液相色谱法 人卫版

溶解；(也有适用宽pH范围的键合相)。
二 高效液相色谱法的流动相
➢对流动相的要求：
➢与固定相不发生化学反应。
➢对试样有适宜的溶解度。使k在1~10范围内
➢与检测器相适应。例如用紫外检测器时，选用截止 波长小于检测波长的溶剂。
➢纯度高，粘度小。低粘度流动相如甲醇﹑乙腈等可 以降低柱压，提高柱效。
（一）流动相对分离的影响
胶Spherisorb 上键合了十八烷基硅烷。
键合相的性质
➢含碳量：含碳的百分数 ➢覆盖度 ：已反应的硅醇基数目占硅胶表
面硅醇基总数的比例 ➢封尾（end-capping）：在键合反应后，用
三甲基氯硅烷等进行钝化处理，减少残余 硅醇基。
键合相的特点
➢使用过程中不流失； ➢化学稳定性好； ➢适于梯度洗脱； ➢载样量大 ➢注意： 流动相的pH一般应在3-8，否则会引起硅胶
2.化学键合相是什么？常用的化学键合相有 哪几种？分别应用于哪些液相色谱中？
2.什么叫正相色谱？什么叫反相色谱？各适 用于分离哪些化合物？
第四节 高效液相色谱仪
➢组成
➢输液系统 ➢进样系统 ➢色谱柱系统 ➢检测系统 ➢数据记录处理系统
特点：高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。
3、传质阻抗
（1）固定相传质阻抗 Cs：在化学键合相色谱法中，键合 相多为单分子层，因此固定相传质阻抗可以忽略。
（2）流动相传质阻抗 Cm：由于处在流路中心的流动相中
的组分分子还未来得及扩散进入流动相和固定相界面，就被
流动相带走，因此总是比靠近填料颗粒与固定相达到分配平
衡的分子移行得快些，致使峰展宽。
第二十章 高效液相色谱法
Chap20 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
主要内容
一
高效液相色谱法的主要类型
二 高效液相色谱法的固定相和流动相
三 高效液相色谱速率理论和分离方法的选择
四
高效液相色谱仪
五
超高效液相色谱法简介
六
定性与定量分析方法
高效液相色谱法（HPLC），是以液体为流动 相，采用高压输液系统、高效固定相及高灵敏 度检测器进行复杂样品分离分析的色谱方法。 20世纪60年代在经典液相色谱法的基础上，引 入气相色谱法的理论和实验技术发展而成的现 代液相色谱分析方法，具有分离效率高、选择 性好、分析速度快、检测灵敏度高、操作自动 化和应用范围广的特点。
1、离子对模型
流动相（m）
B+H+⇌ BH+
+
RSO3Na ⇌ RSO3- +Na +
固定相（s）
⇌
· · （BH+ RSO3-）m ⇌ （BH+ RSO3-）s
离子对
· · 通式： Bm+ Am-
⇌（B +
A
-）[B A [B ]m
]s
[B A ]s [B ]m[A ]m
其他色谱类型
➢亲合色谱法（affinity chromatography；AC） ➢手性色谱法（chiral chromatography；CC） ➢胶束色谱法（micellar chromatography；MC） ➢电色谱法（electrochromatography；EC）
化学键合相色谱法
二 化学键合相色谱法
输液系统
输液泵操作注意事项： ➢防止固体微粒进入泵体 ➢流动相不应含有腐蚀性物质 ➢防止溶剂瓶内的流动相被用完 ➢不超过规定的最高压力 ➢流动相一般应该先脱气
梯度淋洗装置
外梯度: (高压梯度)
利用两台高压输液 泵，将两种不同极性的 溶剂按一定的比例送入 梯度混合室，混合后进 入色谱柱。
内梯度:(低压梯度)
第二节 高效液相色谱法的固定相和流动相
一 高效液相色谱法的固定相
• 固定相应符合下列要求：
• 颗粒细且均匀； • 传质快； • 机械强度高，能耐高压；
• 化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。
（一）键合相的种类
➢非极性键合相 ：
➢非极性烃基，如十八烷基（C18）﹑辛烷基（C8） ﹑甲基（C1）与苯基等键合在硅胶表面；
相对分离的选择性有很大作用，因此分里选择性高。 • 一般在室温条件下进行分离，不需要高柱温。
第一节 高效液相色谱法的主要类型
一、主要类型
四类基本类型色谱法
➢分配色谱法（partition chromatography） ➢吸附色谱法（adsorption chromatography） ➢离子交换色谱法（IEC） ➢空间排阻色谱法（SEC）
• 以化学键合相为固定相的色谱法，简称键合相 色谱法(bonded phase chromatography；BPC)
• 化学键合相：采用化学反应的方法将官能团键 合在载体表面所形成的固定相
➢优点：
➢固定相的均一性和稳定性好，在使用过程中不易流 失，使用周期长；
➢柱效高；重现性好； ➢能使用的流动相和键合相的种类多，分离选择性高
使用颗粒较小的固定相，粘度较低的流动相。
H=A+Cmu+Csmu
