高效液相色谱柱发展史
高效液相色谱( high performance liquid chromatography, HPLC
高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）也叫高压液相色谱（high pressure liquid chromatography）、高速液相色谱（high speed liquid chromatography）、高分离度液相色谱（high resolution liquid chromatography）等。
是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。
它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱。
又因分析速度快而称为高速液相色谱。
高效液相色谱是目前应用最多的色谱分析方法，高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成，其整体组成类似于气相色谱，但是针对其流动相为液体的特点作出很多调整。
HPLC的输液泵要求输液量恒定平稳；进样系统要求进样便利切换严密；由于液体流动相粘度远远高于气体，为了减低柱压高效液相色谱的色谱柱一般比较粗，长度也远小于气相色谱柱。
HPLC应用非常广泛，几乎遍及定量定性分析的各个领域。
使用高效液相色谱时，液体待检测物被注入色谱柱，通过压力在固定相中移动，由于被测物种不同物质与固定相的相互作用不同，不同的物质顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号来判断待侧物所含有的物质。
高效液相色谱作为一种重要的分析方法，广泛的应用于化学和生化分析中。
高效液相色谱从原理上与经典的液相色谱没有本质的差别，它的特点是采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，适于分析高沸点不易挥发、分子量大、不同极性的有机化合物。
发展历史：1960年代，由于气相色谱对高沸点有机物分析的局限性，为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。
1960年代末科克兰（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代。
什么是高效液相色谱(HPLC)
（高效液相色谱）？
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什么是超高效液相色谱（UPLC技术）？
• 2004年，液相色谱的仪器和 色谱柱技术取得了进一步发 展，在分离度、速度和灵敏 度方面实现了显著提升。需 要具有更小颗粒[1.7微米]的 色谱柱和具有专门功能的仪 器，提供15,000 psi [1,000 bar]的流动相，以达到更高 的性能水平。必须从整体上 创建一套新系统来执行超高 效液相色谱（现在称为 UPLC技术）。
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简史和一些定义
• 液相色谱(LC)是俄国植物学家Mikhail S. Tswett在20世纪初 定义的概念。他当时专注于使用填充有颗粒的柱子分离用溶 剂从植物中提取的化合物[叶色素]，这是液相色谱史上的先 驱性研究。
• Tswett用颗粒填充开放式玻璃柱。他发现粉状白垩[碳酸钙] 和氧化铝这两种特殊材料对分离有用。他将样品[均质化植物 叶子的溶剂提取物]倒入柱中，使样品通过颗粒床。然后使纯 溶剂通过。当样品在重力作用下穿过柱子时，可以观察到样 品分成了不同颜色的谱带，这是因为某些组分的移动速度快 于其他组分。
• 高效液相色谱法现在是分析化学领域的一种强大的工具。它能够 分离、鉴定和定量存在于任何可溶于液体的样品中的化合物。目 前，可以轻松鉴定出浓度低至万亿分之一[ppt]级的痕量化合物。 HPLC可以并且已经应用于几乎任何样品，例如药品、食品、保健 品、化妆品、环境基质、法医学样品和工业化学品。
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什么是超高效液相色谱（UPLC技术）？
• 目前，科学家们正在使用颗粒直径甚至 小于1微米的色谱柱以及能够在100,000 psi [6,800 bar]下运行的仪器来从事 基础研究。这让我们可以一窥这项技术 的未来。
• 图：HPLC色谱柱
液相色谱：1-色谱发展历史和分类
高效液相色谱法的应用范围及局限性
• 应用范围
• 高效液相色谱法适于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定 易分解的、分子量大的、不同极性的有机化合物；生物活 性物质和多种天然产物；合成的和天然的高分子化合物等 。
• 涉及到是有化工产品、食品、合成药物、生物化工产品及 环境污染物等领域，约占全部有机化合物的70-80%，其 余20-30%的有机化合物，包括永久性气体，易挥发低沸 点及中等分子量的化合物，只能用气相色谱法进行分析。
同位素 1944年，美国橡树岭实验室和衣阿华州大学分
离和鉴定了稀土元素。 1941年，Martin和Synge发展了分配色谱。
色谱发展历史
• 1944年，Martin发展了纸色谱 • 1952年，Martin和 James发展了气-液分配色
谱，气相色谱问世。
• 1956年，Van Deemter等发表了速率理论。 • 1957年，制作了离子色谱交换氨基酸分析仪。 • 1959年，凝胶过滤色谱。 • Giddings 于1963年奠定色谱理论。 • 1969年，现代液相色谱，1975年，离子色谱法。 • 1981年，毛细管电泳。
• 高效液相色谱法的特点（三高一快） • a.分析效率高-液相色谱柱的柱效可以达到
5×103-----3×104块/m，而原来的经典色谱柱的柱 效只有2-50块/m。
