高效液相色谱原理一讲
HPLC色谱仪原理和使用
高效液相色谱仪原理和使用——大黄中大黄素的测定一、目的要求1、掌握HPLC色谱仪结构、工作原理和外标法应用。
2、熟悉HPLC色谱仪的操作3、了解HPLC色谱法在中药分析中的应用。
二、基本原理仪器结构组成：贮液瓶——泵——进样器——色谱柱——检测器——数据处理系统样品测定原理大黄中含有大黄素、大黄酚等成分，本实验采用HPLC法，对大黄中所含大黄素进行测定，并用外标一点法计算含量。
三、仪器与试药1、HPLC液相色谱仪（Dionex P680）、微量进样器。
2、甲醇（色谱纯、分析纯）、水等。
3、大黄素对照品（中国药品生物制品检定所）。
4、大黄（市售品）。
四、操作步骤1、讲述仪器结构：贮液瓶、泵、双向阀、样品器、色谱柱、紫外检测器、工作站2、讲述仪器操作（详见附录）：（1）打开泵、检测器、电脑、工作站（2）排气（3）设置流速，打开光源（4）查看基线（5）基线平稳后，开始进样，进样操作（6）分析样品（7）查看数据（t、A、R、n、T）（8）利用外标一点法计算样品溶液浓度的计算（9）洗柱（10）关机3、样品分析色谱条件：色谱柱：ODS柱（十八烷基硅烷键合相硅胶，Dikma Technologies Diamonsil TM C18，5μm，250×4.6mm）、甲醇-0.1%磷酸水溶液化气（85：15）、检测波长254nm、流速1ml/min对照品溶液配制：取大黄素对照品，制成16μg/ml。
（已备）样品溶液制备：取大黄样品0.2g，用甲醇超声提取后，定容至10ml。
(已备)分别取上述两种溶液，进样10μl，即得附：Dionex P680HPLC色谱仪的操作步骤1）开机：依次打开泵、检测器的电源开关，待仪器自检完毕，打开电脑，进入windows XP 界面。
2）进入操作系统：双击电脑桌面“变色龙”图标进入操作界面，file—open，在主目录“USER- local”下选择“HPLC.pan”控制面板（文件类型：control panel）。
高效液相色谱法指导培训讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
离子抑制色谱（ion suppression chromatography）——调节流动相的pH值， 抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解 度，改善峰形，以达到分离有机弱酸和弱碱的 目的。
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
高效液相色谱法指导培训 讲义
胶束色谱(micellar chromatography)
• 表面活性剂在水中超过某一浓度（临界浓度） 时，多余的表面活性剂不再溶解，聚集而成 胶束（胶粒）。
• 以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶束 色谱法。它的流动相为胶束多相分散体系， 不是真溶液；流动相中不含有机溶剂。
过滤——用滤膜 脱气——采用
过滤或垂熔漏斗 超声或过滤的方
过滤
法
冲洗
使用含酸、碱、缓冲液的流动相后， 必须用不含盐的有机溶剂-水冲洗！
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
▪进样阀
高效液相色谱法指导培训 讲义
定量圈 1
正相色谱（normal phase）
流动相极性小于固定相极性的分配色谱 法称为正相分配色谱。常用的分析柱有:
氨基柱、氰基柱、硅胶柱。 常用流动相为极性小的有机溶剂。
反相色谱（reversed phase）
流动相极性大于固定相极性的分配色谱法 称为反相分配色谱法。常用的分析柱有： ODS( C18)， C8， C2。
高效液相色谱法在药品检验中的特点和价值分析
高效液相色谱法在药品检验中的特点和价值分析摘要：高效液相色谱法是一种广泛应用的检测方法，它使得总体检测更加灵敏、高效、检测效果明显，具有广泛的应用前景。
为推动药品生产的规范化，本文对高效液相色谱法的原理、特性、高效液相色谱法技术在药品检验中的应用进行了综述。
关键词：高效液相色谱；药品检验；特点；定价；目前，我国药品生产企业的质量管理受到了较大的制约。
随着现代医学的迅速发展，各种药物检测技术也随之产生。
药品检验是药品安全管理的重要环节，它涉及药品质量、成分、不良反应、理化、安全、缺陷等方面的检测。
目前，常用的方法有：毛细管电泳法、薄层扫描法、分光光度法、高效液相色谱法等。
其中，高效液相色谱法以可操作性强、适用范围广、灵敏度高、结果测定速度快等优势得到了快速发展和应用【1】。
本文主要介绍 HPLC技术在药品检验中的应用，以提高检测效率，减少误差。
高效液相色谱法属于色谱法中的一种，主要将液体作为流动相，将其泵入到装有固定相的色谱柱之中，通过对比色谱柱信息，检验出药品中的各种成分，并实现对各成分的化学分析，这一技术被广泛应用于药品检测中，极大地缩短检测时间。
1高效液相色谱法原理及特点与以往常规液相色谱法相似，但其在操作时引入高压输液泵，相较于常规液相色谱法来讲，能有效地提高检测的准确度和工作效率，有效提升药学检验水平。
此外，高效液相色谱法采用同一个色谱条件对药品中的多个成分进行分析，不易受外部因素影响，有效提高了分离效率，同时，该方法具有快速、高效、经济、成本低廉、适用范围宽、误差小等特点，能有效地提高测试精度，满足不同的测试要求，具有很好的推广价值【2】。
2高效液相色谱法在药品检验中的应用价值2.1药品中有效成分的测定药品成分是影响药品价格的主要因素，由于药品中的活性成分种类繁多，它们的药理作用机制也各不相同，因此在检测过程中要确定其有效成分，而常规的方法由于操作复杂、工作压力大，很容易产生误差。
