高效液相色谱仪的结构
《中国药典》2015版通则0512高效液相色谱法
通则0512高效液相色谱法高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。
色谱柱内径一般为3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。
超高液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。
（1）色谱柱反相色谱柱：以键和非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂优十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。
常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反向色谱。
离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。
有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。
色谱柱的内径和长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。
温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。
为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。
残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相的pH值一般应在2～8之间。
残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。
（2）检测器最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。
高效液相色谱仪结构.
形成色谱图。
山东中医药高等专科学校
高效液相色谱仪结构示意图
山东中医药高等专科学校
谢
谢
山东中医药高等专科学校
精 品 课 程 配 套 电 子 教 案
中 药 制 剂 分 析 技 术
山东中医药高等专科学校
高效液相色谱仪
山东中医药高等专科学校
山东中医药高等专科学校
高效液相色谱仪一般由输液系统、进样系统、色谱柱系统、 检测系统、仪器控制及数据记录处理系统等构成。 其工作流程为高压泵将贮液器内的载液送到色谱柱入口，试样 液由进样器注入，随载液进入色谱柱进行分离。分离后的各组 分进入检测器，转变成相应的电信号，由数据处理装置记录，
高效液相色谱原理
高效液相色谱法（HPLC）一、方法原理1、液相色谱法概述高效液相色谱分析法其工作流程为：高压输液泵将贮液器中的流动相以稳定的流速(或压力)输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导人，流动相将样品依次带入预柱、色谱柱，在色谱柱中各组分被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据处理系统记录、处理和保存。
HPLC仪器的基本结构2、高效液相色谱法的特点（HPLC）与经典柱色谱原理相同，是由液体流动相将被分离混合物带入色谱柱中，根据各组分在固定相及流动相中吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异来进行分离。
由于高压输液泵、高灵敏度检测器和高效固定相的使用，提高了柱效率，降低了检出限，缩短了分析时间。
特点是选择性高、分离效能高、分析速度快的特点。
高沸点有机物的分析、离子型化合物、高分子化合物、热稳定性差的化合物以及具有生物活性的物质，弥补了气相色谱法的不足。
高效液相色谱法与气相色谱法相比，各有所长，互相补充。
如果能用气相色谱法分析的样品，一般不用液相色谱法，因为气相色谱法分析速度更快、更方便、成本更低。
3、高效液相色谱法的固定相和流动相（1）固定相表面多孔型和全多孔型两大类。
（2）流动相（淋洗液）流动相的选择对改善分离效果产生重要的辅助效应。
从实用，选用的流动相具有廉价、易购的特点外，还应满足下列要求：①与固定相互不相溶，并能保持色谱柱的稳定性。
②高纯度，以防所含微量杂质在柱中积累，引起柱性能的改变。
③与所用的检测器相匹配。
④应对样品有足够的溶解能力，以提高测定的灵敏度。
⑤具有低的黏度（可减少溶质的传质阻力，提高柱效）和适当低的沸点。
⑥应避免使用具有显著毒性的溶剂，以保证工作人员的安全。
液相色谱法中常用的流动相有正己烷、正庚烷、甲醇、乙腈等。
4、高效液相色谱法的主要类型（1）液—固吸附色谱法①分离原理：基于各组分吸附能力的差异来进行混合物分离的。
②固定相：极性和非极性两种。
极性固定相：硅胶、氧化镁。
苯、联苯、萘的高效液相色谱分析
苯、联苯、萘的高效液相色谱分析一、实验目的1、理解、掌握反相色谱的原理与优点。
2、了解高效液相色谱仪的组成与结构。
3、掌握归一化定量方法的特点和适用范围。
二、实验原理色谱分析是以色谱分离为基础的一种分析方法。
色谱分离的基本特点是具备两个相：不动的一相，称一为固定相；另一相是携带样品流过固定相的流动体，称为流动相。
当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。
它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。
高效液相色谱仪器结构如右图所示。
在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，这种色谱法称为反相色谱法。
这种分离方式特别适合于同系物、苯并系物等。
萘、联苯、菲与ODS 柱上固定相的作用力大小不等，它们在固定相与流动相中的分配比k'值不等，被流动相洗脱的速率不同，因而先后流出柱子。
根据各组分的保留时间不同，可对其进行定性鉴别。
根据组分峰面积大小就可求出各组分的含量。
色谱定量分析关键是求出定量校正因子。