3-HPLC 色谱柱介绍
色谱柱使用保养知识
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内容
色谱柱应用基础 HPLC色谱柱介绍
色谱柱使用保知识
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高效液相色谱柱简介
色谱柱是一根填满填料的管子
柱管的材料(塑料,玻璃,不锈钢…)和尺寸(内径,长短)不尽相同
Waters HPLC色谱柱
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Waters 色谱柱发展历史
ACQUITY UPLC® BEH Amide ACQUITY UPLC® BEH Glycan XBridge Amide XSelect HSS HPLC Columns ACQUITY UPLC® HSS Cyano & PFP columns XSelectTM HSS Cyano & PFP columns XP 2.5 µm Columns
管内的填料更是种类繁多,主要分为三大类 – 硅胶基质 – 聚合物基质 – 无机和有机硅胶杂化基质 色谱柱的性能主要取决于填料的性质和填充技术
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硅胶颗粒的形状
不规则形状 (Irregular)
– 大硅胶颗粒研磨，筛分
– 不粒尺寸和表面积限制
有机基质 (高聚物)
杂化颗粒技术(具硅-碳键机制)
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第一代杂化颗粒的合成过程
Waters 专利技术 荣获2000年全球 R&D 100 大奖
硅甲基嵌入型聚乙氧基 硅烷 (MPEOS)
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高效液相色谱法的发展
高效液相色谱法的发展在所有色谱技术中，液相色谱法（liquid chromatography，LC）是最早（1903年）发明的，但其初期发展比较慢，在液相色谱普及之前，纸色谱法、气相色谱法和薄层色谱法是色谱分析法的主流。
到了20世纪60年代后期，将已经发展得比较成熟的气相色谱的理论与技术应用到液相色谱上来，使液相色谱得到了迅速的发展。
特别是填料制备技术、检测技术和高压输液泵性能的不断改进，使液相色谱分析实现了高效化和高速化。
具有这些优良性能的液相色谱仪于1969年商品化。
从此，这种分离效率高、分析速度快的液相色谱就被称为高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC），也称高压液相色谱法或高速液相色谱法。
气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物，而HPLC则适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。
现在，HPLC的应用范围已经远远超过气相色谱，位居色谱法之首。
高效液相色谱的类型广义地讲，固定相为平面状的纸色谱法和薄层色谱法也是以液体为流动相，也应归于液相色谱法。
不过通常所说的液相色谱法仅指所用固定相为柱型的柱液相色谱法。
通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色谱法和凝胶色谱法四大类。
其实，有些液相色谱方法并不能简单地归于这四类。
表8-1列举了一些液相色谱方法。
按分离机理，有的相同或部分重叠。
但这些方法或是在应用对象上有独特之处，或是在分离过程上有所不同，通常被赋予了比较固定的名称。
表8-1 HPLC按分离机理的分类现在的液相色谱仪一般都做成一个个单元组件，然后根据分析要求将各所需单元组件组合起来。
最基本的组件是高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器和数据系统（记录仪、积分仪或色谱工作站）。
此外，还可根据需要配置流动相在线脱气装置、梯度洗脱装置、自动进样系统、柱后反应系统和全自动控制系统等。
液相色谱仪填料的发展史
液相色谱仪填料的发展史高效液相色谱(HPLC)不仅是一种有效的分析分离手段,也是一种重要的高效制备分离技术。
色谱柱是HPLC系统的核心,不同性能的填料是HPLC广泛应用的基础。
液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。
正相柱：多以硅胶为柱填料。
根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在3—10 µm的范围内。
另一类正相填料是硅胶表面键合—CN，-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。
反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。
也有无定型和球型之分。
常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等，其颗粒粒径在3—10 µm之间。
1960年代，由于气相色谱对高沸点有机物分析的局限性，为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。
1960年代末科克兰（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯（Horvath）、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代。
高效液相色谱使用粒径更细的固定相填充色谱柱，提高色谱柱的塔板数，以高压驱动流动相，使得经典液相色谱需要数日乃至数月完成的分离工作得以在几个小时甚至几十分钟内完成。
