荧光分析法
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S为电子自旋量子数的矢量代数和（0或1）。
根据洪特规则，平行自旋比成对自旋稳定，三重态能级 比相应单重态能级低。
大多数有机分子的基态处于单重态。
1.3 激发态→基态的能量传递途径
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁（发光）和无辐射跃迁等方式失去能量。
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 延迟荧光 磷光
系间跨越 内转移 外转移 振动弛预
激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大， 发光强度相对大。 荧光：10-7~10-9 s，第一激发单重态的最低振动能级→基态。 磷光：10-4~10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态。
内转换 S2
振动弛豫
内转换
系间跨越
S1
能
T1 T2
量
吸 收
发
射
外转换
3.2 化合物的结构与荧光的关系
（1）跃迁类型：*→的荧光效率高，系间跨越过程的速率 常数小，有利于荧光的产生。 （2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移
（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作 用，故具有很强的荧光。如：荧光素和酚酞有相似结构，荧 光素有很强的荧光，酚酞却没有。
OH
OH
HO
O OH
O
OH
吗啡
N
双（伪）吗啡
CH3
维生素B1在碱性条件下被K3Fe（CN）6氧化为硫色素
N H3C
N
NH2
S
N C H2
维生素B1
OH
[O]
OH
CH3
H3C
N
N
S
N
N
硫色素
OH CH3
水解反应
氨苄青霉素在酸性条件下水解为2,5-二酮哌嗪
O
CH
C NH
NH2 O
S
N
CH3 CH3 COOH
FS F0 CS FX F0 CX
多组分测定：在一定条件下可联立方程求解。
3. 荧光分析法的应用
3.1 荧光分析的类型：
直接荧光测定 化学引导荧光测定
氧化还原: 吗啡在碱性条件下被氧化荧光更强的为
CH3
双（伪）吗啡（350/440nm）。
N
H3C
N
O
K3Fe ( CN )6 HO
长；
l
’ 2
>
l
2
>
l
1
。
磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（
T1 → S0跃迁）。 电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 → T1禁阻跃迁）
S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1 发光速度很慢： 10-4～10 s 。
光照停止后，可持续一段时间。
2. 激发光谱与荧光（磷光）光谱
（4）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强，荧光波长 长移。
4. 影响荧光强度的因素
影响荧光强度的外部因素 4.1 溶剂的影响
除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形 成以及溶剂的粘度都将使化合物的荧光发生变化。
4.2 温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几 率增加。
4.6 散射光
瑞利散射（Reyleigh scattering light） 拉曼散射（Raman scattering light）
选择适当的激发波长避免散射光的影响，尤 其是拉曼光的干扰。
例如：在0.1 mol/L硫酸溶液中硫酸奎宁的荧光测定
常用溶剂在不同激发波长下的拉曼光谱
溶剂
激发光（nm） 248 313 365 405 436
水
271 350 416 469 511
乙醇
267 344 409 459 500
环己烷
267
344
408
458
499
四氯化碳 －
320 375 418 450
氯仿
－
346 410 461 502
4.7 化学发光
通过化学反应生成发光物质，如：
第二节 荧光分光光度计
1. 仪器及结构 2. 荧光分析方法 3. 荧光分析法的应用
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
2.3 激发光谱与发射光谱的关系
a. Stokes位移
激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比
激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。
b. 发射光谱的形状与激发波长无关
美国 PerkinElmer 荧光/磷光/发光分光光度计
Hitachi（日立）F-2500荧光分光光度计
1. 可做化学/生物发光测量 2. 波长范围：220nm ~ 730nm 3. 光谱带宽：2.5、5、10、20nm 4. 灵敏度高，S/N≥800：1 （RMS） 5. 波长扫描速度：15 ~ 3000nm/min 6. 使用10mm样品池，所需试验样品量小于0.6mL
外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。 系间跨越：不同多重态，有重叠的转动能级间的非辐射跃迁
改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。
辐射能量传递过程：
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（
多为 S1→ S0跃迁），发射波长为 l ’2的荧光； 10-7～10 -9 s 。
由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长
4.3 溶液pH
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制。
4.4 内滤光作用和自吸现象
