荧光分析法
荧光分析法
光致发光：
吸收某种波长的光后发射出比吸 收波长更长的光的现象。 (荧光和磷光)
荧光分析法 (fluorormetry)
荧光光谱→定性分析 荧光强度→定量分析 分类： 原子荧光分析、分子荧光分析
紫外-可见荧光分析 红外荧光分析 X射线荧光分析
第一节 基本原理 一、分子荧光
（一）分子荧光的产生 1、分子的电子能级与激发过程
=
hc
E
2、荧光的产生
振动驰豫
内转换 体系间跨越
磷光
吸收
荧光
外转换
振动驰豫
发生在同一电子能级内，分子通过
碰撞以热的形式损失部分能量，从较高
振动能级下降到该电子能级的最低振动
能级上。无辐射跃迁。
内转换
即激发态分子将多余的能量转变 为热能，从较高电子能级降至较低的 电子能级。内转换也属于无辐射跃迁。
OHH+
NH-
pH<2
pH7~12 兰色荧光
pH>13
荧光熄灭
荧光熄灭（荧光猝灭）：由于荧光物质分子与 溶剂分子或其它溶质分子碰撞而引起荧光强度 降低或荧光强度与浓度不呈线性关系的现象。 荧光熄灭剂(quenching medium)：引起荧光熄灭 的物质。如卤素离子、重金属离子、氧分子以 及硝基化合物、重氮化合物、羰基、羧基化合 物均为常见的荧光熄灭剂。
外转换
荧光 较高激发态分子经无辐射跃迁降 至第一电子激发单重态的最低振动能 级后，仍不稳定，停留较短时间后
（约 10-8 s ，称作荧光寿命），以光
辐射形式放出能量，回到基态各振动
能级，这时所发射的光称为荧光。
系间跨跃
第一电子激发态的最低振动能级经过另一 个无辐射跃迁转移至激发三重态，称为系间跨 跃。
荧光分析法
荧光分析法一、基本原理某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光，根据荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的方法，称为荧光分析法（fluorescence analysis）。
荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、需样量少和方法简便等优点，它的测定下限通常比分光光度法低2~4个数量级，在生化分析中的应用较广泛。
在室温下分子大都处在基态的最低振动能级，当受到光的照射时，便吸收与它的特征频率相一致的光线，其中某些电子由原来的基态能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态中的各个不同振动能级，这就是在分光光度法中所述的吸光现象。
跃迁到较高能级的分子，很快（约10-8s）因碰撞而以热的形式损失部分能量，由所处的激发态能级下降到第一电子激发态的最低振动能级，能量的这种转移形式，称为无辐射跃迁。
由第一电子激发态的最低振动能级下降到基态的任何振动能级，并以光的形式放出它们所吸收的能量，这种光便称为荧光。
荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光以后，物质本身所发射的光的强度。
物质吸收的光，称为激发光；物质受激后所发射的光，称为发射光或荧光。
如果将激发光用单色器分光后，连续测定相应的荧光的强度所得到的曲线，称为该荧光物质的激发光谱（excitation spectrum）。
实际上荧光物质的激发光谱就是它的吸收光谱。
在激发光谱中最大吸收处的波长处，固定波长和强度，检测物质所发射的荧光的波长和强度，所得到的曲线称为该物质的荧光发射光谱，简称荧光光谱（fluorescence spectrum）。
在建立荧光分析法时，需根据荧光光谱来选择适当的测定波长。
激发光谱和荧光光谱是荧光物质定性的依据。
对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。
荧光物质的线性范围一般在0.00005-100微克/ml,当荧光物质溶液的吸光度小于或等于0.05时荧光强度和浓度才成线性关系。
荧光分析法ppt
荧光分析法的化学基础
荧光物质的化学结构
荧光物质的化学结构决定了其荧光性质，如荧光量子产率、荧光 波长等。
荧光物质的激发态性质
荧光物质的激发态性质对其荧光性质也有重要影响，如激发态的 稳定性、激发态的能量转移等。
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详细描述
荧光分析法可用于检测生物样品中的肿瘤标志物、药物浓度、DNA等物质。通过荧光探针、荧光免疫 分析等方法，可实现对肿瘤标志物、药物浓度的快速检测，为肿瘤诊断、药物治疗监测等提供依据。 此外，荧光分析法还可用于DNA检测，为遗传病诊断、亲子鉴定等提供技术支持。
荧光分析法在食品安全中的应用
总结词
荧光分析法的缺点
易受干扰
荧光分析法可能会受到其他物质的干扰，影响检测结果的准确 性。
不稳定性
荧光物质的荧光光谱可能会随着环境条件的变化而发生变化， 导致分析结果不稳定。
成本高
荧光分析法所需的仪器设备相对昂贵，而且需要专业人员操作 和维护。
荧光分析法的改进与发展趋势
优化荧光探针
通过改进荧光探针的设计和合成方法，提高荧光分析法的灵敏度 和特异性。
02
荧光分析法的原理
荧光分析法的物理基础
01
分子能级
荧光分析法涉及分子的能级跃迁，即分子从基态跃迁到激发态，再从
激发态返回到基态的过程。
02 03
激发态与基态的能量差
荧光分析法利用了激发态与基态之间存在的能量差，当分子吸收特定 波长的光能后，会从基态跃迁到激发态，之后释放出特定波长的荧光 。
荧光的产生
荧光物质的基态性质
荧光物质的基态性质同样影响其荧光性质，如基态的稳定性、基 态与激发态之间的跃迁能量等。
荧光分析法
E h
式中:
hc
p
h
h——普朗克常数，等于6.626×10-34 J· s; c——光速，等于2.998× 1010cm/s.