高效液相检验法的应用与开展，能够通过信息技术手段对药品进行批量处理，提高药效，并通过对比色谱柱信息，正确测定出药品有效成分，减少了人工差错，提高了测定的准确性，为今后的检验工作提供了便利【3】。
HPLC原理和操作详细讲解
高效液相色谱我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比拟表：鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。
I．概论2一、液相色谱理论开展简况2二、HPLC的特点和优点3三、色谱法分类4四、色谱别离原理4II．根本概念和理论7一、根本概念和术语7二、塔板理论13三、速率理论〔又称随机模型理论〕15III．HPLC系统18一、输液泵19二、进样器23三、色谱柱24四、检测器29五、数据处理和计算机控制系统35六、恒温装置36IV．固定相和流动相36一、基质〔担体〕37二、化学键合固定相39三、流动相421．流动相的性质要求422．流动相的选择433．流动相的pH值444．流动相的脱气455．流动相的滤过466．流动相的贮存477．卤代有机溶剂应特别注意的问题478．HPLC用水47V．HPLC应用48一、样品测定48二、方法研究50附件：高效液相色谱法〔HPLC〕复核细那么50一、对起草单位的要求：50二、对复核单位的要求：51I．概论一、液相色谱理论开展简况色谱法的别离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用〔吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和〕的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特〔Tswett〕在1906年研究用碳酸钙别离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。
后来在此根底上开展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开场阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长〔常有几个小时〕。
高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的根底上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速开展起来的。
高效液相色谱法教学【全】精选全文
例: 流动相极性变化对组分k’的影响
②更换色谱柱（改变N）
措施： a.选择长柱子(N=L/H) b.填料颗粒尽量小 c.低流速(溶质传质阻力小，峰扩展小) d.低的溶剂粘度(提高柱效)
高效液相色谱法
High Performance Liquid
Chromatography （HPLC）
前言:
HPLC是70年代以后发展最 快的一个分析化学分支，现 已成为生化、医学、药物、 化学化工、食品卫生、环保 检测等领域最常用的分离分 析手段。
我国：
开始仅为少数研究实验室拥有， 现很多的生产、研究、质检部门都拥有。 广泛应用于： 质量控制、分析化验、制备分离。 讲课目的：入门 教材：《实用色谱法》（詹益兴 编著） 学习要求：记好笔记，
ⅰ大分子，扩散系数小 ⅱ小分子，扩散系数大
5. 影响分离的因素与提高柱效的途径
• 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，在高效液
相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/u较小，可忽略 不计，即 H = A + C u
• 降低传质阻力是提高 柱效主要途径。 •气相和液相Ｈ－ｕ区别
§１－４ 分离度 (Rs)
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
混合物最有效的分离、分析方法。 是一种分离技术。 混合物分离过程：试样中各组分在 固液两相间不断进行着的分配。 一相固定不动，称为固定相。 另一相是携带试样混合物流过固定 相的液体，称为流动相。
液相色谱仪
高效液相色谱仪流程图
(1) 存在着浓度差，产生纵向扩散;
(2) 扩散导致色谱峰变宽，H↑(Ｎ↓)，分离变差; (3) B/u与流速有关：流速↓→ 滞留时间↑→ 扩散↑
高效液相工作原理
高效液相工作原理
高效液相工作原理是基于物质的溶解和分配现象，利用固定相和流动相进行分离和分析的一种技术。
其工作原理可以分为以下几个步骤：
1. 固定相选择：将吸附剂或离子交换剂等固定在支撑材料上，形成高效液相色谱柱。
固定相的选择是根据待分离物质的性质来确定的，以提高分离效果。
2. 流动相选择：根据待分离物质的溶解性和分配系数等特性，选择适当的溶剂体系作为流动相。
流动相可以通过改变组成或添加缓冲剂等方式来实现对待分离物质的选择性调整。
3. 样品制备：待分析的样品需要经过适当的前处理，如样品的提取、净化、浓缩等，才能满足高效液相色谱的分离条件。
4. 进样：将预处理好的样品通过进样器引入高效液相色谱柱中。
进样量的控制对于保证分析结果的准确性和灵敏度非常重要。
5. 分离：样品在高效液相色谱柱内通过固定相的有效分离，不同成分根据其溶解度和分配系数在流动相中的速度差异，被分离成多个峰。
6. 检测和定量：通过检测器检测色谱柱出口的物质，常用的检测器包括紫外可见光谱检测器、荧光检测器、折光率检测器等。
根据检测峰的面积和峰高可以定量分析样品中的目标物质。
总的来说，高效液相工作原理是通过调节固定相、流动相和样品处理等参数，实现对样品中不同成分的高效分离与定量分析。