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧 光，如色胺酸中的重铬酸钾。 自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱 的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
4.5 溶液荧光的猝灭
碰撞猝灭 生成不发光的化合物 氧的氧化或氧的顺磁性促使体系间的跨越引起荧光熄灭 自熄灭现象
磷光检测：
荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有 荧光发射的同时测量磷光。
测量方法： （1）通常借助于荧光和磷 光寿命的差别，采用磷光 镜的装置将荧光隔开。 （2）采用脉冲光源和可控 检测及时间分辨技术。
室温测量时，不需要杜 瓦瓶。
2. 荧光分析方法
2.1 特点
（1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级，为什么？ 检测下限：0.1～0.1 g/cm-3 相对灵敏度：0.05 mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。
1. 光源： 150W 氙灯 2. 波长范围： 200 nm-900nm 3. 灵敏度：S/N>500（峰对峰） 4. 扫描速度：最大5000 nm/min 5. 波长精确度：±2 nm 6. 波长重复性：±2 nm 7. 狭缝宽度：1，2，5，10，20 nm
美国VARIAN Fluoscence荧光分光光度计（Cary Eclipse）
荧
光
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l3
l1
l 2 l 2
非辐射能量传递过程：
振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级 至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10 -12 s。 内转换：同多重度电子能级中等能级间的无辐射能级交换。
通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激 发单重态的最低振动能级。 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转 移能量的非辐射跃迁。
同步扫描技术可简化光谱，谱带 变窄，可减少光谱重叠，提高分辨 率（如图）。
合适的l可减少光谱重叠；酪氨 酸和色氨酸的荧光激发光谱相似， 发射光谱严重重叠，但l<15nm的 同步光谱只显示酪氨酸特征光谱； l>60nm时，只显示色氨酸的特征 光谱，实现分别测定。
可获得三维光谱图的仪器： 可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧（磷）光光谱图
内酰胺衍生物，经乙醚萃取后在碱性中日光照射，光催化重
基态（S0）→激发态（S1、S2、激发态振动能级）：吸收
特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态→基态：多种途径和方式；速度最快、激发态寿命
最短的途径占优势。
第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ； 第一、第二、…电子激发三重态 T1 、 T2 … 。
1.2 电子激发态的多重度
电子激发态的多重度：M=2S+1
日本岛津荧光分光光度计RF-5301PC
1. 测定范围：220 ~ 750 nm及白色光 2. 带宽：1.5，3，5，10，20 nm 3. 灵敏度：S/N比150以上（带宽5 nm、水拉曼峰时） 4. 测定方式：荧光、激励、同期光谱测定、定量测定、时间过程测定
韩国FluoroMate FS-2荧光分光光度计
1. 20000 h闪烁式氙灯，只在 测量时闪烁，可开盖测量
2. S/N>750：1RMS，350nm 激发发射和激发狭缝为 10nm平均采样时间为1秒
3. 谱带宽度：1.5，2.5，5， 10，20nm
4. 扫描速度达24000 nm/min
1. 仪器结构流程
测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。
电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量（如能
级图l2 ，l1），产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态
的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光（如
l
’ 2
）。
c. 镜像规则
通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一
样）成镜像对称关系。
镜像规则的解释：
基态上的各振动能级分布 与第一激发态上的各振动能级 分布类似。
（2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱。
（3）试样量少 缺点：应用范围小。
2.2 定量依据与方法
（1）定量依据
荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率 ： If = Ia
由朗-比耳定律： Ia = I0 I = I0 （1 10 –ECl ） If = I0（1 10-ECl ） = I0（1 e -2.3ECl ）（可展开
荧光（磷光）：光致发光，照射光波长如何选择？
2.1 荧光（磷光）的激发光谱曲线
固定测量波长（以选择最大发射波长），化合物发射的 荧光（磷光）强度与照射光波长的关系曲线（图中曲线I）。
激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光 强度最大，作为最大激发波长。
2.2 荧光光谱（或磷光光谱）
固定激发光波长（选择 最大激发波长），化合物 发射的荧光强度（或磷光 强度）与发射光波长关系 曲线（如图所示中的曲线II 或 III）。