在光致激发和去激发光中，价电子可以处在不同的自选状态，
常用电子自旋状态的多重性来描述。 一个所有电子自旋都配对的分子的电子态称为单重态，用S表示， 基态为单重态的分子具有最低电子能，用S0 表示如果电子在跃 迁过程中改变了自旋方向，使分子具有两个自旋平行的电子， 这样的电子态称为三重态，用T表示
3.温度的影响
荧光强度对温度较敏感，因此荧光分析一定要严格控制温度。
温度升高，绝大多数荧光物质的荧光效率降低，荧光强度减低。 因为温度升高，激发态分子与溶剂分子的碰撞频率增大，增加 了外转移的非辐射过程，导致溶液荧光强度降低，因此，可通 过降低温度的方法提高荧光效率和荧光强度。
4.溶液pH的影响
荧光分析法可采用足够强的光源和高灵敏度的检测放大系统，从而 获得比可见光吸光度法高的多的灵敏度。
影响荧光强度的因素
1.溶剂的影响
而增强。
• 荧光峰的波长随溶剂的介电常数增大而增大，强度随极性的增大
• 2.溶液粘度的影响
• 荧光强度随着介质粘度的升高而增强，这是由于介质粘度增强，
减少了分子碰撞，从而减少了能量损失的结果
激发单色器 光源 样品池 垂直
指示器· 放大器 记录器
发 射 单 色 器 检测器
国产970CRT型荧光分光光度计
1.激发光源
荧光测量中所用的光源一般比紫外-可见分光光度计所使用的光
源发光强度大，激发光源通常采用发射强度高的汞弧灯、氢灯
或氙弧灯。氙弧灯产生强烈的连续辐射，其波长范围在
荧光分析法的原理和应用有哪些
荧光分析法的原理和应用有哪些1. 原理荧光分析法是一种利用物质在受到激发后发射荧光的光谱分析方法。
其原理是通过物质在受到光激发后，能量被转移到某些特定的电子能级上，然后由该能级经历跃迁发射荧光的过程。
荧光分析法的原理主要包括下面几个方面：•荧光激发：将样品暴露在激发光源下，激发光的特定波长和强度能够激发荧光染料或被测物质中的相应电子跃迁。
•荧光发射：物质受到激发后，电子由激发态返回基态，产生特定波长的荧光发射。
荧光的发射波长和强度与样品中的化学成分和浓度有关。
•荧光信号检测：通过荧光光谱仪等检测设备测量样品发出的荧光信号，获得荧光强度和发射波长的信息。
2. 应用荧光分析法在许多领域有着广泛的应用。
下面列举了几种常见的应用：2.1 荧光显微镜荧光显微镜利用荧光分析法原理，结合显微镜观察和荧光的发射特性，可以用于生物学、医学、材料科学等领域的研究。
通过标记荧光染料来观察或追踪细胞、分子或其他生物体的结构和功能。
2.2 荧光光谱仪荧光光谱仪是一种用于测量样品荧光发射光谱的仪器。
它可以用于分析和定量测量不同类型的化合物，例如荧光染料、生物分子、环境污染物等。
荧光光谱仪广泛应用于分析化学、生物化学、环境科学等领域。
2.3 荧光染料的标记和追踪荧光染料在生物医学研究、生命科学和分子生物学等领域中被广泛用作标记和追踪剂。
通过将荧光染料与分析目标物相结合，可以实现对生物分子、细胞、组织和病原体等的定位和追踪。
2.4 荧光传感器荧光分析法还可以用于制备荧光传感器，用于检测和定量分析化学物质。
这些传感器可以通过与特定的化学物质相互作用，产生特定的荧光响应，从而实现对目标化合物的检测和测量。
2.5 荧光生物成像荧光分析法在生物医学成像中有着重要的应用。
通过标记荧光分子，可以实现对生物体内部结构和功能的成像观察。
荧光生物成像技术在癌症研究、药物筛选、生物反应动力学等方面具有潜在的应用价值。
3. 总结荧光分析法是一种基于荧光现象的光谱分析方法，具有灵敏度高、选择性好、非破坏性等优点。
荧光分析法原理
荧光分析法原理
荧光分析法原理是基于物质在受激光或其他激发光源照射下吸收能量，然后再发射出能量较低的荧光光子。
荧光分析方法利用物质发出的荧光光子的特性，可实现对物质的检测和分析。
在荧光分析中，样品首先被激发光源照射，被激发的样品分子吸收能量，部分电子跃迁至高能级轨道。
随后，这些激发态分子会通过非辐射跃迁回到基态，释放出能量。
这种能量以荧光光子的形式发射出来，并具有特定的波长和强度。
通过测量和分析样品发射的荧光光子，可以获取关于样品的信息。
荧光光子的波长和强度与样品分子的结构以及环境有关，因此可以利用荧光分析法进行物质的定性和定量分析。
荧光分析方法具有高灵敏度、高选择性和广泛的应用范围。
它可以被用于分析有机化合物、无机化合物、生物大分子以及药物等多种样品。
同时，荧光分析方法还可以结合其他技术，如色谱、电泳等，实现对复杂样品的分离和分析。
总之，荧光分析方法以物质发射的荧光光子为基础，利用荧光光子的特性对样品进行检测和分析。
它在科研、工业生产以及环境监测等领域具有重要的应用价值。
荧光分析法
3 2 1 V＝0
吸光
无辐射跃迁
3 2 1 V＝0
无辐射跃迁
吸光
荧光
3 2 1 V＝0
荧光的产生
蒽结晶体或乙醇溶液吸收 366nm 紫外光， 产生青紫色的荧光。
激发单重态
荧光
基态
（二）分子荧光的分类
• 紫外-可见光荧光 • X射线荧光 • 红外光荧光
二、荧光激发光谱(Excitation spectrum) 和荧光发射光谱(fluorescence spectrum)
使荧光效率提高；吸电子取代基，如－COOH、
NO2等使荧光减弱。