它具有分离效果好、分离速度快、适应范围广等优点，并广泛应用于化学、生物、环境等领域中的分析和检测工作中。
2.高效液相色谱仪和固定相、流动相
光电二极管阵列检测器
3. 差示折光检测器（differential refractive index detector） 除紫外检测器之外应用最多的检测器；
可连续检测参比池和样品池中溶液的折光 指数差值。差值与浓度呈正比；
特点：
通用型检测器 ; 灵敏度低（10-7g.mL-1），不能用于痕量分 析; 对温度敏感，要求使用温度恒定; 对流动相流量变化敏感，不能用于梯度洗脱。
六、液相色谱法流动相
1. 流动相特性 2. （1）流动相的种类、配比可显著改变组
分分离状况； 3. （2）亲水性固定液常采用疏水性流动相
， 称为正相液液色谱法; 4. （3）流动相的极性大于固定液的极性，
则称为反相液液色谱 。
组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。
2. 流动相类别 按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗
外梯度: 两台高压泵， 将两种不同极性的溶剂 按一定的比例送入梯度 混合室，混合后进入色 谱柱。
内梯度: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两 种或多种不同极性的溶 剂按一定的比例抽入高 压泵中混合。
讨论1
用ODS柱分析一有机弱酸混合物样品， 以某一比例甲醇-水为流动相时，样品容 量因子较小，若想使容量因子增加，较 好的办法是 A 增加流动相中甲醇的比例 B增加流动相中水的比例 C流动相中加入少量HAc D流动相中加入少量的氨水
高压泵按其性质可分为恒压泵、恒流泵两类
1）往复式柱塞泵： 恒流 泵； 易于更换溶剂，适用于梯 度洗脱但有脉冲波动，可 以加一阻尼器抑制脉冲。
2）气动放大泵： 恒压泵 液缸体积大，更换流动相 不方便，不便于梯度洗脱， 无脉冲、稳定流量的输出, 现多用于装柱。
液相色谱工作原理
液相色谱工作原理液相色谱（Liquid Chromatography, 简称LC）是一种分离和分析化合物的重要技术，广泛应用于化学、生物、药物和环境等领域。
其原理是利用化合物在流动相和固定相之间的分配行为，通过不同化合物在两相间的分配系数差异，实现化合物的分离和分析。
本文将从液相色谱的工作原理、基本构成和操作流程进行详细介绍。
1. 工作原理。
液相色谱的工作原理基于化合物在流动相和固定相之间的分配行为。
当样品溶液通过色谱柱时，化合物会在流动相和固定相之间不断分配，即在两相之间发生平衡。
根据化合物在两相之间的分配系数不同，它们将以不同的速率通过色谱柱，从而实现分离。
流动相的选择对于分离效果至关重要，常用的流动相包括水、甲醇、乙腈等。
而固定相则是填充在色谱柱中的吸附剂，常见的固定相包括疏水相、离子交换相、亲和相等。
通过调整流动相的组成和色谱柱的性质，可以实现对不同化合物的有效分离。
2. 基本构成。
液相色谱主要由流动相输送系统、进样器、色谱柱、检测器和数据处理系统组成。
流动相输送系统用于将流动相输送至色谱柱，通常包括泵和管道等。
进样器用于将样品引入色谱系统，常见的进样方式包括注射器和自动进样器。
色谱柱是液相色谱系统中最重要的部分，不同的色谱柱具有不同的分离机理和分离能力。
检测器用于监测色谱柱输出的化合物，常见的检测器包括紫外-可见光谱检测器、荧光检测器、质谱检测器等。
数据处理系统用于记录和处理检测器输出的信号，常见的数据处理系统包括计算机和数据采集系统。
3. 操作流程。
液相色谱的操作流程通常包括样品制备、流动相准备、色谱柱平衡、进样和分离、检测和数据处理等步骤。
首先，需要对待测样品进行适当的制备，包括溶解、过滤等操作。
接下来是流动相的准备，根据样品的性质和分离要求选择合适的流动相，并进行气泡排除和流速调节等操作。
然后进行色谱柱的平衡，以保证色谱柱内部的平衡状态。
接着是样品的进样和分离，将制备好的样品通过进样器引入色谱系统，经过色谱柱分离后，化合物被检测器检测并输出信号。
高效液相色谱分析HPLC
高效液相色谱
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第7讲
高效液相色谱
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§3-4 液相色谱法固定相
色谱柱是色谱法的心脏，固定相及装柱技术是关键。 一、液-液色谱法及离子对色谱法固定相 1.全多孔型担体：直径小于10µm（75/-4） 2.表面多孔型担体，目前不用。 3.化学键合固定相（P76及P69） a.成相：用化学的方法通过化学键把有机分子结合 到担体表面。常用18碳柱 b.特点76/-5：4点. 4.分离机制77/2：既不是全部吸附过程，亦不是典型 的液-液分配过程，而是双重机制兼而有之，只是 按键合量的多少而各有侧重.
第7讲
高效液相色谱
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离子对色谱分离过程示意图
第7讲
高效液相色谱
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五、离子色谱法 1.固定相:离子交换树脂 流动相:电解质溶液 检测器:电导检测器 主配件：抑制柱 2. 流程图：fig3-2 3.分离机制 （阴离子为例） a.双柱型：化学抑制型离子色谱法； b.单柱型：非抑制型，用低电导的洗脱液； 4.应用：从无机和有机阴离子到金属阳离子，从 有机阳离子到糖类、氨基酸等均可用该法分析.