色谱定量分析是基于峰面积与组分的量成正比关系，而定量校正因子就相当与比例系数。
但由于同一检测器对不同物质具有不同的响应值，即对不同物质，检测器的灵敏度不同，所以两个相等量的物质得不出相等峰面积。
或者说，相同的峰面积并不意味着相等物质的量。
因此，在计算时，对于不同的物质，需将峰面积乘上各自对应的比例系数，使组分的面积转换成相应物质的量，即W i = f i·A i式中W i为组分i的量，它可以是质量，也可以是摩尔或体积（对气体）；A i为峰面积，f i为换算系数，称为定量校正因子。
HPLC(仪器图)
第三节 高效液相色谱仪
高效液相色谱仪的结构示意图：一般可分为五个主 要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统,
检测系统和数据处理及控制系统。此外还配有
辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。
2018/11/24
I kmb lg I b lg m lg k
2018/11/24
五
•五.数据记录系统和控制系统
色谱工作站 计算机：控制显示
2018/11/24
色谱工作站（计算机 ）：控制显示
流动相 供给和 输送
进样
分离
检测
记录、 数据处 理
温度控 制
收集
◆
流路系统（分析单元）：高、低压流路
◆ 2018/11/24 电路系统（控制单元）：信号传输与处理
2018/11/24
手动进样器、六通阀、定量环
Load
Inject
六通阀定量环
定量环
进柱
通废液口
2018/11/24
仪器：自 动进样器 自动进样器
样品盘
机械手
2018/11/24
自动进样100样品盘、机器手、自动洗针
分离系统
高效分离柱:柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长
5～40 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
2018/11/24
梯度洗脱（gradient)
梯度洗脱（溶剂程序）：在同一个分析周期内按 一定的程序改变流动相的组成,从而改变流动相 极性、离子强度、pH，来调整组分的k值，改变 分离因子α值，以达到最短时间内得到最佳分离 的目的。 ●梯度洗脱的特点 ●梯度洗脱的主要条件 ●梯度洗脱的基本原理
图1高效液相色谱仪的系统流程图原理
液相色谱- 质谱连用技术受到普遍重视, 如分析氨基甲酸酯 农药和多核芳烃等; 液相色谱- 红外光谱连用也发展很快,如在环 境污染分析测定水中的烃类, 海水中的不挥发烃类, 使环境污染 分析得到新的发展。
高效液相色谱仪的应用
高效液相色谱法只要求样品能制成溶液, 不受样品挥发性的 限制,流动相可选择的范围宽,固定相的种类繁多,因而可以分离 热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范 围的物质。
与试样预处理技术相配合,HPLC 所达到的高分辨率和高灵 敏度, 使分离和同时测定性质上十分相近的物质成为可能,能够 分离复杂相体中的微量成分。随着固定相的发展, 有可能在充分 保持生化物质活性的条件下完成其分离。
（2）高压输液泵容易出现的问题是：①压力升不上去：检查一下桌面上是否 有漏下的液滴，如果有拧紧漏液处即可。②压力过高：看一下抽取流动相的 塑料管里是否有气泡，如果有，则按一下Stop，这时候千万别抽气泡，等压 力降下来，最好到0Psi，这时候抽出气泡。如果在过高的压力下抽气泡，后 果会非常严重，流通池会被鼓破，无法分析样品，并且会给你带来很多困 惑，当然如果有经验的话会及时发现，因为流通池破了后会流出蓝色的墨水 样的液体。
高速——流速为0.1～10.0 mL/min。 高效——塔板数可达5000/米。在一根柱中同时分离成份可达 100种。 高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品 少。 HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：
速度快——通常分析一个样品在15～30 min，有些样品甚至在 5 min内即可完成。
高效液相色谱分析法(仪器+组成+分离类型+流动相选择)
2、主 要 部 件
(1) 高压输液泵
主要部件之一，压力：30MPa以上。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（ <10μm），液体的流动相高速通过时，将产生 很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱 的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、 流量稳定可调、耐腐蚀等特性
(2)梯度淋洗装置
3.离子交换色谱分离固定相
结构类别： （1）薄壳型离子交换树脂
薄壳玻璃珠为担体，表 面涂约1%的离子交换树脂； （2）离子交换键合固定相
薄壳键合型；微粒硅胶 键合型（键合离子交换基团）
树脂类别： （1） 阳离子交换树脂（强酸 性、弱酸性） （2） 阴离子交换树脂（强碱 性、弱碱性）
4. 空间排阻分离固定相
liquid-solid adsorption chromatography 固定相：固体吸附剂如硅胶、氧化铝等，较
常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；
流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：利用溶质分子占据固定相表面吸 附活性中心能力的差异；适用于分离相对分子 质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合 物和异构体有较高选择性； 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；
GC：H = A + B / u + C • u （填充柱）
A = 2λ • dp
A ∝ λ • dp
B = 2γ • Dm = 2γ • Dg B ∝ t R ，B ∝ Dg