3. 荧光试剂
• 大部分化合物由于不吸收紫外光或荧光效率低 而不发生荧光或荧光很弱； • 为了提高荧光分析法的灵敏度、选择性，扩大 荧光分析的范围，研究了一类试剂，它们一些 化合物反应能生成强荧光性产物； • 常见的荧光试剂有：
– 荧光胺 能与脂肪胺或芳香胺生成强荧光物；
检测器
荧光分光光度计的结构示意图
I0
Il
F
溶液的荧光测定
• 激发光谱的测定 扫描激发单色器（发射单 色器固定在较长的波长）。 • 荧光光谱的测定 激发单色器固定在最大吸 收波长，扫描发射单色器。 • 定量分析条件的确定 最大激发波长和产生 的最大荧光波长（最灵敏的条件）。
二、荧光分析新技术
• 激光荧光分析 以激光作为光源，大大提高分析 的灵敏度和选择性； • 时间分辨荧光分析 利用不同物质的荧光寿命不 同，在激发和监测之间的延缓时间不同分别检测；
ex 205 nm em 278 nm 0.11
286 nm 321 nm 0.29
Байду номын сангаас
356 nm 404 nm 0.36
荧光分析法的原理和应用实例
荧光分析法的原理和应用实例一、荧光分析法的原理荧光分析法是一种利用物质在激发状态下发射特定波长的荧光光子进行分析的方法。
其原理基于分子从基态被激发到激发态产生荧光，然后通过检测荧光的强度或波长来定量或鉴定物质的方法。
1. 激发和荧光现象荧光现象是一种电子在激发态能级上吸收能量，由高能级跃迁到低能级时发射光子的现象。
当物质受到激发时，其原子或分子中的电子会从基态跃迁到激发态，吸收外界能量，形成激发态的物质。
随后，这些激发态的电子会以不同的途径返回基态，释放出能量并发射光子，产生荧光现象。
2. 荧光的特性荧光具有以下几个特性： - 荧光是无热的，表示物质在感光过程中不会产生热量。
- 荧光是瞬时的，表示荧光的发射时间极短，一般为纳秒级别。
- 荧光的发射波长大于激发波长，表示物质在激发后发射的光子具有较长的波长。
- 荧光的强度与物质的浓度成正比，因此荧光法可用于定量分析。
3. 荧光分析法的基本步骤荧光分析法通常包括以下几个步骤： 1. 样品制备：将待测物质制备成适合荧光分析的样品。
2. 激发：通过合适的激发波长和光源，将样品中的荧光物质激发至激发态。
3. 荧光检测：利用荧光检测仪器测量样品发射的荧光强度或荧光波长。
4. 数据分析：根据测得的荧光结果进行数据处理和分析，得出定量或鉴定结果。
二、荧光分析法的应用实例荧光分析法在各个领域都有广泛的应用，下面将介绍几个典型的例子。
1. 生物医学领域的应用荧光分析法在生物医学领域中被广泛应用于荧光标记和荧光定量分析。
例如，研究人员可以将药物或特定分子标记为荧光物质，通过观察标记物在组织或细胞中的分布和浓度变化来研究其在生物体内的作用机制。
荧光定量分析则可用于测量生物体内的特定分子浓度，如检测血液中的白细胞数量或病原体的存在。
2. 环境监测领域的应用荧光分析法在环境监测领域中也有重要应用。
例如，通过标记环境中的特定有害物质，如重金属离子或有机污染物，研究人员可以利用荧光分析法监测水体、空气或土壤中的污染物浓度，从而评估环境质量和生态风险。
荧光分析法
四氯化碳的拉曼光与激发光波长相近，即与 荧光波长相差较大，对荧光检测干扰较小。
影响荧光强度的主要因素
是波长比入射光较 长的拉曼散射光。因为物质发射的荧光波长比 激发光（即入射光）波长长。
• 消除溶剂拉曼光干扰的方法： - 选择合适的溶剂
- 改变激发光波长，使拉曼光向短波方向移动 如硫酸奎宁的测定
1.荧光检测的基本原理
14
2.荧光的激发光谱和发射光谱
激发光谱（excitation spectrum)：固定测量波长， 将激发光的光源分光，测定不同波长的激发光照射 下所发射的荧光强度的变化，以IF —λ激发作图，便 可得到荧光物质的激发光谱。 发射光谱或荧光光谱（fluorescence spectrum)：固 定激发光波长和强度, 让物质发射的荧光通过单色 分光,以测定不同波长的荧光强度, 以IF—λ荧光作图 ，便可得到荧光物质的荧光光谱。
（四）、影响荧光强度的外部因素
温度
溶剂
酸度
01
02
03
荧光熄 灭剂
散射光
04
05
1. 温度的影响
• 随温度降低，荧光强度增加。如荧光素钠在 0℃以下，每降10℃荧光效率增加3％。-80 ℃ 时达到100％。
• 原因是温度升高，分子运动速度加快， 碰撞机率增加，使无辐射跃迁增加，因 而降低了荧光；
常见溶剂在不同激发光波长下的拉曼光波长
激发光 波长 248 水 271 溶剂拉曼光波长 乙醇 环己烷 267 四氯化碳 － 氯仿 －
267
313
365 405 436
350
416 469 511
344
405 459 500
344
408 458 499
《荧光分析法》课件
通过改进技术手段，实现多组分的同步检 测，提高检测效率。
微型化与便携化
智能化与自动化
随着技术的进步，荧光分析仪器将更加微 型化和便携化，方便现场快速检测。
结合人工智能和自动化技术，实现荧光分 析的智能化和自动化，减少人为误差和操 作复杂度。
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成和含量。