高效液相色谱
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第三章
高效液相色谱分析（HPLC）
§3-1高效液相色谱的特点 一、定义：液相色谱法是指流动相为液体的色谱 技术。 二、特点 1.高压: 可达150～350×105 Pa 2.高速: 例，分离20种氨基酸，经典色谱法要20 多小时，用HPLC只需1小时。 3.高效：3万塔板/米（GC2000塔板/米） 4.高灵敏度： 紫外检测器10-9 g 荧光检测器10-11g
高效液相色谱
第Байду номын сангаас页
第7讲
高效液相色谱
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2高效液相色谱仪及固定相、流动相
内梯度: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两 种或多种不同极性的溶 剂按一定的比例抽入高 压泵中混合。
讨论1
用ODS柱分析一有机弱酸混合物样品， 以某一比例甲醇-水为流动相时，样品容 量因子较小，若想使容量因子增加，较 好的办法是 A 增加流动相中甲醇的比例 B增加流动相中水的比例 C流动相中加入少量HAc D流动相中加入少量的氨水
固定相：薄壳型硅胶(37 ～50 m) 流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径) 检测器：差示折光检测器
可对水果、蔬菜中的农药残留量进 行分析。
2. 稠环芳烃的分析
稠环芳烃多为致癌物质 反相液-液色谱法 固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水 ～100%甲醇
广泛应用于生物化工、制药、食品和环境 监测中.
5. 电导检测器（electrical conductivity detector）
属电化学检测器，是离子色谱法中应用最 为广泛的检测器
作用原理：根据物质在某些介质中电离后 所产生的电导变化来测定电离物质的含 量。
五、液相色谱法固定相
1. 固定相的形状 （1）全多孔型
讨论2
在反相色谱法中，若以甲醇-水为流动相， 增加甲醇的比例时，组分的容量因子k与 保留时间tR如何变化？
作业
1.在ODS柱上，以甲醇为流动相，某组分的分配 容量k=1.2,如以乙腈为流动相，其k值是增加 还是减少，为什么？
2.在硅胶柱上，用甲苯为流动相，某组分的保留 时间是30min，如果改用四氯化碳或乙醚为流 动相，试分析该组分的保留时间如何变化？
液相色谱仪原理及用途
液相色谱仪原理及用途嗨，朋友们！今天我想和大家聊聊一个超级厉害的科学仪器——液相色谱仪。
这玩意儿可不得了，在化学分析的世界里，那就是一把“金钥匙”，能打开很多神秘物质的大门呢。
咱们先来说说液相色谱仪的原理吧。
想象一下，你有一堆混合在一起的彩色珠子，大的小的、圆的扁的都有，你想把它们按照某种规则分开，这就有点像液相色谱仪要做的事儿。
液相色谱仪里面有个流动相，这流动相就好比是一条河流，它带着那些混合的物质往前走。
而固定相呢，就像是河床上的石头或者水草之类的东西。
那些混合物质里的不同成分，就像不同的小生物，有的和石头关系好，就容易被石头“抓住”，走得慢；有的和水草关系好，也会被水草“拉住”，在水草那儿停留一会儿。
而那些和谁都不太亲近的，就跟着河流跑得飞快。
这样，不同的成分就会在不同的时间到达终点，从而被分开啦。
具体来说，当样品被注入到液相色谱仪里后，它会随着流动相进入到装有固定相的柱子里。
这柱子就像是一个神奇的迷宫，样品里的各种成分在里面绕来绕去。
分子大小、极性等性质不同的物质在这个过程中就会表现出不同的行为。
比如说极性大的物质可能就更喜欢和极性的固定相打交道，在柱子里的移动速度就会慢一些。
就像性格相似的人更容易凑在一起聊天，分不开一样。
那这液相色谱仪到底有啥用呢？这用处可太多了，简直超乎想象！我有个朋友在制药厂工作，他就整天和液相色谱仪打交道。
他告诉我，在制药过程中，液相色谱仪可是大功臣。
你想啊，药物里的成分必须非常精确，不能有太多杂质。
这时候液相色谱仪就像一个超级严格的质检员。
比如说生产一种感冒药，里面有好几种有效成分，还有可能有一些杂质。
液相色谱仪就能把这些成分一个一个地揪出来，看看每种成分的量是不是合适，有没有那些不该存在的杂质。
要是没有它，那生产出来的药可就不敢保证质量了，这多可怕呀！还有我另一个朋友，在做食品检测的工作。
他说液相色谱仪在他们那儿也是不可或缺的。
现在食品安全多重要啊，大家都很担心食物里有没有有害的添加剂或者农药残留之类的东西。
仪器分析第4讲 高效液相色谱法
经典液相色谱法 75-600 0.01-1.0 1-20 50-200 2-50 1-10
高效液相色谱法 3-50（常用5-10）
20-300 0.05-1.0
2-30 104-105 10-6-10-2
2．高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和 沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数 的20％．对于占有机物总数近80％的那些高 沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质， 目前主要采用高效液相色谱法进行分离和 分析．
3. 柱外效应
由于色谱柱之外的因 素引起的色谱峰的展 宽，例如进样系统、 连接管路及检测器的 死体积等。
3-3 高效液相色谱的类型及其分离原理
液—液分配色谱及化学键合相色谱 液—固吸附色谱 离子交换色谱 离子色谱 空间排阻色谱
1、 液-液分配色谱
liquid- liquid partition chromatography
4、 离子色谱
ion chromatography
离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种 分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分 析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫 外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于 被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景 电导信号掩没而无法检测。