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。
在此后的时间里，高效液相色谱成为最为常用的分离和检测手段，在医`学教育网搜集整理有机化学、生物化学、医学、药物开发与检测、化工、食品科学、环境监测、商检和法检等方面都有广泛的应用。
高效液相色谱同时还极大的刺激了固定相材料、检测技术、数据处理技术以及色谱理论的发展。
1960年代前，使用的填充粒大于100μm，提高柱效面临着困境，后来的研究人员便采用微粒固定相来突破着一瓶颈。
科克兰、荷瓦斯制备成功薄壳型固定相，这种在固定相在玻璃微球表面具有多孔薄壳，实现了高速传质，为高效液相色谱技术的发展奠定了稳固的基础。
高效液相色谱柱
高效液相色谱柱高效液相色谱柱是一种在分析化学领域中广泛使用的技术。
它的原理是通过溶液在色谱柱中的流动过程中，对溶质进行分离和纯化。
高效液相色谱柱的优点是分析速度快、分离效果好、操作简便等。
本文将介绍高效液相色谱柱的原理、种类、应用以及未来的发展趋势等内容。
高效液相色谱柱的原理主要包括固定相和移动相两个基本要素。
固定相负责分离溶质，常用的固定相有疏水相、离子相、亲合相等。
移动相则是将溶质带动在柱子中流动的溶剂，通常是有机溶剂和水的混合物。
这样，在溶液在色谱柱中流动过程中，不同溶质会在固定相的作用下发生分离，从而实现对混合物的分析和纯化。
高效液相色谱柱根据固定相的不同可以分为几种不同的类型。
例如，疏水相色谱柱广泛应用于有机物的分离和分析，它的固定相表面通常具有疏水性，可以对有机物进行选择性的吸附和分离。
离子相色谱柱则适用于进行离子化合物的分离和分析，例如酸和碱等。
亲合相色谱柱主要是基于生物大分子与其他化合物之间的生物亲和性进行分析。
高效液相色谱柱在实际应用中有着广泛的用途。
在生命科学研究领域，高效液相色谱柱可以用于对蛋白质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
在药物分析领域，高效液相色谱柱经常被用于药物的纯化和质量控制。
在环境监测方面，高效液相色谱柱可以用于对环境污染物的检测和分析。
此外，高效液相色谱柱还被广泛应用于食品安全、农药残留检测、天然产物分析等领域。
随着科学技术的不断进步，高效液相色谱柱也在不断发展和完善。
目前，研究人员正在努力提高高效液相色谱柱的分离效率和分离速度，使其更加适用于复杂物质的分离和分析。
同时，也在研发新的固定相和移动相，以满足不同类型化合物的分析需求。
此外，一些新的检测技术和装置也被引入到高效液相色谱柱中，提高对溶质的灵敏度和准确性。
总之，高效液相色谱柱是一种重要的分析技术，具有广泛的应用前景和发展空间。
它在生命科学、药物分析、环境监测等领域都有着重要的作用。
随着科学技术的不断进步，相信高效液相色谱柱在未来会发展出更多的新技术和新应用，为我们的科研和生产提供更多的支持和帮助。
色谱的发展史
色谱的发展史色谱的发展史可以追溯到20世纪初。
以下是色谱发展的里程碑事件：1.气相色谱（GC）：在1952年，A.J.P. Martin和R.L.M. Synge发明了气相色谱（GC）技术，这是一种以气体为载体的色谱方法。
GC通过将混合物分离成其组成部分，并根据其在固定相中的相互作用来分析样品。
2.液相色谱（LC）：在1906年，Mikhail Semyonovich Tsvet发明了液相色谱（LC）技术。
这是一种以液体为载体的色谱方法，样品溶解在流动相中通过固定相进行分离。
3.纸层析：在1944年，Archer John Porter Martin和Richard Laurence Millington Synge开发了纸层析技术，这是一种使用纸作为固定相的液相色谱方法。
纸层析是一种简单、便宜且易于使用的色谱方法，广泛应用于初级分析。
4.薄层色谱（TLC）：在1956年，Egon Stahl和Erwin Halpaap 发明了薄层色谱（TLC）技术。
TLC是在平板上进行的一种液相色谱方法，样品溶解在流动相中，通过薄层固定相进行分离分析。
5.高效液相色谱（HPLC）：在1970年代初，Ivar G. Horváth、Janos J. Sólyom和Csaba Horváth等人开发了高效液相色谱（HPLC）技术。
HPLC是一种在较高压力下使用液相分离方法，通过高压泵将样品溶解在移动相中，并通过固定相进行分离。
6.毛细管电泳（CE）：在1981年，Allen J. Bard和Mark S. Wrighton等人发明了毛细管电泳（CE）技术。
CE是一种使用带电粒子在电场中进行分离的色谱方法，也被认为是一种电动色谱技术。
随着科学技术的不断发展，色谱方法得到了不断改进和创新，包括新的柱填充材料、检测器和分析软件的引入，使得色谱技术在分析化学中得到了广泛的应用。
高效液相串联质谱科普
临检主要应用领域
新生儿筛查：氨基酸、肉毒碱、脂肪酸、有机酸 药物中毒、滥用药物分析、止痛药物分析 治疗药物监测：免疫抑制剂、抗癫痫药物、抗心律失常药 内分泌分析：肾上腺激素、性激素 蛋白鉴定和定量：C肽、PTH、血管紧张素 功能医学检测 以美国Mayo Clinic为例，1998年没有LC-MS/MS。2010年，60台LC-
MS/MS，200万个测试。
临床生物化学检验的应用
application of clinical biochemical test
1． 在体内激素检测方面的应用 2． 在血药浓度监测和药物代谢研究中的应用 3． 在遗传性疾病检测中的应用 4． 痕量元素/微量营养素检测中的应用 5． 糖化血红蛋白的检测应用
发展史
1919年，英国科学家弗朗西斯·阿斯顿制成第一台质谱仪，早期的质 谱仪主要是用来进行同位素测定和无机元素分析；
20世纪40年代以后开始用于有机物分析； 60年代出现了气相色谱-质谱联用仪，成为了有机物分析的重要仪器
； 80年代末又出现了一些新的质谱技术，如比较成熟的液相色谱-质谱
联用仪，感应耦合等离子体质谱仪等； 目前质谱分析法已广泛应用于医学、材料、环境、地质、能源、药物