荧光分析法的应用领域
环境监测
荧光分析法可以用于检测水体 、土壤和空气中的污染物，如
重金属、有机物和农药等。
生物医学研究
荧光分析法可以用于检测生物 体内的标记物、蛋白质、核酸 和细胞等，有助于生物医学研 究和诊断。
食品安全检测
荧光分析法可以用于检测食品 中的添加剂、农药残留和有害 物质等，保障食品安全。
高特异性
荧光分析法可以针对特定的化学物质 或生物分子，提供高度特异性的检测， 降低误报率。
可视化结果
荧光分析法的结果可以通过肉眼直接 观察或使用荧光显微镜进行观察，方 便快捷。
应用广泛
荧光分析法可以应用于多种领域，如 生物医学、环境监测、食品安全等。
荧光分析法的缺点
01
02
03
04
样品处理复杂
荧光分析法通常需要对待测样 品进行预处理，如提取、纯化
荧光寿命的测量
通过测量荧光物质在激发光停止后荧光强度随时间的变化，可以了解荧光物质从 激发态回到基态的速率常数和荧光寿命。
时间分辨荧光光谱的测量
通过测量不同时间点的荧光光谱，可以了解荧光物质在激发态的动态过程和能量 转移过程。
荧光量子产率的实验技术
荧光量子产率的测量
通过测量荧光物质在特定波长激发下的荧光发射光子数和激发光子数，可以计算出荧光量子产率，了 解荧光物质的光致发光效率。
化学分析技术中的荧光法
化学分析技术中的荧光法荧光法是化学分析技术中常用的一种方法，其基本原理是利用物质吸收能量后产生的激发态分子的自发辐射。
荧光法具有高灵敏度、高选择性、快速、非破坏性等优点，因此在分析领域中得到了广泛应用。
一、荧光现象荧光现象是很多物质在受激光照射或吸收其他电磁波后，从基态跃迁到激发态，再从激发态衰减到基态时，自然辐射出的光现象。
其光谱分布与吸收光谱不同，一般在较长波长处产生。
荧光的激发带宽度很大（可以从两纳米到上百纳米），且激发光对物质的化学性质影响较小，因此在分析领域中具有独特的优势。
二、荧光分析法1. 直接测量法荧光分析法一般分为直接测量法和间接测量法两类。
直接测量荧光分析法中，荧光物质为测量对象，测量时将激发光辐射到样品中，测量样品发出的荧光强度，然后通过与标准曲线比较，可以计算出样品中荧光物质的浓度。
直接测量荧光分析法具有快速、灵敏度高、稳定性好等优点。
但它也面临着无法消除因测量系统的几何位置和分析效果差异而引起的扰动信号等问题。
2. 间接测量法另一种荧光分析法是间接测量法。
它是通过荧光物质与已知物质的相互作用来测定未知物质的量。
例如，糖类物质可以被邻苯二甲酸酐（PA）酰化成PA-糖酐，这种物质能够与荧光比爱琴素（ANS）结合产生荧光，而且糖酐的数量与荧光信号的强度成正比。
通过对标准曲线的制备，可以计算出未知糖酐的浓度。
间接测量荧光分析法的优点是可以避免测量系统的几何位置和分析效果差异而引起的扰动信号的干扰，但它也存在某种程度上的样品处理和校准难度大的问题。
三、荧光分析在生命科学中的应用荧光分析方法在生命科学领域中已经得到了广泛的应用，例如，在生化学、免疫学、细胞、化学生物学等各个领域。
在免疫学中，荧光抗体标记技术被广泛用于检测蛋白质和微生物。
常用的标记染料包括荧光素和菲罗达胺等。
荧光分析方法还能够用于细胞成像和病理学分析。
蛋白质标记生物发光剂（luciferase）能够被转染到细胞内，进而检测细胞中的信号通路或者探究细胞蛋白质之间的交互作用。
荧光分析法原理
荧光分析法原理荧光分析法是一种基于物质在激发光源作用下发出的荧光信号来分析物质的方法。
荧光分析法是一种高灵敏度、高选择性和非破坏性的分析方法，广泛应用于生物医药、环境监测、食品安全等领域。
本文将介绍荧光分析法的原理及其应用。
荧光分析法的原理是基于分子在受到激发光源激发后，从基态跃迁到激发态，再返回到基态时所发出的荧光信号。
在激发光源的作用下，物质中的分子吸收能量，电子跃迁至激发态，当电子返回到基态时，会放出能量，这种能量以荧光的形式发出。
荧光分析法通过测量样品发出的荧光强度来定量分析样品中的物质成分。
荧光分析法的原理主要包括激发光源、激发光源与样品的相互作用、样品的荧光发射及荧光信号的检测。
首先，激发光源通过特定波长的光激发样品中的分子，使其跃迁至激发态；然后，样品中的分子在激发态停留的时间极短，通常为纳秒量级，之后返回到基态时会释放出荧光；最后，荧光信号通过荧光检测器进行检测和记录。
荧光分析法通常需要使用荧光光谱仪进行测量，通过记录样品在不同波长下的荧光强度来获取样品的荧光光谱，从而进行定量分析。
荧光分析法具有很高的灵敏度，因为荧光信号的强度和物质的浓度呈线性关系，而且荧光信号通常远远高于背景信号，因此可以检测到极低浓度的物质。
同时，荧光分析法还具有很高的选择性，可以通过选择合适的激发波长和检测波长来对不同物质进行区分。
另外，荧光分析法还是一种非破坏性的分析方法，对样品的破坏很小，适用于对样品进行多次检测的情况。
荧光分析法在生物医药、环境监测、食品安全等领域有着广泛的应用。
在生物医药领域，荧光分析法常用于药物分析、蛋白质检测、细胞成像等方面；在环境监测领域，荧光分析法可用于水质、大气、土壤等环境样品中有机污染物的检测；在食品安全领域，荧光分析法可以用于食品中有害物质的检测，如农药残留、食品添加剂等。