Dg
∝
T η
或Dg
∝
T M
B = 2γ • Dm
Dm
∝
T η
柱温T ↓低，流动相η ↑大 ⇒B相忽略
在高效液相色谱中, 液体的扩散系数
(4) 高效分离柱
高效液相色谱仪的基本结构
高效液相色谱仪的基本结构
高效液相色谱仪（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）的基本结构包括以下
几个主要组成部分：
1. 色谱柱：色谱柱是HPLC中最重要的部分，用来分离混合物中的化合物。
色谱柱通常是由一种填充材料（常为固体颗粒）填充在特定长度的金属或玻璃管中形成的。
填充材料可以为疏水性、亲水性、离子交换等，根据需要选择。
2. 注射器：注射器用于将待测样品溶液注入色谱柱，通常为一个可调节容积的活塞机构。
3. 泵系统：泵系统用来提供稳定的流动相（溶剂）流动，将待测物溶液从注射器推入色谱柱。
4. 检测器：检测器用于检测待测物质离子或分子的信号，常见的检测器有紫外-可见光谱检测器、荧光检测器、电化学检测器等。
5. 计算机与数据处理系统：计算机与数据处理系统用于采集、存储和分析检测器所得到的数据，并进行数据处理和结果计算。
6. 控制模块：控制模块用于控制其他各部分的运行，如泵的流速控制、注射器的操作等。
7. 进样器：进样器用于将待测样品从样品瓶中自动或手动进样到注射器中。
8. 恒温装置：恒温装置用于保持色谱柱和溶剂的温度恒定，以确保分析结果的稳定性。
9. 分离柱：分离柱是一种将待测物物质快速分离开的设备。
高效液相色谱(HPLC)简介
2. 流动相类别
按流动相组成分：单组分和多组分；
按极性分：极性、弱极性、非极性；
按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。
常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、
乙腈、水。
采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动
相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
3. 流动相选择
在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累 积，损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱 子。如使固定液溶解流失，酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。 （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并 在柱中沉积。 （4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测 器时，流动相不应有紫外吸收。
高效液相色谱（HPLC）简介
目
1, 液相色谱分析法的发展 2, 高效液相色谱的特点 3, 高效液相色谱仪简介 4, 液相色谱法介绍 5, 分析方法的选择 6, 实际分析操作过程
录
1、液相色谱分析法的发展
20世纪初： 俄国植物学家茨维特提出经典液 相色谱法。经典液相色谱法包括柱色 谱、薄层色谱、纸色谱。 20世纪60年代末： 随着色谱理论的发展、高效细微 固定相的开发、高压恒流泵及高灵敏 度检测器的应用，高效液相色谱法得 到了突破性的发展。
a. 紫外检测器
应用最广，对大部分有机 化合物有响应。 特点： 灵敏度高；
线性范围宽；
流通池可做得很小(1mm × 10mm ，容积 8μL)； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。
b. 光电二极管阵列检测器
紫外检测器的重要进展；
高效液相色谱原理
高效液相色谱法（HPLC）一、方法原理1、液相色谱法概述高效液相色谱分析法其工作流程为：高压输液泵将贮液器中的流动相以稳定的流速(或压力)输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导人，流动相将样品依次带入预柱、色谱柱，在色谱柱中各组分被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据处理系统记录、处理和保存。
HPLC仪器的基本结构2、高效液相色谱法的特点（HPLC）与经典柱色谱原理相同，是由液体流动相将被分离混合物带入色谱柱中，根据各组分在固定相及流动相中吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异来进行分离。
由于高压输液泵、高灵敏度检测器和高效固定相的使用，提高了柱效率，降低了检出限，缩短了分析时间。
特点是选择性高、分离效能高、分析速度快的特点。
高沸点有机物的分析、离子型化合物、高分子化合物、热稳定性差的化合物以及具有生物活性的物质，弥补了气相色谱法的不足。
高效液相色谱法与气相色谱法相比，各有所长，互相补充。
如果能用气相色谱法分析的样品，一般不用液相色谱法，因为气相色谱法分析速度更快、更方便、成本更低。
3、高效液相色谱法的固定相和流动相（1）固定相表面多孔型和全多孔型两大类。
（2）流动相（淋洗液）流动相的选择对改善分离效果产生重要的辅助效应。
从实用，选用的流动相具有廉价、易购的特点外，还应满足下列要求：①与固定相互不相溶，并能保持色谱柱的稳定性。
②高纯度，以防所含微量杂质在柱中积累，引起柱性能的改变。
③与所用的检测器相匹配。
④应对样品有足够的溶解能力，以提高测定的灵敏度。
⑤具有低的黏度（可减少溶质的传质阻力，提高柱效）和适当低的沸点。
⑥应避免使用具有显著毒性的溶剂，以保证工作人员的安全。
液相色谱法中常用的流动相有正己烷、正庚烷、甲醇、乙腈等。
4、高效液相色谱法的主要类型（1）液—固吸附色谱法①分离原理：基于各组分吸附能力的差异来进行混合物分离的。
②固定相：极性和非极性两种。
极性固定相：硅胶、氧化镁。
高效液相色谱法介绍(一)