（1）采用小粒径、粒度分布均匀的球形化学键合相 （2）采用粘度较小的流动相 （3）采用合适的柱温，一般以25℃~30℃为宜 （4）合适的流动相流动速度，一般1mL/min左右
二 高效液相色谱分离方法的选择
1.简述高效液相色谱法和气相色谱法的异同？
➢适用范围：溶于有机溶剂的极性至中等极性 的分子型化合物
➢如一些在硅胶柱上难分离的物质
➢分离机制: ➢分配：把有机键合层作为一个液膜看待，溶质在
两相的溶解
➢吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和定
向作用
➢ 分离选择性： ➢极性强的组分k大，后洗脱出柱。 ➢流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分k减 小，tR 减小。
➢离 子 抑 制 色 谱 法 （ ion suppression
chromatography；ISC ）
➢用少量弱酸、弱碱或缓冲溶液，调节流动相 的pH，抑制有机弱酸、弱碱的离解，增加 疏水缔合作用，使k变大。
➢适用于3≤pKa≤7的弱酸、7≤pKa≤8的弱碱
（三）反相离子对色谱法
把离子对试剂加入到含水流动相中，组分离 子在流动相中与离子对试剂的反离子 （counter ion）生成中性离子对，增加溶质与 非极性固定相的作用，使k增加，改善分离效 果。一般用于分离可离子化或离子型的化合 物。
Cm
mdP2
Dm
dp为填充颗粒直径 Dm为组分在流动相中扩散系数
m 与色谱柱及其填充情况有关
（3）静态流动相传质阻抗 Csm ：由于组分的部分分子是先 进入滞留在固定相微孔内的静态流动相中，再与固定相进行 分配，因而相对较晚回到流路中，引起展峰宽。
Csm ∝dp2， Csm ∝1/Dm，而Dm∝T/η
一台高压泵, 通 过比例调节阀,将两种 或多种不同极性的溶 剂按一定的比例抽入 高压泵中混合。
梯度洗脱装置优、缺点
➢缩短分析周期 ➢提高分离效果 ➢改善峰形 ➢增加检测灵敏度 ➢基线漂移、影响重复性
二、分离和进样系统
➢进样器
➢进样阀（六通阀）、自动进样装置
➢色谱柱（column）
➢由柱管和固定相组成 ➢分析柱、制备柱 ➢性能评价
➢混合溶剂（二元或多元流动相）
第三节 高效液相色谱速率理论和分离方法选择 一 高效液相色谱速率理论 1、涡流扩散
A=2λdp
为了减少涡流扩散引起的峰展宽，需要降低λ和dp ， 采用球形，粒径较小，粒度均匀，以高压匀浆填充。 可以降低A。
2、纵向扩散
Β = 2γDm
其中Dm 和流动相的粘度成反比，与温度成正比。HPLC 的流动相是液体，其粘度比气体粘度大得多（约100倍）， 而且常在室温下进行操作，因此组分在液体流动相中扩散系 数比在气体流动相中的扩散系数要小得多，所以HPLC中的 纵向扩散可以忽略。
R n α -1 k2 4 α 1 k2
➢ n由色谱柱（固定相）性能决定
➢ α主要受溶剂种类的影响 ➢ k受溶剂配比的影响
（二）流动相的强度和选择性
➢溶剂的极性（强度）
➢正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 ➢反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强
➢溶剂的选择性
➢不同种类的溶剂，分子间的作用力不同， 故选择性不同
溶质的保留主要是溶质分子 与极性溶剂分子间的排斥力， 促使溶质分子与键合相的烃 基发生疏水缔合。
➢保留行为的主要影响因素
➢1、溶质的分子结构（极性） 极性越弱，疏水性越强，k 越大，tR也越大。
同系物碳数越多，极性越弱，k越大；
引入极性取代基，降低疏水性，k值变小。
➢2、固定相
键合烷基的疏水性随碳链的延长而增加，溶质的k 也增大。
与经典液相色谱法相比
• 颗粒极细（一般为10m以下）、规则均匀的固 定相，（键合相）传质阻抗小，柱效高，分离效 率高；
• 高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快； • 高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外检测器
最小检测限可达109g，而荧光检测器最小检测限 可达1012g。
与气相色谱法相比
• 不受试样的挥发性和热稳定性的限制，应用范围广。 • 可选用不同性质的各种溶剂作为流动相，而且流动
3、适用范围和离子对试剂的选择
• 适用范围：有机酸、碱、盐，离子型和非离子型化
合物的混合物。
• 分析酸类或带负电荷物质：用季铵盐，如四丁基铵
磷酸盐（TBA）和溴化十六烷基三甲基铵（CTAB） 等
• 分析碱类或带正电荷的物质：用烷基磺酸盐或硫酸
盐，如正戊烷基磺酸钠（PICB5）、正己烷基磺酸 钠（PICB6）
硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶质的k 越大。