治疗浓度与中毒浓度之间差距很小，不同个体对药物的吸收和代谢差异很大； 因此，需要定期检测血药浓度，既要达到治疗效果，又要防止药物中毒，这就是治疗药物监测
的概念； 质谱技术用于血药浓度监测，具有专属性强、准确度高、重现性好、灵敏度高、成本低等优点
。
内分泌系列
类固醇激素在体内代谢过程非常复杂，因此大部分需通过其代谢产物进行测 定；
地质学: 2% •金属材料，合金等 •土壤、矿石、沉积物
•同位素比的研究 •激光熔蚀直接分析固
高效液相色谱的发展及现状【文献综述】
毕业论文文献综述应用化学高效液相色谱的发展及现状1. 色谱技术的发展历程色谱技术的研究起步于20世纪初，俄国植物学家M.S.Tswett发表了题为“一种新型吸附现象在生化分析上的应用”的研究论文中提到了一种用吸附原理分离植物的方法，并将其命名为色谱法。
但由于这种色谱分离技术速度慢且效率低，没有受到科学界重视。
1938年获得诺贝尔化学奖的德国化学家Kuhn采用Tswett色谱分离技术，在维生素和胡萝卜素的分离和结构的分析中取得了重大成果，色谱法因此得到各国科学家的关注[1]。
可以预想到，在接下来的几十年中，色谱技术更是飞速发展。
随着1940年Martin 和Synge提出液液分配色谱法后，1952年James和Martin发明了气相色谱因此获得1952年诺贝尔化学奖[2]。
紧接着，通过各国科学家的努力，还分别开创了毛细管气相色谱法、毛细管超临界色谱、毛细管电泳和电色谱等分析分离技术，使色谱技术的应用日益广泛。
高效液相色谱出现于20世纪60年代末，由高压泵和键合固定相应用于液相色谱，导致了高效液相色谱的出现。
直至今日，高效液相色谱技术不断发展，并广泛应用在各个领域，成为分析、分离技术中不可或缺的一种尖端科技。
2.高效液相色谱的构成高效液相色谱是近几十年来分析化学中最活跃的领域之一。
这种将分离手段及检测系统相连接的分析分离技术，逐步成为在生化药物、精细化工产品、环境保护等各个领域中主要的物质分析分离方法[3]。
2.1输液系统——泵由于色谱柱很细，填充剂粒度小，因此阻力很大，为达到快速、高效的分离效果，必须要提高柱前压力，以获得高速的液流，使分析、分离更加有效率的进行。
泵为液相提供了流动相流动所必须的压力。
2.2进样系统一般高效液相色谱对于进样系统多采用六通阀进样[4]。
先由注射器将样品常压下注入样品环[5]。
然后切换阀门到进样位置，由高压泵输送的流动相将样品送人色谱柱。
样品环的容积是固定的，因此进样重复性好。
高效液相色谱发展历史的文献
高效液相色谱发展历史的文献
高效液相色谱（HPLC）是一种分离和分析化合物的技术，它的发展历史可以追溯到20世纪60年代。
HPLC的发展历史可以从技术的发明和早期应用开始，到不断的改进和扩展，直至今天成为化学分析中不可或缺的技术。
HPLC技术最初的雏形可以追溯到20世纪60年代初，当时美国的科学家们开始尝试使用液相色谱技术进行化合物的分离和分析。
随着对色谱技术的深入研究，液相色谱的分离效率和分辨率得到了显著提高，从而奠定了HPLC技术的基础。
在接下来的几十年里，HPLC技术经历了多次重大的技术革新和突破。
1970年代，随着高效柱和检测器的改进，HPLC技术开始在药物分析、环境监测和生物化学等领域得到广泛应用。
1980年代，随着色谱柱材料和填料技术的进步，HPLC的分离效率和分辨率得到了进一步提高，使得更多复杂样品的分析成为可能。
1990年代以后，随着液相色谱仪器和软件的不断改进，HPLC技术在食品安全、药物研发和生物医学研究等领域发挥了越来越重要的作用。
在当今，HPLC已经成为化学分析中不可或缺的技术之一，它在
药物分析、环境监测、食品安全、生物医学研究等领域发挥着重要作用。
随着科学技术的不断发展，HPLC技术也在不断创新和完善，为人类的健康和生活质量提供着重要支持。
总的来说，HPLC技术的发展历史可以追溯到20世纪60年代，经过几十年的不断改进和突破，HPLC已经成为一种成熟的分离和分析技术，在各个领域都发挥着重要作用。
反相高效液相色谱
高效液相色谱的结构及原理
钙调蛋白肽段的反相HPLC分离实验
实验仪器和试剂：
仪器： 反相高效液相色谱仪 离心机
试剂： 乙腈 水 0.1%TFA溶剂 钙调蛋白 消化酶
实验步骤：
• 1、打开HPLC，设定所需数值，如：波长 （210nm），流动相流量和比例（乙腈5%到 70%v/v梯度）
• 2、样品处理：样品消化，真空离心浓缩 • 3、待基线平衡和压力稳定后，注射进样 • 4、收集与监测器上出现的吸收峰相对应的组分
• ④高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在μL数量级 • ⑤应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别
是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势
HPLC分类：按照分离机理的不同，可分为以下几类
• HPLC
1、吸附色谱法(adsorptionchromatography） ：以吸附剂为固定相 的色谱
• 1970年中期以后，微处理机技术用于液相色谱，进一步提高了仪器的 自动化水平和分析精度 。
• 1990年以后，生物工程和生命科学在国际和国内的迅速发展，为高效 液相色谱技术提出了更多、更新的分离、纯化、制备的课题，如人类 基因组计划，蛋白质组学有HPLC作预分离等 。
HPLC特点：
• 高效液相色谱法有“四高一广”的特点 ：
• 分配色谱法
反相色谱法(reversedphasechromatography)流动相极性大于固定相极性的 分配色谱法称为反相分配色谱法，简称为反相色谱法。反相色谱法使用非极性 固定相，最常用的非极性固定相是十八烷基硅烷键合硅胶，还有辛烷基硅烷键 合硅胶等。流动相常用水与甲醇、乙腈或四氢呋喃的混合溶剂。在反相色谱中 极大的组分因K值较小先流出色谱柱，极性较小的组分后流出。流动相中有机 溶剂的比例增加，流动相极性减小，洗脱力增强。反相色谱法是目前应用最广 的高效液相色谱法。