2、 液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
流动相为液体，固定相为固体吸附剂
分离原理：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异
分离前提：K不等或k不等
液—固吸附色谱
固体吸附剂主要类型： 极性的硅胶（应用最广） 氧化铝 分子筛 非极性的活性炭
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一 书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。
中国药典 高效液相色谱讲义
英国药典2000年版
? 附录ID 液相色谱法，简要叙述了仪器、方法、归一化法、效能及 与正文有关的内容。在方法项下，说明要用对照溶液测试，以决 定仪器的设置和获得适当响应的注样量，进行重复进样以验证重 复性，必要时，还要检测理论板数。
? 除另有规定外，测定被测物峰的峰面积。若被测物峰的对称因子 为0.8-1.2，也可测定峰高。在应用梯度洗脱时，则测定峰面积。 在归一化项下，说明在用归一化法测定时最好使用宽范围放大器 和自动积分仪。
仪器包括： 储液器 泵 进样器 色谱柱 检测器
3
色谱柱
? 反相色谱系统使用非极性填充剂，常用的色谱柱填充 剂为化学键合硅胶，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常 用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶也 有使用。
? 正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶 等。
? 离子交换色谱系统使用离子交换填充剂；分子排阻色 谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异 构体的分离通常使用手性填充剂。
? 紫外、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与供 试品溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关；
? 示差折光检测器和蒸发光散射检测器为通用型检测器，对所有的 化合物均有响应；
? 蒸发光散检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与供试品 的质量有关；
? 二极管阵列检测器可以同时记录供试品的吸收光谱，故可用于供 试品的光谱鉴定和色谱峰的纯度检查。
16
分离度(R)
? 用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的 分离程度，是衡量色谱系统效能的关键指标。可以通 过测定待测物质与已知杂质的分离度，也可以通过测 定待测组分与某一添加的指标性成分（内标物质或其 他难分离物质）的分离度，或将供试品或对照品用适 当的方法降解，通过测定待测组分与某一降解产物的 分离度，对色谱系统进行评价与控制。
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的含量
• 定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光 度法。用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其他 组分（如：单丁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配 制的浓度不同的咖啡因标准溶液也注入色谱系统。如流 速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在
色谱图上的保留时间tR（或保留距离）或峰面积A后，可 直接用tR定性，用峰面积作为定量测定的参数，采用工
•
（2）在色谱分析中为什么常采用相对校正因子
fi？
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的 含量
•102.6 参考答案
• （1）解释用反相柱n-C18测定咖啡因的原理。 • 答：反相柱n-C18,是将非极性物质n-C18烷（正构
烷烃）键合到硅胶基质上，分离过程中以极性溶剂为流 动相，实现弱极性化合物的分离。与其他组分（如：单 丁酸、咖啡酸、蔗糖等）相比，咖啡因为弱极性化合物。
作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的 含量
•102.3 操作流程
• 1．标准储备液的配制：准确称取25.0 mg咖啡因标准试 剂，用配制的流动相溶解，转入100 mL容量瓶中，稀释至刻 度。 • 2．用标准储备液配制质量浓度分别为25 g/mL，50 g/mL，75 g/mL，100 g/mL，125 g/mL系列标准溶液。 • 3．启动泵，打开检测器，设置泵的流速为2.3 mL/mm， 检测器的灵敏度设在0.08 AUFS，打开记录仪，将纸速设在1 cm/min。当流动相通过色谱柱约5～10 min．记录仪上基线稳 定后，开始进样。 • 4．将进样阀放在半截（LOAD）位时，用注射器取25 L 浓度最低的标准样（比进佯阀上定量管多5 L以上)，注入进 样阀中。
高效液相色谱原理
高效液相色谱原理
高效液相色谱(HPLC)是一种广泛应用于化学分析和生物分析
领域的色谱分离技术。
该技术基于样品分子在液相中与固定相之间的相互作用差异，实现物质的分离与检测。
HPLC的主要原理是基于样品分子在液相中与固定相之间的分
配和吸附行为。
在HPLC中，样品通常以溶液的形式被注入
到高压下通过色谱柱。
色谱柱中填充有一种固定相材料，这种材料可以选择性地与样品分子相互作用。
当溶液通过色谱柱时，样品分子会与固定相发生相互作用，并发生分离。
分离的结果是样品中不同组分在柱中停留时间的差异。
HPLC的分离过程受到多个因素的影响，包括固定相性质、溶
剂选择和流动相条件等。
固定相的选择是根据样品分子的性质和分离需求来确定的。
溶剂的选择对分离过程和灵敏度起着重要作用。