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200 250 300 350 400 450 500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
3. 荧光的产生与分子结构的关系
3.1 分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有合适的结构；
（2）具有一定的荧光效率f （荧光量子产率）。
发射荧光的光子数
f 吸收激发光的光子数
荧光效率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外 转换过程速度快，不出现荧光发射。
基本流程如图： 单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光波长的第二单色器。 光源：氙灯、高压汞灯和 染料激光器（可见与紫外 区）。 检测器：光电倍增管。
仪 器 光 路 图
同步扫描技术： 根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的
关系，同步扫描可分为固定波长差（l）和固定能量差及 可变波长三种。
H+ H2O
O
NH HN
R
O
缩合反应：色胺与甲醛缩合生成tetrahydronorharman，氧 化后生成发强荧光的norharman（365/440 nm）。
CH2CH2NH2
HCHO
N H
N N H
H2O
NH N H
配位反应：四环素类药物与Ca2＋及巴比妥盐生成荧光配合物，
萃取后测定。
光化学反应：氯氮卓在甘氨酸－盐酸缓冲溶液中加热水解成
为傅立叶级数），浓度很低时（ECl ≤0.05），可近似处理为
：
If = 2.3 I0 ECl = KC
（2）定量方法
标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲
线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲 线上求出浓度。 比较法：
在线性范围内，测定标样和试样的荧ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ强度进行比较。
荧光分析法的缺点：应用范围不够广泛。
第一节 荧光分析的基本原理
1. 分子荧光与磷光的产生过程 2. 激发光谱与发射光谱 3. 荧光的产生与分子结构的关系 4. 影响荧光强度的因素
1. 荧光与磷光的产生过程
由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理。
1.1 分子能级与跃迁
分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；
第十一章 荧光分析法
分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以 荧光强度进行定量的一种分析方法。
荧光分析法的特点： 与紫外－可见分光光度法比较，荧光分析法具有更 高的灵敏度； 选择性好，荧光分析法既能依据发射光谱，又能依 据吸收光谱来鉴定物质； 所需试样量少、操作方法简单； 能提供较多的分析参数、信息量大。
根据洪特规则，平行自旋比成对自旋稳定，三重态能级 比相应单重态能级低。
大多数有机分子的基态处于单重态。
1.3 激发态→基态的能量传递途径
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁（发光）和无辐射跃迁等方式失去能量。
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 延迟荧光 磷光
系间跨越 内转移 外转移 振动弛预
激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大， 发光强度相对大。 荧光：10-7~10-9 s，第一激发单重态的最低振动能级→基态。 磷光：10-4~10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态。
内转换 S2
振动弛豫
内转换
系间跨越
S1
能
T1 T2
量
吸 收
发
射
外转换
3.2 化合物的结构与荧光的关系
（1）跃迁类型：*→的荧光效率高，系间跨越过程的速率 常数小，有利于荧光的产生。 （2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移
（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作 用，故具有很强的荧光。如：荧光素和酚酞有相似结构，荧 光素有很强的荧光，酚酞却没有。
OH
OH
HO
O OH
O
OH
吗啡
N
双（伪）吗啡
CH3
维生素B1在碱性条件下被K3Fe（CN）6氧化为硫色素
N H3C
N
NH2
S
N C H2
维生素B1
OH
[O]
OH
CH3
H3C
N
N
S
N
N
硫色素
OH CH3
水解反应
氨苄青霉素在酸性条件下水解为2,5-二酮哌嗪
O
CH
C NH
NH2 O
S
N
CH3 CH3 COOH
FS F0 CS FX F0 CX
多组分测定：在一定条件下可联立方程求解。
3. 荧光分析法的应用
3.1 荧光分析的类型：
直接荧光测定 化学引导荧光测定
氧化还原: 吗啡在碱性条件下被氧化荧光更强的为
CH3
双（伪）吗啡（350/440nm）。
N
H3C
N
O
K3Fe ( CN )6 HO
长；
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>
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。
磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（
T1 → S0跃迁）。 电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 → T1禁阻跃迁）
S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1 发光速度很慢： 10-4～10 s 。
光照停止后，可持续一段时间。
2. 激发光谱与荧光（磷光）光谱