总之，荧光分析法作为一种高灵敏度、高选择性和非破坏性的分析方法，具有广泛的应用前景。
随着科学技术的不断进步，荧光分析法在各个领域中的应用将会更加广泛，为人类的生活和健康提供更多的保障。
荧光分析法
2.3ECl (2.3ECl) 2 (2.3ECl) 3 1 1! 2! 3!
2.3ECl (2.3ECl) 2 (2.3ECl)3 F K I 0{1 [1 ]} 1! 2! 3! (2.3ECl) 2 (2.3ECl) 3 K I 0 [2.3ECl ] 2! 3!
影响荧光强度的主要因素
浓度：稀溶液，F∝c OH 酸度：
pH～1,有荧光
(εbc≤0.05)
O-
pH～13,无荧光
OH 无荧光
O有荧光
温度：t 低，φ增加。
溶剂：溶剂极性增大，荧光波长长移，荧光强度 增强。 温度：升高温度，增加非辐射跃迁的概率，荧光 效率降低。 表面活性剂：保护激发单重态的荧光物质，减少 非辐射跃迁的概率，提高荧光效率。
荧光和磷光分析基本原理
1 荧光和磷光的产生
激发态分子返回基态的途径
振动弛豫(vibrational relexation) 内部能量转换(internal conversion)
荧光(fluorescence)发射
外部能量转换(external conversion)
体系间跨越(intersystem crossing)
吸收光谱、荧光光谱和磷光光谱
磷＞ 荧＞ 激
3 荧光效率
φ —荧光物质的荧光效率(量子产率)：
发射荧光的量子数 吸收激发光的量子数
荧光效率越高，辐射跃迁概率就越大，物质 发射的荧光也就越强。通常在0.1—1之间。
荧光效率(fluorescence efficiency) 荧光量子产率(fluorescence quantum yield)
荧光分析法基本概念
荧光分析法基本概念荧光分析法是一种基于物质发射和吸收荧光现象的分析技术。
荧光是指物质吸收电磁辐射后，经激发而发出的光辐射。
荧光分析法利用物质在激发射线的激发下产生的荧光进行定性和定量分析。
它具有高灵敏度、高选择性和高准确性等优点，广泛应用于化学、生物、医学、环境等领域。
荧光原理：荧光原理是指物质在吸收电磁波能量后，部分或全部转化为光能并发出荧光。
荧光的激发和发射有两种机制：分子吸收电磁辐射后跃迁到激发态，然后再从激发态返回基态释放能量发光；分子之间发生能量传递，从激发的分子接收能量并转化为荧光发射。
荧光分析原理：荧光分析技术基于物质的荧光性质。
荧光分析法通过测量物质在特定激发光激发下产生的荧光强度或荧光寿命，来获取物质的信息。
荧光分析法包括荧光光谱分析和荧光寿命分析。
荧光光谱分析：荧光光谱分析是指根据物质在激发下发射的荧光光谱特性来进行定性和定量分析。
荧光光谱是物质荧光发射的光波长与相应的荧光强度之间的关系。
通常，物质的荧光光谱有较为特征的波长范围和特定的峰。
荧光寿命分析：荧光寿命是指物质从激发态到基态的转变所需的平均时间，也称为物质的荧光衰减曲线。
荧光寿命分析利用物质的荧光寿命来进行定性和定量分析，可以通过测量荧光寿命来确定物质的存在和浓度等信息。
常见的荧光分析方法有荧光光谱仪、荧光显微镜、荧光染料、荧光标记等。
荧光光谱仪是荧光分析的重要工具，可以测量物质的荧光光谱，并通过荧光光谱来判断物质的性质和含量。
荧光显微镜是利用物质的荧光特性来观察样品的工具。
荧光染料是一种通过吸收和发射荧光的物质，常用于生物分子的标记和显色。
荧光标记是一种将荧光染料或荧光物质与分析物相结合，通过测量标记物的荧光特性来进行定性和定量分析。
荧光分析法在化学、生物、医学和环境等领域有广泛应用。
在化学分析中，荧光分析法可以用于分析确定荧光染料的结构、测定荧光染料的含量和纯度等。
在生物和医学领域，荧光分析法可以用于检测和定量分析蛋白质、核酸、细胞和微生物等生物分子和生物体。
荧光分析法
能级 2 荧光光谱的形状与激发波长无关
分子的电子吸收光谱可能含有几个吸收带，但其荧光光谱却只有一个发射带 荧光发射通常发生于第一电子激发态的最低振动能级，而与激发至哪一个电子激发态无关，所以荧光光谱的形状通 常与激发波长无关 3 荧光光谱与激发光谱的镜像关系
三、分子结构与荧光的关系
物质的分子结构与荧光的发生及荧光强度密切相关
（一）荧光寿命与荧光效率
荧光寿命和荧光效率是荧光物质的重要发光参数
荧光寿命：分子的荧光强度降低到激发光量子产率）：指激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数之比，常用ψf
来表示
发射荧光的光子数
射于检测器上，通过发射单色器扫描以检测各种波长下相应的荧光强度，然后记录荧光强度（F）对发射 波长（λex）的关系曲线，所得到的图谱称为~ 荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度 激发光谱和荧光光谱可用来鉴别荧光物质，并作为进行荧光测定时选择适当波长的依据 溶液荧光光谱通常具有如下特征： 1 斯托克斯位移 斯托克斯位移：在溶液荧光光谱中，所观察到的荧光波长总是大于激发光波长 斯托克斯位移说明了在激发与发射之间存在着一定的能量损失 产生斯托克斯位移的主要原因：激发态分子通过内转化和振动弛豫过程而迅速到达第一激发单线态 S1*的最低振动