流动相的流速和温度等参数也会影响分离效果。
在HPLC中，样品分离后通过检测器进行检测。
常用的检测
器包括紫外-可见吸收检测器、荧光检测器和质谱检测器等。
这些检测器能够根据分离物质的特性发生吸收、发射或离子化等反应，并将其转化为电信号进行记录和分析。
HPLC具有高灵敏度、高分辨率、分析速度快等优点，因此在
化学、制药、环境监测等领域得到了广泛应用。
利用HPLC
技术，可以对各种样品进行定量和定性分析，从而实现对样品中各种成分的快速和准确的分离与检测。
高效液相色谱法 教案
高效液相色谱法教案一、课程目标：了解高效液相色谱法的基本原理、操作方法及其在实验室中的应用；通过实验操作，掌握高效液相色谱法的基本操作技能，能够熟练操作仪器，准确分析样品。
二、教学内容：1. 高效液相色谱法的基本原理2. 高效液相色谱法的仪器及其组成3. 高效液相色谱法的操作方法4. 高效液相色谱法在实验室中的应用三、教学步骤：1. 高效液相色谱法的基本原理（1）讲解高效液相色谱法的基本原理，包括样品制备、进样、柱填充材料、色谱柱等。
（2）讲解高效液相色谱法的优点，如高分离效率、分析速度快、适用范围广等。
2. 高效液相色谱法的仪器及其组成（1）讲解高效液相色谱法的仪器及其组成，如进样器、柱、泵、检测器、计算机等。
（2）讲解各部分仪器的作用和原理。
3. 高效液相色谱法的操作方法（1）实验前准备工作，包括仪器的开机、检查仪器状态等。
（2）样品的制备和进样操作，包括样品的选取、制备、进样量的确定等。
（3）柱的调试和运行，包括柱的选择、柱效的调试、柱的平衡等。
4. 高效液相色谱法在实验室中的应用（1）讲解高效液相色谱法在实验室中的应用，如药物分析、食品安全检测、环境监测等。
（2）介绍高效液相色谱法的局限性和未来发展方向。
四、教学要点：1. 理解高效液相色谱法的基本原理和优点。
2. 掌握高效液相色谱法的仪器及其组成，了解各部分仪器的作用和原理。
3. 掌握高效液相色谱法的操作方法，包括样品制备和进样、柱的调试和运行等。
4. 了解高效液相色谱法在实验室中的应用和局限性，了解未来发展方向。
五、教学方法：1. 理论讲解与实验演示相结合的教学方式。
2. 重视实验操作技能的培养，强调实验操作的规范性和精确性。
3. 运用多媒体教学手段，加强教学效果。
六、教学评价：1. 实验操作成绩：考核学生实验操作技能的熟练程度和实验数据分析能力。
2. 课堂测试：考核学生对高效液相色谱法基本原理、仪器及其组成、操作方法等方面的掌握程度。
液相色谱原理
液相色谱原理
液相色谱（HPLC）是一种高效、精确的色谱分析技术，广泛应用于生物化学、药学、环境监测等领域。
其原理基于样品在流动相中与固定相相互作用，通过分离和识别不同成分。
下面我们将详细介绍液相色谱的原理。
首先，液相色谱的分离原理是基于不同成分在流动相和固定相之间的分配系数
不同而实现的。
样品溶液首先被注入流动相中，然后流经填充有固定相的柱子。
在柱子内部，不同成分与固定相发生相互作用，导致它们在流动相和固定相之间分配系数不同，从而实现了成分的分离。
其次，液相色谱的分离原理还与吸附、分配、离子交换、排阻等作用有关。
在
吸附作用中，样品成分与固定相表面发生吸附作用，实现分离。
在分配作用中，样品成分在流动相和固定相之间发生分配，实现分离。
在离子交换作用中，样品成分与固定相中的离子交换树脂发生离子交换作用，实现分离。
在排阻作用中，样品成分在固定相孔隙中发生排阻作用，实现分离。
此外，液相色谱的分离原理还与流动相的性质、固定相的性质、柱温度等因素
有关。
流动相的选择直接影响着样品成分在固定相中的分配情况，固定相的选择直接影响着样品成分的吸附、分配、离子交换、排阻作用，柱温度的控制可以影响样品成分在固定相中的分配系数，从而影响分离效果。
总的来说，液相色谱的原理是基于样品成分在流动相和固定相之间的相互作用
实现的。
它利用了吸附、分配、离子交换、排阻等作用，通过流动相和固定相的选择以及柱温度的控制，实现了对样品成分的高效分离和识别。
液相色谱技术的发展为化学分析领域带来了巨大的便利，也为科学研究和工程实践提供了重要的技术支持。
高效液相色谱法培训PPT课件
注意事项与常见问题解答
样品处理注意事项
01
避免样品污染、损失或变质，确保处理过程的准确性和可重复
性。
常见问题及解决方法
02
针对样品处理过程中可能出现的问题，如回收率低、干扰物质
多等，提供相应的解决方法。
安全与防护
03
注意有毒有害试剂的使用安全，做好个人防护和环境保护工作。
04 方法开发与优化策略
梯度洗脱程序设计思路
初始比例确定
根据待测组分的极性差异，选 择合适的初始流动相比例。
梯度斜率设置
根据组分的分离情况，调整梯 度斜率，使各组分在合适的保 留时间内洗脱出来。
梯度时间设置
确保梯度洗脱过程中，各组分 能够充分分离，同时避免过长 的分析时间。
梯度曲线类型
根据实际需求选择合适的梯度 曲线类型，如线性梯度、凹形
梯度或凸形梯度等。
方法验证内容及标准
精密度
准确度
通过添加回收率试验，验证方法 的准确度，确保测定结果可靠。
考察方法的重复性和中间精密度， 确保测定结果的稳定性。
线性范围
确定方法的线性范围，确保待测 组分浓度在该范围内时，测定结 果准确可靠。
专属性
考察方法对待测组分的选择性， 确保其他共存物质不干扰测定。
长期稳定性
考察样品在规定的储存条件下放置一定时间后的稳定性，以确定 样品的保质期和储存条件。
方法学考察
对分析方法本身进行稳定性考察，包括方法的耐用性、重复性和 中间精密度等指标的评估。
质量控制图绘制和应用
质量控制图绘制
根据长期稳定性考察数据，绘制质量控 制图，包括平均值、标准差和控制限等 指标。
VS
发展历程及应用领域
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高效液相色谱原理一讲一、色谱概述二、高效液相色谱(HPLC)三、几种主要的HPLC 四、HPLC特点、流程及主要部件什么是色谱色谱是色谱法的简称(又叫色层法,层析法),其本质是一种分离分析方法常见的分离方法蒸馏离心电泳过滤色谱(目前最有效的分离方法)一、色谱概述色谱法简介色谱法(Chromatography)溯源多年前俄国植物学家Tswett分离植物色素时采用的实验方法他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直立玻璃管,再加入石油醚使其自由流下,结果色素中各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带Tswett用希腊语chroma(色)和graphos(谱)描述他的实验方法即现在的Chromatography(色谱法)色谱法的发展色谱法是一种现代的分离方法年正式命名世纪年代开始广泛研究和应用高效液相色谱法的广泛应用始于世纪年代色谱法原理色谱法的原理利用混合物中各组份在不同的两相(流动相、固定相）中溶解,分配,吸附等化学作用性能的差异,当流动相中所携带的混合物流过固定相时就会和固定相发生作用(力的作用)。