高效液相色谱法
60年代研制出气动放大泵、注射泵及低流量往复式 柱塞泵，但后者的脉冲信号很大，难以满足高效液 相色谱的要求。1970年代，往复式双柱塞恒流泵， 解决了这一问题1970年代后，科克兰制备出全多孔 球形硅胶，平均粒径只有7μm，具有极好的柱效， 并逐渐取代了无定形微粒硅胶。之后又制造出的键 合固定相使柱的稳定性大为提高，多次使用成为可 能。1970年后，适合分离生物大分子的填料又成为 研究的热点。1980年后，改善分离的选择性成为色 谱工作者的主要问题，人们越来越认识到改变流动 相的组成是提高选择性的关键
• 流程：如左图所示，流 动相贮器⑴中的流动相 被泵⑵吸入，经梯控制 器按一定的梯度进行混 合然后输出，测其压力 和流量，导入(3）进样 阀（器）经（4）色谱柱 后到（5）检测器检测， 由（7）记录仪记录色谱 图，（6）为废液。
特点（高效液相色谱法有“四高一广”的特点）：
①高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受 到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必 须对载液加高压。 ②高速：分析速度快、载液流速快， 较经典液体色谱法速度快得多，通常 分析一个样品在15～30分钟，有些样 品甚至在5分钟内即可完成，一般小于 1小时。
HPLC已在环境监测中得到广泛应用,特别 适用于分子量大、挥发性低、热稳定 性差的有机污染物的分离和分析如多 环芳烃、酚类、多环联苯、邻苯二甲 酸酯类、联苯胺类、阴离子表面活性 剂有机农药、除草剂等,其中多数属于 美国环保局(EPA)清洁水法案中颁布的 114项优先有机污染物范围。
5.在药品检验中的应用: 现在,在药品质量标准中,对有关物质检查的要 求越来越高,一个药物从合成原料到制备有 关的制剂,再经过贮备、运输、使用,要经过 一段较为复杂和漫长的过程,在此期间,每一 个过程都有可能产生有关的物质,如生产中 可能带入原料、试剂、中间体、副产物和 异构体等;在贮备和运输过程中,可能产生降 解产物,聚合物等。为了保证药物的安全有 效。同时也要考虑到生产的实际情况。因 此,对药物的研究,可以允许有一定量的无害 或低毒性的有关物质液相仪器各厂家的仪 器展。还有对药品的含量测定
高效液相色谱法的简介
高效液相色谱仪
色谱仪器的流程由液体流动相的输液系统、进样系统、分离
系统、检测系统、信号放大记录系统组成，其中高压泵、色 谱柱和检测系统是高效液相色谱的主要部件。
1．贮液罐 （滤棒，可滤去颗粒状物 质） 2．高压泵（输液泵） 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集 器 7．记录装置
3．根据分子结构选择 用红外光谱法，可预先简单地判断样品中存在什么 官能团。然后，确定采用什么方法合适。例如，酸、 碱化合物用离子交换色谱；脂肪族或芳香族用液– 液分配色谱、液–固吸附色谱；异构体用液–固吸附 色谱；同系物不同官能团及强氢键的用液–液分配 色谱
高效液相色谱分离方法的选择参考表
五.高效液相色谱仪
离子对色谱机理：离子对形成机理；离子交换机理；离 子相互作用机理；
例如离子对形成机理：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，组分离子 A-，加入一种反荷离子B+，B+离子由于静电引力与带负电的组分离子生成 离子对化合物A-B+。
A 水相
B 有机相
A B 有机相
由于离子对化合物A-B+具有疏水性，因而被非极性固定相（有机 相）提取。
高效液相色谱固定相和流动相
（－）固定相
1. 高效液相大类：
刚性固体：以二氧化硅为基质，可承受7.O×108～1.O×109Pa的高压，可 制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官 能团，就是键合固定相。
硬胶：主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基 交联而成。可承受压力上限为3.5×108Pa。
流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即 流动相的极性小于固定液的极性（正相色谱），反之， 流动相的极性大于固定液的极性（反相色谱）。正相 与反相的出峰顺序相反；
高效液相色谱分析技术的发展和应用
高效液相色谱分析技术的发展和应用作为化学分析的一种重要技术手段，色谱分析技术在现代化学领域发挥着不可替代的作用。
其中，高效液相色谱分析技术是一种比较新的领域，具有快速、灵敏、准确等优点，因此在分析化学领域得到了广泛的应用。
这篇文章将介绍高效液相色谱分析技术的发展历程、基本原理和应用领域等方面的内容。
一、高效液相色谱分析技术的发展高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）分析技术是指在固定相中，以流动相为介质，通过对生物样品、化学品等成分分离、检测和定量分析的过程。
它是在气相色谱分析技术迅速发展之后逐渐兴起的。
HPLC技术起源于20世纪60年代初期，当时主要是采用传统的柱层析法。
随着科学技术的不断发展，HPLC技术逐渐往高效化、自动化和信息化方向发展。
其中，随着毛细管电泳和质谱联用技术的兴起，该技术的分析速度不断加快，并且对于微量化、高灵敏度和分析精度等方面的要求也不断提高。
二、高效液相色谱分析技术的基本原理1. 色谱柱高效液相色谱分析必不可少的就是色谱柱。
色谱柱的选择决定了整个分析过程中的分离和检测效果。
2. 固定相借助色谱柱内填充的固定相，样品被分离出来的原理实质上是基于样品中成分在固定相上吸附、分配和扩散等不同作用力的平衡。
因此，固定相的选择对分析结果也有着不可忽视的影响。
3. 流动相流动相是指在样品分离过程中，以流体为载体进行的移动相。
不同的样品需要不同的流动相，并且流动相的选择也对分析精度有一定的影响。