（4）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强，荧光波长 长移。
4. 影响荧光强度的因素
影响荧光强度的外部因素 4.1 溶剂的影响
除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形 成以及溶剂的粘度都将使化合物的荧光发生变化。
4.2 温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几 率增加。
4.6 散射光
瑞利散射（Reyleigh scattering light） 拉曼散射（Raman scattering light）
选择适当的激发波长避免散射光的影响，尤 其是拉曼光的干扰。
例如：在0.1 mol/L硫酸溶液中硫酸奎宁的荧光测定
常用溶剂在不同激发波长下的拉曼光谱
溶剂
激发光（nm） 248 313 365 405 436
水
271 350 416 469 511
乙醇
267 344 409 459 500
环己烷
267
344
408
458
499
四氯化碳 －
320 375 418 450
氯仿
－
346 410 461 502
4.7 化学发光
通过化学反应生成发光物质，如：
第二节 荧光分光光度计
1. 仪器及结构 2. 荧光分析方法 3. 荧光分析法的应用
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
2.3 激发光谱与发射光谱的关系
a. Stokes位移
激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比
激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。
b. 发射光谱的形状与激发波长无关
美国 PerkinElmer 荧光/磷光/发光分光光度计
Hitachi（日立）F-2500荧光分光光度计
1. 可做化学/生物发光测量 2. 波长范围：220nm ~ 730nm 3. 光谱带宽：2.5、5、10、20nm 4. 灵敏度高，S/N≥800：1 （RMS） 5. 波长扫描速度：15 ~ 3000nm/min 6. 使用10mm样品池，所需试验样品量小于0.6mL
外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。 系间跨越：不同多重态，有重叠的转动能级间的非辐射跃迁
改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。
辐射能量传递过程：
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（
多为 S1→ S0跃迁），发射波长为 l ’2的荧光； 10-7～10 -9 s 。
由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长
4.3 溶液pH
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制。
4.4 内滤光作用和自吸现象
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧 光，如色胺酸中的重铬酸钾。 自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱 的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
4.5 溶液荧光的猝灭
碰撞猝灭 生成不发光的化合物 氧的氧化或氧的顺磁性促使体系间的跨越引起荧光熄灭 自熄灭现象
磷光检测：
荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有 荧光发射的同时测量磷光。
测量方法： （1）通常借助于荧光和磷 光寿命的差别，采用磷光 镜的装置将荧光隔开。 （2）采用脉冲光源和可控 检测及时间分辨技术。
室温测量时，不需要杜 瓦瓶。
2. 荧光分析方法
2.1 特点
（1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级，为什么？ 检测下限：0.1～0.1 g/cm-3 相对灵敏度：0.05 mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。
1. 光源： 150W 氙灯 2. 波长范围： 200 nm-900nm 3. 灵敏度：S/N>500（峰对峰） 4. 扫描速度：最大5000 nm/min 5. 波长精确度：±2 nm 6. 波长重复性：±2 nm 7. 狭缝宽度：1，2，5，10，20 nm
美国VARIAN Fluoscence荧光分光光度计（Cary Eclipse）
荧
光
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l3
l1
l 2 l 2
非辐射能量传递过程：
振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级 至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10 -12 s。 内转换：同多重度电子能级中等能级间的无辐射能级交换。
通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激 发单重态的最低振动能级。 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转 移能量的非辐射跃迁。
同步扫描技术可简化光谱，谱带 变窄，可减少光谱重叠，提高分辨 率（如图）。
合适的l可减少光谱重叠；酪氨 酸和色氨酸的荧光激发光谱相似， 发射光谱严重重叠，但l<15nm的 同步光谱只显示酪氨酸特征光谱； l>60nm时，只显示色氨酸的特征 光谱，实现分别测定。
可获得三维光谱图的仪器： 可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧（磷）光光谱图
内酰胺衍生物，经乙醚萃取后在碱性中日光照射，光催化重
基态（S0）→激发态（S1、S2、激发态振动能级）：吸收