由于混合物中各组分在性质和结构上有差异与固定相发生作用的大小也有差异。
因此在同一推动力作用下不同组分在固定相中的滞留时间有长有短从而按先后不同的次序从固定相中流出。
两相中有一相是固定的,叫作固定相(StationaryPhase),有一相是流动的,称为流动相(MobilePhase),流动相又叫洗脱剂,溶剂相(Phase):物理化学术语,特指在某一系统中,具有相同成分及相同物理、化学性质的均匀物质部分。
各相之间有明显可分的界面。
分离分离是一个物理过程。
固定相(StationaryPhase)流动相(MobilePhase)进样(Injection)洗脱(Elution)相互作用(Interaction)Temporalcourse淋洗液色谱分离色谱法的分类()按分离过程的机理分:吸附色谱(AbsorptionChromatography)根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实现分离分配色谱(PartitionChromatography)分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度(分配系数)不同离子交换色谱(IonExchangeChromatography)根据样品组份离子交换亲和力的差异分离,简称离子色谱(IC)亲和色谱GPC(GelPermeationChromatography)固定相是疏水性凝胶,流动相是有机溶剂GFC(GelFiltrationChromatography)固定相是亲水性凝胶,流动相是水溶液利用多孔性物质对不同大小的分子的排阻作用进行分离的方法体积排除色谱(SizeExclusionChromatography)利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力进行选择性分离。
()按流动相的物态分:气相色谱(GasChromatography,GC)用气体作为流动相(又叫载气)液相色谱(LiquidChromatography,LC)用液体作为流动相(又叫洗脱剂)()按固定相的形态分:平面色谱纸色谱薄层色谱柱色谱色谱法分类示意图二、高效液相色谱(HPLC)HPLC的产生HPLC 的固定相HPLC的流动相HPLC的产生液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相称为经典液相色谱法柱效低、时间长(常有几个小时)。
高效液相色谱法(HighperformanceLiquidChromatographyHPLC)是在经典液相色谱法的基础上,于年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。
与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀,小颗粒具有高柱效,但会引起高阻力,需用高压输送流动相,故又称高压液相色谱法(HighPressureLiquidChromatographyHPLC)因分析速度快而又称为高速液相色谱法(HighSpeedLiquidChromatographyHSLP)。
也称现代液相色谱。
HPLC是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高效能分离手段高性能色谱柱,高精度输液泵,高灵敏度检测器…广泛应用于各个领域:医药,环保,石化,生命科学,食品工业,农业…无论在技术上,理论上,还是在应用上仍有较大的发展空间高效液相色谱的固定相()固定相以承受高压能力来分类可分为刚性固体和硬胶两大类。
刚性固体以二氧化硅为基质可承受～Pa的高压可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。
如果在二氧化硅表面键合各种官能团可扩大应用范围它是目前最广泛使用的一种固定相。
硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。
可承受压力上限为Pa。
表面多孔型固定相它的基体是实心玻璃球在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料如硅胶、氧化硅、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等。
()固定相按孔隙深度分类可分为表面多孔型和全多孔型两类。
多孔层厚度小、孔浅相对死体积小出峰迅速、柱效高颗粒较大渗透性好装柱容易梯度淋洗时能迅速达到平衡较适合做常规分析。
由于多孔层厚度薄最大允许量受到限制。
全多孔型固定相由直径为nm的硅胶微粒凝聚而成。
这类固定相由于颗粒细(～m)孔仍然较浅传递速率快易实现高效、高速。
特别适合复杂混合物分离及衡量分析。
液相色谱的流动相()流动相特性液相色谱的流动相又称为：淋洗液洗脱剂。
流动相组成改变极性改变可显著改变组分分离状况亲水性固定相常采用疏水性流动相即流动相的极性小于固定相的极性称为正相液液色谱法极性柱也称正相柱。
若流动相的极性大于固定液的极性则称为反相液液色谱非极性柱也称为反相柱。
组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。
()流动相类别按流动相组成分：单组分和多组分按极性分：极性、弱极性、非极性按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。
常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。
采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性以改进分离或调整出峰时间。