与气相色谱不同，高效液相色谱其中一种重要特点在于它的流动相可以是液体。
4. 检测器检测器是分离出来的组分检测和定量的重要工具，不同的检测器都有着自己的优缺点。
例如，紫外检测器能够测出大部分有色、近紫外和紫外区的物质，而荧光检测器可以通过脱羧机制测定不含色团的化合物等。
三、高效液相色谱分析技术的应用领域高效液相色谱分析技术逐渐走向提高灵敏度和分辨率方向，因此在有机化学、医药化学、农药检测等众多领域都得到了广泛的应用。
仪器分析第4讲 高效液相色谱法
经典液相色谱法 75-600 0.01-1.0 1-20 50-200 2-50 1-10
高效液相色谱法 3-50（常用5-10）
20-300 0.05-1.0
2-30 104-105 10-6-10-2
2．高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和 沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数 的20％．对于占有机物总数近80％的那些高 沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质， 目前主要采用高效液相色谱法进行分离和 分析．
3. 柱外效应
由于色谱柱之外的因 素引起的色谱峰的展 宽，例如进样系统、 连接管路及检测器的 死体积等。
3-3 高效液相色谱的类型及其分离原理
液—液分配色谱及化学键合相色谱 液—固吸附色谱 离子交换色谱 离子色谱 空间排阻色谱
1、 液-液分配色谱
liquid- liquid partition chromatography
4、 离子色谱
ion chromatography
离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种 分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分 析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫 外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于 被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景 电导信号掩没而无法检测。
2、 液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
流动相为液体，固定相为固体吸附剂
分离原理：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异
分离前提：K不等或k不等
液—固吸附色谱
固体吸附剂主要类型： 极性的硅胶（应用最广） 氧化铝 分子筛 非极性的活性炭
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一 书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。
高效液相色谱方法
经典的LC色谱（柱色谱）
经典LC特点：仅做为一种分离手段 （1）柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀 （2）常压输送流动相 （3） 柱效低（H↑，n↓） （4）分析周期长 （5），仅靠肉眼观测，且无法在线检测
HPLC的特点
HPLC：分离和分析 （1）柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆 装柱） （2）高压输送流动相 （3）柱效高（H↓，n↑） （4）分析时间大大缩短 （5）靠仪器在线检测
下列优良常规操作能够最大限度降低 维修费用：
• 使用HPLC级试剂和流动相 • 清洁的仪器、流动相和样品，如果必要，进行 过滤 • 保证溶剂的相溶性 • 如果必要，冲洗整个系统，去掉盐，防止污染 • 对仪器的使用、维护和保养进行记录
高效液相色谱方法及应用
• • • • 液相色谱的发展史 液相色谱的基本概念 高效液相色谱的具体操作（Aglient1100） 本实验室应用HPLC的实验总结
历史回顾
• 1906年，俄国植物学家Tswett（茨维特）用碳酸钙作为 吸附剂，分离干燥叶子的石油醚萃取物，发现三种颜 色六条色带，他把这种色带称为“色谱”；属于液固 色谱。 • 1940年，Martin和Synge提出了液液分配色谱；1941年 提出了气相色谱可能性； 1949年，Macllean制作薄层 色谱板 • 1952年，Martin和Synge发展了气相色谱，并获得诺贝 尔奖。 • 60年代末，出现商业高效液相色谱（HPLC),但是由于 泵、检测器的发展滞后，使得HPLC在80年代以后才得 以迅速发展。
HPLC与GC差别
相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别
1．分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品不可检测 占有机物的20% HPLC：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%
高效液相色谱发展史
高效液相色谱发展史高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）是一种重要的色谱技术，其发展史可以追溯到上世纪50年代。
随着化学、医药等领域的不断发展，高效液相色谱的应用范围也不断扩大，成为现代分析化学不可或缺的分离和检测技术之一。
1. HPLC的诞生HPLC最早的萌芽可以追溯到上世纪50年代初，当时荷兰科学家Martin Tswett使用硅胶柱分离了不同的植物色素，并提出了色谱法的基本原理。
20世纪60年代初，日本、美国、英国等国家的科学家陆续开始从事色谱技术的研究工作，并取得了一系列重要的成果。