荧光分析法
第一节 概述
光致发光：有些物质收到光的照射时，除吸收某种波长的光之外，还会发射出波长相同或比吸收波长更长的光，这种 现象称为~
荧光分析法检测原理及应用举例
荧光分析法检测原理及应用举例荧光分析法是一种常用的分析方法，根据样品在受到激发光后所发射出的荧光信号来进行分析。
荧光分析法具有灵敏度高、选择性好、分析快速等优点，适用于各种领域的分析和检测。
本文将详细介绍荧光分析法的检测原理，并给出几个应用举例。
荧光分析法的原理主要包括荧光激发和荧光发射两个过程。
在荧光激发过程中，样品受到吸收光束的照射后，其中的一些分子受到激发，处于高激发能级。
在随后的荧光发射过程中，这些激发分子会从高激发能级跃迁到低激发能级，释放出能量的同时发出特定波长的荧光光谱。
通过测量样品发出的荧光光谱，可以确定样品的成分以及其含量。
以下是几个荧光分析法的应用举例：1.荧光酶标技术：荧光酶标技术是生物荧光分析法中的一种重要应用。
通过将荧光标记在特定的抗体、蛋白质或核酸上，可以实现对患者样品中特定生物分子的检测。
例如，在临床诊断领域中，可以利用荧光酶标技术检测病原体的存在，并通过荧光信号的强弱来确定病菌的数量。
2.荧光染料的分析：荧光染料广泛应用于材料科学、生命科学等领域中的分析和检测。
例如，在环境监测中，可以使用荧光染料来检测水体或土壤中的有害物质，如重金属离子、有机污染物等。
荧光染料在分析过程中的发光特性可以提供非常灵敏和选择性的检测结果。
3.荧光显微镜技术：荧光显微镜技术是生命科学研究中常用的一种技术手段。
通过给样品标记荧光探针，可以在显微镜下观察样品的荧光信号来研究细胞结构、蛋白质相互作用等生物过程。
荧光显微镜技术还可以用于检测细菌感染、癌细胞等疾病的诊断和研究。
4.荧光透射谱分析：荧光透射谱分析是一种常用的荧光分析技术，可以用于分析各种化合物的组成和浓度。
例如，在食品安全领域，可以通过荧光透射谱分析来检测食品中的有害添加物，如亚硝酸盐、农药残留等。
通过测量样品在特定波长下的荧光强度，可以快速、准确地确定样品中有害物质的含量。
除了以上几个应用举例外，荧光分析法还可以用于环境监测、药物研发、生物学研究等领域。
荧光分析法
荧光 分子光谱 发射光谱 10-8~10-10g/ml
高
可见紫外 分子光谱 吸收光谱 10-5~10-7g/ml
一般
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11.2 根本原理
11.2.1 分子荧光光谱的产生 11.2.2 激发光谱与发射光谱 11.2.3 分子构造与荧光的关系 11.2.4 影响荧光强度的外部因素
11.2.1 分子荧光光谱的产生
荧光强度F，以F-λex作图得荧光物质的激发光谱。 发射光谱：〔荧光光谱〕固定激发光波长λex，依次改变发射
波长λem，测荧光强度F，以F-λem作图得荧光光谱。
➢激发光谱与荧光光谱上的λmax是定性定量的根据
1. 荧光光谱的特点〔重点〕
〔1〕斯托克斯位移：荧光发射波长总是大于激发波长。 原因：无辐射跃迁能量损失，包括振动弛豫和内部能量转换
续前
〔3〕荧光光电计与荧光分光光度计的比较
激发光源 激发单色器 发射单色器
检测器
样品池
光电荧光计 荧光分光光度计
汞灯
氙灯
第一滤光片
光栅
第二滤光片
光栅
光电倍增管
石英、玻璃池（低荧光的玻璃）
返回
小结： 掌握
根本概念：荧光、振动弛豫、内部能量转换、 外部能量转换、体系间跨越及磷光；激发光谱 与荧光光谱
发射波长
激发波长
激发光谱(excitation spectrum)： F~ ex 荧光光谱(fluorescence spectrum)： F~ em
激发光〔谱二：〕〔与激吸发收光光谱谱类与似荧〕表光示光不谱同激发波长的辐射引起
物质发射某一波长荧光所得的光谱。 方法：固定发射光波长λem，依次改变激发波长λex，测
特点：发生在非常靠近的两个电子能级间，他们的振动能级有 重叠；时间约10-1～10-13秒。
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根据洪特规则，平行自旋比成对自旋稳定，三重态能级 比相应单重态能级低。
大多数有机分子的基态处于单重态。
1.3 激发态→基态的能量传递途径
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁（发光）和无辐射跃迁等方式失去能量。
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 延迟荧光 磷光
FS F0 CS FX F0 CX
多组分测定：在一定条件下可联立方程求解。
3. 光分析法的应用
3.1 荧光分析的类型：
直接荧光测定 化学引导荧光测定
氧化还原: 吗啡在碱性条件下被氧化荧光更强的为
CH3
双（伪）吗啡（350/440nm）。
N
H3C
N
O
K3Fe ( CN )6 HO
系间跨越 内转移 外转移 振动弛预