()流动相选择在选择溶剂时溶剂的极性是选择的重要依据。
溶剂的极性越高则保留时间缩短通过改变流动相的极性可以得到理想的保留时间。
常用溶剂的极性顺序：水(最大)甲酰胺乙腈甲醇乙醇丙醇丙酮二氧六环四氢呋喃甲乙酮正丁醇乙酸乙酯乙醚异丙醚二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)。
()流动相的要求流动相是液体它对组分有亲合力并参与固定相对组分的竞争因此正确选择流动相直接影响组分的分离度。
对流动相溶剂的要求是：溶剂对于待测样品须具有合适的极性和良好的选择性。
溶剂与检测器匹配①对于紫外吸收检测器应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。
(所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时溶剂对此辐射产生强烈吸收此时溶剂被看作是光学不透明的它严重干扰组分的吸收测量)。
②对于折光率检测器要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相以达到最高灵敏度。
高纯度由于高效液相色谱灵敏度高对流动相溶剂的纯度也要求高。
不纯的溶剂会引起基线不稳或产生“伪峰”。
化学稳定性好低粘度(粘度适中)若使用高粘度溶剂势必增高压力不利于分离①常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等②但粘度过低的溶剂也不宜采用例如戊烷和乙醚等它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡影响分离。
()选择流动相时应注意的几个问题尽量使用高纯度试剂作流动相防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。
避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。
如使固定液溶解流失酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。
试样在流动相中应有适宜的溶解度防止产生沉淀并在柱中沉积。
流动相同时还应满足检测器的要求。
当使用紫外检测器时流动相不应有紫外吸收。
按分离机制的不同分为：吸附色谱法分配色谱法交换色谱法（离子）体积排阻色谱法亲和色谱法三、几种主要的HPLC(一)吸附(液固)色谱基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸。
固定相：固体吸附剂为硅胶、氧化铝等较常使用的是～μm的硅胶吸附剂。
流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。
应用：适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性。
缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾。
(二)分配（液液）色谱基本原理：利用试样各组分在固定相和流动相上的分配比例不同而分离。
在固定相上分配多的组分（分配系数高）后出峰分配少（分配系数低）的先出峰。
流动相：对于亲水性固定液采用疏水性流动相即流动相的极性小于固定液的极性（正相normalphase）反之流动相的极性大于固定液的极性（反相reversephase）。
正相与反相的出峰顺序相反固定相：早期涂渍固定液固定液流失较少采用化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。
C柱（反相柱）。
(三)离子交换色谱基本原理：组分在固定相上发生反复离子交换反应组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。
亲和力大保留时间长。
阳离子交换：RSOHM=RSOMH阴离子交换：RNROHX=RNRXOH 固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂。
流动相：阴离子离子交换树脂作固定相采用酸性水溶液阳离子离子交换树脂作固定相采用碱性水溶液。
应用：离子及可离解的化合物氨基酸、核酸等阳离子交换分离机理ＳＯ３－ＳＯ３－ＳＯ３－ＳＯ３－Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３阴离子交换分离机理５μm(四)体积排阻色谱固定相：具有一定大小孔隙的凝胶原理：借助多孔性凝胶孔径的大小使样品中的大分子不能进入凝胶孔洞而完全被排阻只能沿凝胶粒子之间的空隙通过色谱柱而首先被洗脱出来。
被分析样品可按分子的相对大小分别先后流出。
(五)亲和色谱原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力进行选择性分离。
先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的间隔臂(环氧、联胺等)再连接上配基(酶、抗原等)这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留改变淋洗液后洗脱。
按分离过程物理化学原理分类的各种液相色谱法的比较四、HPLC 特点、流程及主要部件特点流程主要部件HPLC仪器（）液相色谱仪（）液相色谱仪（）液相色谱仪（）HPLC的特点分离效能高选择性能高检测灵敏度高分析速度快流程色谱的基本流程图主要部件输液泵(高压)梯度淋洗器(装置)进样器(装置)分离器(柱)检测器(装置)结果记录器(计算机及软件)()高压输液泵主要部件之一压力：～×Pa。
为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（μm）液体的流动相高速通过时将产生很高的压力因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。
应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性()梯度淋洗装置外梯度(低压梯度):一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。