其中，美国的A.J.Martin教授是HPLC领域的重要奠基人，他在1963年发表的一篇论文中提出了一种新型的液相色谱技术，即高效液相色谱（HPLC）。
HPLC相对传统的液相色谱（TLC）和气相色谱（GC）来说，具有分离效率高、分离能力强、适用范围广、检测灵敏度高、样品处理简单等优点，成为了分析化学研究领域中不可或缺的工具。
2. HPLC的进步在1960年代后半期，HPLC的技术水平有了显著的提高。
随着液相色谱柱材的改进和分离研究的深入，HPLC分离出的目标物质越来越多，对分离效率的要求也越来越高。
同时，总体上HPLC的动态范围、分离效率、灵敏度、分辨率和稳定性等方面也得到了不断改进和提高。
20世纪70年代，随着高速液相色谱技术的发展，HPLC的效率得到了进一步提高。
高速液相色谱使用的分离柱内径小于1mm，需要使用高于常温的温度以及高压驱动，达到快速分离的效果。
随着分析化学领域的发展，HPLC应用的范围也越来越广泛。
例如，HPLC可以用于生物分析、食品检测、环境监测、制药等各个领域。
3. HPLC技术引入中国HPLC技术的引入和应用在中国比较晚，最早可以追溯到20世纪80年代初期。
随着中国经济的发展和科学技术的进步，HPLC技术得到了快速发展。
Ultimate液相色谱柱技术培训资料
• 90年代早期，粒径为 5 µm 的高纯硅胶，即所谓的 B 型硅胶被发展，并成为这个
行业填料的标准，这种 B 型硅胶含有微量的金属。
• 90年代后期，为了满足快速分离的需求，发展了 3 µm 或 3.5 µm 的球形硅胶，其
作用和性能逐渐的获得了人们的认同和接受。
• 21世纪早期，为适应超快速的分离要求，粒径小于 2 µm 的填料被开发出来，发展
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与其它品牌色谱柱 硅胶基质中金属含量的比较
mAU 80 60 40 20 0 0 mAU 80 60 40 20 0 0 mAU 60 40 20 0 0 mAU 60 40 20 0 0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 min 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 min 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 min 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 min
14
HPLC 色谱柱结构
类 型 内径D (cm) 0.3 –0.46 0.1, 0.21 0.8 –1.0 2.0 –5.0 柱长(cm) 3 - 25 15, 25 10 - 25 10 - 25 粒径 (µ m) 3 - 10 3-8 5 - 20 5 - 20
15
分析柱 微孔柱 半制备柱 制备柱
Pore Volume (cm
28
用螯合剂对色谱柱中痕量金属的测定
mAU 160 140 120 100 80 60 40 20 0 0 mAU 160 140 120 100 80 60 40 20 0 0 2 4 6 8 10 12 14 min 2 4 6 8
1
N
N
色谱柱: UltimateTM XB-C18,
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★容量因子(capacity factor，k)--化合物在两相间达到分配平衡时，
在固定相与流动相中的量之比。因此容量因子也称质量分配系数。 容量因子的物理意义：表示一个组分在固定相中停留的时间（t‘R）是
不保留组分保留时间（t0）的几倍。k＝0时， 化合物全部存在于流动相 中，在固定相中不保留，t‘R＝0；k越大，说明固定相对此组分的容量越 大，出柱慢，保留时间越长。
2．定性参数（保留值）
★死时间(dead time，t0)--不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）
通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。
★死体积(dead volume，V0)--由进样器进样口到检测器流动池未被固定
相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定 相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池 体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程，其它3部分只起峰扩展作用。为 防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。V0＝F×t0（F为流速）
分离效率（简称柱效）。N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布 等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质 。在一张多组分色谱图上，如果各组分含量相当，则后洗脱的峰比前面的 峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更 为方便和常用，因为半峰宽更易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。 N与 柱长成正比，柱越长，N越大。用N表示柱效时应注明柱长，如果未注明， 则表示柱长为1米时的理论塔板数。（一般HPLC柱的N在1000以上。）若用 调整保留时间(t‘R)计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数(N有效)。