激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大， 发光强度相对大。 荧光：10-7~10-9 s，第一激发单重态的最低振动能级→基态。 磷光：10-4~10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态。
内转换 S2
振动弛豫
内转换
系间跨越
S1
能
T1 T2
量
吸 收
发
射
外转换
4.6 散射光
瑞利散射（Reyleigh scattering light） 拉曼散射（Raman scattering light）
选择适当的激发波长避免散射光的影响，尤 其是拉曼光的干扰。
例如：在0.1 mol/L硫酸溶液中硫酸奎宁的荧光测定
常用溶剂在不同激发波长下的拉曼光谱
溶剂
激发光（nm） 248 313 365 405 436
水
271 350 416 469 511
乙醇
267 344 409 459 500
环己烷
267
344
408
458
499
四氯化碳 －
320 375 418 450
氯仿
－
346 410 461 502
4.7 化学发光
通过化学反应生成发光物质，如：
第二节 荧光分光光度计
1. 仪器及结构 2. 荧光分析方法 3. 荧光分析法的应用
基态（S0）→激发态（S1、S2、激发态振动能级）：吸收
特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态→基态：多种途径和方式；速度最快、激发态寿命
最短的途径占优势。
第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ； 第一、第二、…电子激发三重态 T1 、 T2 … 。
1.2 电子激发态的多重度
电子激发态的多重度：M=2S+1
OH
OH
HO
O OH
O
OH
吗啡
N
双（伪）吗啡
CH3
维生素B1在碱性条件下被K3Fe（CN）6氧化为硫色素
N H3C
N
NH2
S
N C H2
维生素B1
OH
[O]
OH
CH3
H3C
N
N
S
N
N
硫色素
OH CH3
水解反应
氨苄青霉素在酸性条件下水解为2,5-二酮哌嗪
O
CH
C NH
NH2 O
S
N
CH3 CH3 COOH
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
2.3 激发光谱与发射光谱的关系
a. Stokes位移
激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比
激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。
b. 发射光谱的形状与激发波长无关
1. 光源： 150W 氙灯 2. 波长范围： 200 nm-900nm 3. 灵敏度：S/N>500（峰对峰） 4. 扫描速度：最大5000 nm/min 5. 波长精确度：±2 nm 6. 波长重复性：±2 nm 7. 狭缝宽度：1，2，5，10，20 nm
美国VARIAN Fluoscence荧光分光光度计（Cary Eclipse）
H+ H2O
O
NH HN
R
O
缩合反应：色胺与甲醛缩合生成tetrahydronorharman，氧 化后生成发强荧光的norharman（365/440 nm）。
CH2CH2NH2
HCHO
N H
N N H
H2O
NH N H
配位反应：四环素类药物与Ca2＋及巴比妥盐生成荧光配合物，
萃取后测定。
光化学反应：氯氮卓在甘氨酸－盐酸缓冲溶液中加热水解成
同步扫描技术可简化光谱，谱带 变窄，可减少光谱重叠，提高分辨 率（如图）。
合适的l可减少光谱重叠；酪氨 酸和色氨酸的荧光激发光谱相似， 发射光谱严重重叠，但l<15nm的 同步光谱只显示酪氨酸特征光谱； l>60nm时，只显示色氨酸的特征 光谱，实现分别测定。
可获得三维光谱图的仪器： 可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧（磷）光光谱图
荧
光
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l3
l1
l 2 l 2
非辐射能量传递过程：
振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级 至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10 -12 s。 内转换：同多重度电子能级中等能级间的无辐射能级交换。
通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激 发单重态的最低振动能级。 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转 移能量的非辐射跃迁。
日本岛津荧光分光光度计RF-5301PC