特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态→基态：多种途径和方式；速度最快、激发态寿命
最短的途径占优势。
第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ； 第一、第二、…电子激发三重态 T1 、 T2 … 。
1.2 电子激发态的多重度
电子激发态的多重度：M=2S+1
日本岛津荧光分光光度计RF-5301PC
1. 测定范围：220 ~ 750 nm及白色光 2. 带宽：1.5，3，5，10，20 nm 3. 灵敏度：S/N比150以上（带宽5 nm、水拉曼峰时） 4. 测定方式：荧光、激励、同期光谱测定、定量测定、时间过程测定
韩国FluoroMate FS-2荧光分光光度计
1. 20000 h闪烁式氙灯，只在 测量时闪烁，可开盖测量
2. S/N>750：1RMS，350nm 激发发射和激发狭缝为 10nm平均采样时间为1秒
3. 谱带宽度：1.5，2.5，5， 10，20nm
4. 扫描速度达24000 nm/min
1. 仪器结构流程
测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。
电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量（如能
级图l2 ，l1），产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态
的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光（如
l
’ 2
）。
c. 镜像规则
通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一
样）成镜像对称关系。
镜像规则的解释：
基态上的各振动能级分布 与第一激发态上的各振动能级 分布类似。
（2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱。
（3）试样量少 缺点：应用范围小。
2.2 定量依据与方法
（1）定量依据
荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率 ： If = Ia
由朗-比耳定律： Ia = I0 I = I0 （1 10 –ECl ） If = I0（1 10-ECl ） = I0（1 e -2.3ECl ）（可展开
荧光（磷光）：光致发光，照射光波长如何选择？
2.1 荧光（磷光）的激发光谱曲线
固定测量波长（以选择最大发射波长），化合物发射的 荧光（磷光）强度与照射光波长的关系曲线（图中曲线I）。
激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光 强度最大，作为最大激发波长。
2.2 荧光光谱（或磷光光谱）
固定激发光波长（选择 最大激发波长），化合物 发射的荧光强度（或磷光 强度）与发射光波长关系 曲线（如图所示中的曲线II 或 III）。
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200 250 300 350 400 450 500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
3. 荧光的产生与分子结构的关系
3.1 分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有合适的结构；
（2）具有一定的荧光效率f （荧光量子产率）。
发射荧光的光子数
f 吸收激发光的光子数
荧光效率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外 转换过程速度快，不出现荧光发射。
基本流程如图： 单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光波长的第二单色器。 光源：氙灯、高压汞灯和 染料激光器（可见与紫外 区）。 检测器：光电倍增管。
仪 器 光 路 图
同步扫描技术： 根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的
关系，同步扫描可分为固定波长差（l）和固定能量差及 可变波长三种。
H+ H2O
O
NH HN
R
O
缩合反应：色胺与甲醛缩合生成tetrahydronorharman，氧 化后生成发强荧光的norharman（365/440 nm）。
CH2CH2NH2
HCHO
N H
N N H
H2O
NH N H
配位反应：四环素类药物与Ca2＋及巴比妥盐生成荧光配合物，
萃取后测定。
光化学反应：氯氮卓在甘氨酸－盐酸缓冲溶液中加热水解成
为傅立叶级数），浓度很低时（ECl ≤0.05），可近似处理为
：
If = 2.3 I0 ECl = KC
（2）定量方法
标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲
线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲 线上求出浓度。 比较法：
在线性范围内，测定标样和试样的荧ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ强度进行比较。
荧光分析法的缺点：应用范围不够广泛。
第一节 荧光分析的基本原理
1. 分子荧光与磷光的产生过程 2. 激发光谱与发射光谱 3. 荧光的产生与分子结构的关系 4. 影响荧光强度的因素
1. 荧光与磷光的产生过程
由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理。
1.1 分子能级与跃迁
分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；
第十一章 荧光分析法
分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以 荧光强度进行定量的一种分析方法。
荧光分析法的特点： 与紫外－可见分光光度法比较，荧光分析法具有更 高的灵敏度； 选择性好，荧光分析法既能依据发射光谱，又能依 据吸收光谱来鉴定物质； 所需试样量少、操作方法简单； 能提供较多的分析参数、信息量大。