专题基因工程
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专题基因工程
3、【生物－现代生物技术专题】
为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开
发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新
品系。
（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶
作用于图中的
处，DNA连接酶作用于
处。（填
“a”或“b”）
专题基因工程
例3、依右图有关基因工程的工具酶功能的叙述， 不正确的是
③根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：
蛋白质的氨基酸序列 推测
mRNA的核苷酸序列
推测 结构基因的核苷酸序列
化学合成 目的基因
1、基因文库法 2.利用PCR技术扩增目的基因
（1）PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核 酸合成技术。
（2）目的：获取大量的目的基因 （3）原理：DNA双链复制 （4）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链为单链； 第二步：冷却到55～60℃，引物与两条单链DNA结合； 第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始进行
专题基因工程
第三步：将目的基因导入受体细胞
转化 ——目的基因进入_受__体__细__胞__内，并且在 受体细胞内维持_稳__定__和_表__达__的过程
将目的基因导入 植物细胞
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
方法
将目的基因导入 ——显微注射法 动物细胞 此方法的受体细胞多是受精卵
将目的基因导入 微生物细胞
A、切断a处的酶为限制性核酸内切酶 B、连接a处的酶为DNA连接酶 C、切断b处的酶为解旋酶 D、切断b处的为限制性内切酶
专题基因工程
（二）“分子针线”——DNA连接酶
1．分类：根据酶的来源不同，可分为E·coliDNA连接 酶和T4DNA连接酶两类 2．功能：恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷 酸二酯键。（无专一性） ★两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4DNA连接 酶)的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键 ②区别：E．coIiDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能使 黏性末端之间连接； T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端之间的 效率较低。
专题基因工程
相同
区别
DNA聚 合酶
DNA连 接酶
形成磷 酸二脂 键
只能将单个核苷酸连接到核酸片段 上;
以一条DNA链为模板,形成互补的DNA 链。
将两个DNA片段之是形成磷酸二脂键；
将DNA双链上的两个缺口同时连接起 来，不需要模板。
专题基因工程
（三）“分子运输车”——载体 （1）载体具备的条件： ①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 （2）最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构 简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制 能力的双链环状DNA分子。 （3）其它载体： 噬菌体、动植物病毒
现在多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶 切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶切后，这些线性 DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是
A.3
B.4
C.9
D. 12
专题基因工程
答案：C
2．(高考试题：2007全国理综II)下 列有关基因工程中限制性内切酶的描 述，错误的是 A.一种限制性内切酶只能识别一种特 定的脱氧核苷酸序列 B.限制性内切酶的活性受温度的影响 C.限制性内切酶能别和切割RNA D、限制性内切酶可从原核生物中提取
专题基因工程
基因工程的基本过程
第一步：目的基因的获取
1.目的来自百度文库因是指： 编码蛋白质的基因 。 2.原核基因采取直接分离法获得，真核基因是人工合 成法。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化 学合成法_。
专题基因工程
①鸟枪法： (直接分离法)
供体细胞中的DNA 限制酶
许多DNA片段 与载体连接
——感受态细胞
用氯化钙处理
专题基因工程
第四步：转基因生物的培育
专题基因工程
第五步：目的基因的检测与鉴定
筛选出获得目的基因的受体细胞、培养受体细胞并 诱导目的基因的表达 1.首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插 入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。 2.其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方 法是采用DNA分子杂交技术。 3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采 用抗原—抗体杂交技术。 4.有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如抗虫或 抗病的鉴定等。
互补链的合成。 （5）特点：指数形式扩增
专题基因工程
第二步：重组载体的构建
1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以 遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。
2、方法：同种限制酶分别切 割载体和目的基因，再用DNA 连接酶把两者连接。
标记基因的作用：是为了鉴定受体 细胞中是否含有目的基因，从而将 含有目的基因的细胞筛选出来。常 用的标记基因是抗生素基因。
1．来源：主要是从 原核生物 中分离纯化出来的。 2．功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的 核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个 核苷酸之间的 磷酸二酯键 断开。 3．结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通 常有两种形式： 黏性末端和平末端。
专题基因工程
例1 （08年全国卷理综1）已知某种限制性内切酶 在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如图中箭头所指，如果 该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、 b、c、d四种不同长度的DNA片段。
运载体 导入
受体细胞 外源DNA 扩增 专题基因工程
目的基因 分离
产生特定性状
②反转录法：
以目的基因转录成 的信使RNA为模板，反 转录成互补的单链DNA， 然后在酶的作用下合成 双链DNA，从而获得所 需的基因。
目的基因的mRNA 反转录酶
单链DNA(cDNA) DNA聚合
双链DNA 酶 (目的基因)
专题 基因工程
专题基因工程
一．基因工程的概念
操作环 境
生物 体外
操作对 操作水平 象
基因 分子水平
基本过程
结果
剪切→拼接→ 人类需要的 导入→表达 基因产物
由于基因工程是在 DNA分子 水平上进行操作,因此 又叫做 重组DNA技术 。
优势：目的性强
专题基因工程
基因工程的基本工具