1. 测定范围：220 ~ 750 nm及白色光 2. 带宽：1.5，3，5，10，20 nm 3. 灵敏度：S/N比150以上（带宽5 nm、水拉曼峰时） 4. 测定方式：荧光、激励、同期光谱测定、定量测定、时间过程测定
韩国FluoroMate FS-2荧光分光光度计
1. 20000 h闪烁式氙灯，只在 测量时闪烁，可开盖测量
2. S/N>750：1RMS，350nm 激发发射和激发狭缝为 10nm平均采样时间为1秒
3. 谱带宽度：1.5，2.5，5， 10，20nm
4. 扫描速度达24000 nm/min
1. 仪器结构流程
测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。
长；
l
’ 2
>
l
2
>
l
1
。
磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（
T1 → S0跃迁）。 电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 → T1禁阻跃迁）
S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1 发光速度很慢： 10-4～10 s 。
光照停止后，可持续一段时间。
2. 激发光谱与荧光（磷光）光谱
磷光检测：
荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有 荧光发射的同时测量磷光。
测量方法： （1）通常借助于荧光和磷 光寿命的差别，采用磷光 镜的装置将荧光隔开。 （2）采用脉冲光源和可控 检测及时间分辨技术。
室温测量时，不需要杜 瓦瓶。
2. 荧光分析方法
2.1 特点
（1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级，为什么？ 检测下限：0.1～0.1 g/cm-3 相对灵敏度：0.05 mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。
内酰胺衍生物，经乙醚萃取后在碱性中日光照射，光催化重
荧光（磷光）：光致发光，照射光波长如何选择？
2.1 荧光（磷光）的激发光谱曲线
固定测量波长（以选择最大发射波长），化合物发射的 荧光（磷光）强度与照射光波长的关系曲线（图中曲线I）。
激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光 强度最大，作为最大激发波长。
2.2 荧光光谱（或磷光光谱）
固定激发光波长（选择 最大激发波长），化合物 发射的荧光强度（或磷光 强度）与发射光波长关系 曲线（如图所示中的曲线II 或 III）。
（4）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强，荧光波长 长移。
4. 影响荧光强度的因素
影响荧光强度的外部因素 4.1 溶剂的影响
除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形 成以及溶剂的粘度都将使化合物的荧光发生变化。
4.2 温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几 率增加。
（2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱。
（3）试样量少 缺点：应用范围小。
2.2 定量依据与方法
（1）定量依据
荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率 ： If = Ia
由朗-比耳定律： Ia = I0 I = I0 （1 10 –ECl ） If = I0（1 10-ECl ） = I0（1 e -2.3ECl ）（可展开
电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量（如能
级图l2 ，l1），产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态
的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光（如
l
’ 2
）。
c. 镜像规则
通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一
样）成镜像对称关系。
镜像规则的解释：
基态上的各振动能级分布 与第一激发态上的各振动能级 分布类似。
4.3 溶液pH
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制。
4.4 内滤光作用和自吸现象
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧 光，如色胺酸中的重铬酸钾。 自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱 的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。