★理论塔板高度(theoretical plate height，H)---每单位柱长的方差。
实际应用时往往用柱长L和理论塔板数计算。
4．相平衡参数
★分配系数(distribution coefficient，K)--在一定温度下，化合物在两相间
达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。 分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。
第三节 高效液相色谱 (high performance liquid chromat图和峰参数
★色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时
间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。
★基线(base line)--经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出
★保留时间(retention time，tR)--从进样开始到某个组分在柱后出现
浓度极大值的时间。
★保留体积(retention volume，VR)--从进样开始到某组分在柱后出现
浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VR＝F×tR
3．柱效参数
★理论塔板数(theoretical plate number，N)---用于定量表示色谱柱的
在不同的色谱分离机制中，K有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数，离子交换 色谱法为选择性系数(或称交换系数)， 凝胶色谱法为渗透参数。但一般情况可 用分配系数来表示。
在条件(流动相、固定相、温度和压力等)一定，样品浓度很低时，K只取决于 组分的性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得 到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K减小，这时色谱峰为 拖尾峰；而有时随着溶质浓度增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只 有尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。
容量因子与分配系数的不同点是：K取决于组分、流动相、固定相的性 质及温度，而与体积Vs、Vm无关；k除了与性质及温度有关外，还与Vs、 Vm有关。由于t‘R、t0较Vs、Vm易于测定，所以容量因子比分配系数应用 更广泛。
★色谱峰(peak)--组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线
上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线） 不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。 前者少见。
色谱图
★拖尾因子(tailing factor，T)，用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称
在同一色谱条件下，样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出色谱 柱；K值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数相 差越大，越容易分离，因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。 在HPLC中，固定相确定后，K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动 相的组成配比及pH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分 离的目的。
一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。
★噪音(noise)--基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测
器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。
★漂移(drift)--基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、
流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也 会产生漂移。
因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)。《中国药典》 规定T应为0.95～1.05。T＜0.95为前延峰，T＞1.05为拖尾峰。 ★峰底-基线上峰的起点至终点的距离。 ★峰高(peak height，h)-峰的最高点至峰底的距离。 ★峰宽（peak width，W)-峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间 的距离。W＝4σ ★半峰宽（peak width at half-height，Wh/2)-峰高一半处的峰宽。 Wh/2＝2.355σ ★标准偏差（standard deviation，σ )-正态分布曲线x＝±1时（拐点）的 峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分 在流出色谱柱过程中的分散程度。σ 小，分散程度小、极点浓度高、峰形 瘦、柱效高；反之，σ 大，峰形胖、柱效低。 ★峰面积(peak area，A)-峰与峰底所包围的面积。