（一）“分子手术刀”—— 限制性核酸内切酶（简 称限制酶）
3、【生物－现代生物技术专题】
为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开
发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新
品系。
（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶
作用于图中的
处，DNA连接酶作用于
处。（填
“a”或“b”）
专题基因工程
例3、依右图有关基因工程的工具酶功能的叙述， 不正确的是
③根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：
蛋白质的氨基酸序列 推测
mRNA的核苷酸序列
推测 结构基因的核苷酸序列
化学合成 目的基因
1、基因文库法 2.利用PCR技术扩增目的基因
（1）PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核 酸合成技术。
（2）目的：获取大量的目的基因 （3）原理：DNA双链复制 （4）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链为单链； 第二步：冷却到55～60℃，引物与两条单链DNA结合； 第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始进行
专题基因工程
第三步：将目的基因导入受体细胞
转化 ——目的基因进入_受__体__细__胞__内，并且在 受体细胞内维持_稳__定__和_表__达__的过程
将目的基因导入 植物细胞
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
方法
将目的基因导入 ——显微注射法 动物细胞 此方法的受体细胞多是受精卵
将目的基因导入 微生物细胞
A、切断a处的酶为限制性核酸内切酶 B、连接a处的酶为DNA连接酶 C、切断b处的酶为解旋酶 D、切断b处的为限制性内切酶
专题基因工程
（二）“分子针线”——DNA连接酶
1．分类：根据酶的来源不同，可分为E·coliDNA连接 酶和T4DNA连接酶两类 2．功能：恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷 酸二酯键。（无专一性） ★两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4DNA连接 酶)的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键 ②区别：E．coIiDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能使 黏性末端之间连接； T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端之间的 效率较低。
专题基因工程
相同
区别
DNA聚 合酶
DNA连 接酶
形成磷 酸二脂 键
只能将单个核苷酸连接到核酸片段 上;
以一条DNA链为模板,形成互补的DNA 链。
将两个DNA片段之是形成磷酸二脂键；
将DNA双链上的两个缺口同时连接起 来，不需要模板。
专题基因工程
（三）“分子运输车”——载体 （1）载体具备的条件： ①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 （2）最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构 简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制 能力的双链环状DNA分子。 （3）其它载体： 噬菌体、动植物病毒
现在多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶 切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶切后，这些线性 DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是
A.3
B.4
C.9
D. 12
专题基因工程
答案：C
2．(高考试题：2007全国理综II)下 列有关基因工程中限制性内切酶的描 述，错误的是 A.一种限制性内切酶只能识别一种特 定的脱氧核苷酸序列 B.限制性内切酶的活性受温度的影响 C.限制性内切酶能别和切割RNA D、限制性内切酶可从原核生物中提取
专题基因工程
基因工程的基本过程
第一步：目的基因的获取
1.目的来自百度文库因是指： 编码蛋白质的基因 。 2.原核基因采取直接分离法获得，真核基因是人工合 成法。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化 学合成法_。
专题基因工程
①鸟枪法： (直接分离法)
供体细胞中的DNA 限制酶
许多DNA片段 与载体连接
——感受态细胞
用氯化钙处理
专题基因工程
第四步：转基因生物的培育
专题基因工程
第五步：目的基因的检测与鉴定
筛选出获得目的基因的受体细胞、培养受体细胞并 诱导目的基因的表达 1.首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插 入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。 2.其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方 法是采用DNA分子杂交技术。 3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采 用抗原—抗体杂交技术。 4.有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如抗虫或 抗病的鉴定等。
互补链的合成。 （5）特点：指数形式扩增
专题基因工程
第二步：重组载体的构建
1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以 遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。
2、方法：同种限制酶分别切 割载体和目的基因，再用DNA 连接酶把两者连接。
标记基因的作用：是为了鉴定受体 细胞中是否含有目的基因，从而将 含有目的基因的细胞筛选出来。常 用的标记基因是抗生素基因。
1．来源：主要是从 原核生物 中分离纯化出来的。 2．功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的 核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个 核苷酸之间的 磷酸二酯键 断开。 3．结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通 常有两种形式： 黏性末端和平末端。
专题基因工程
例1 （08年全国卷理综1）已知某种限制性内切酶 在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如图中箭头所指，如果 该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、 b、c、d四种不同长度的DNA片段。
运载体 导入
受体细胞 外源DNA 扩增 专题基因工程
目的基因 分离
产生特定性状
②反转录法：
以目的基因转录成 的信使RNA为模板，反 转录成互补的单链DNA， 然后在酶的作用下合成 双链DNA，从而获得所 需的基因。
目的基因的mRNA 反转录酶
单链DNA(cDNA) DNA聚合
双链DNA 酶 (目的基因)
专题 基因工程
专题基因工程
一．基因工程的概念
操作环 境
生物 体外
操作对 操作水平 象
基因 分子水平
基本过程
结果
剪切→拼接→ 人类需要的 导入→表达 基因产物
由于基因工程是在 DNA分子 水平上进行操作,因此 又叫做 重组DNA技术 。
优势：目的性强
专题基因工程
基因工程的基本工具
（一）“分子手术刀”—— 限制性核酸内切酶（简 称限制酶）