使用单一溶剂，往往不能达到很好的分离效果，往往使用混合溶剂通常使用 一个高极性和低级性溶剂组成的混合溶剂，高极性的溶剂还有增加区分度的 作用，常用的溶剂组合 洗脱剂：一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为： 石油迷<己烷<苯<乙醚<THF（次氢呋喃）<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇 极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统 极性较大的用甲醇：氯仿系统 极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统 拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸
七、常见故障的排除
故 泵启动不良
障
故 障 原 因 （1）溶剂水平面太低 （2）溶剂中有气泡析出 （1）色谱柱超负荷 （2）非缓冲流动相使酸性 或碱性样品的色谱峰 发生拖尾 （1）柱子超负荷 （2）样品组分在柱子上积 聚，柱子沾污柱效变 坏 （3）柱填料与流动相未完 全达到平衡 （1）柱子被玷污，柱效下 降 （2）固定相流失 （3）梯度系统对色谱柱 （固定相）不合适. （4）柱温过高 （5）流动相强度太高
峰形不好，出现平头峰或拖 尾峰
分离度下降
保留时间减少
故
障
故 障 原 因 （1）温度不稳 （2）泵启动不良 （3）溶剂中有气泡 （1）长时间的基线漂移可 能由于室温波动引起 （2）池座垫圈漏液 （3）流通池污染 （4）UV灯不亮 （1）样品阀，进样垫或注 射器被污染 （2）溶解样品溶剂的洗脱 峰 （3）样品溶液中有气泡 （4）梯度洗脱溶剂不纯 （特别是水） （1）电源线内部折断 （2）灯启动器有毛病 （3）UV灯泡有毛病 （4）保险丝断开
a.光源（氘灯）发出的光经聚光透镜聚焦，由可旋转组合滤光片滤 除杂散光，再通过入口狭缝至下面反射镜，经反射到达光栅，光 栅将光衍射色散成不同波长的单色光，当某一波（190nm~600nm） 的单色光经平面镜反射，反射至分束器时，透过光分束器的光通 过样品的流通池，最终到达检测样品的光电二极管测量；被光分 束器反射的光到达检测基线波动的参比光电二级管；当获得测量 和参比光电二极管的信号差，即为样品的检测信息。 b.可变波长紫外吸收检测器的某一时刻只能采集某一特定波长的 吸收信号。 光栅的偏转可由预先编制的采集信号程序加以控制，以便于采 集某一特定波长的吸收信号，并可使色谱分离过程洗脱出的每 个组分峰都获得最灵敏的检测。
液相色谱仪结构及原理
液相色谱仪结构及原理高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达 4.9´107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。
一、特点：1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。
一般可达150～350×105Pa。
2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。
高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于1h 。
3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。
4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。
如荧光检测器灵敏度可达10-11g。
另外，用样量小，一般几个微升。
5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。
而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。
对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的75% ～80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。
据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。
二、性质及原理：高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。
用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。
第十八章 高效液相色谱法
5 10 72.1
( P2' 8.7 ) / 2
P2' 8.7 1.16 2
6.38 5.1 (1 ) 10.2
= 0.75
即调整溶剂比例为 75%甲醇和25%水可使该组分的 k 值为5。
四、正相键合相色谱法
固定相：极性键合相
如－CN、－NH2或二羟基键合硅胶
）。
A 样品的k降低，tR降低 B 样品的k增加，tR增加 C 相邻组分的增加 D 对基本无影响
2．用ODS柱分析一有机弱酸混合物样品，以某一比例甲醇一水为 流动相时，样品容量因子较小，若想使容量因子适当增加，较好 的办法是（ ）。 A 增加流动相中甲醇的比例 C 流动相中加人少量HAc B 增加流动相中的水的比例 D 流动相中加人少量的氨水
五、反相键合相色谱法
1. 固定相：非极性键合相 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）键合硅胶
流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等
应用：非极性至中等极性的组分，还有有机酸、碱及盐等
2. 保留机制：疏溶剂理论
溶质的保留主要是溶质分子与
极性溶剂分子间的排斥力，促
P
' mix
i Pi
i 1
n
'
式中i 为混合溶剂中各溶剂的体积百分数。 二元混合溶剂的则为
P P B P
' AB ' A A
式中A， B分别为二元混合溶剂中溶剂A和溶剂B的体积百分数。
溶剂的选择性
溶剂可分为八组而分别位于图中不同区。 I 组的 xe值较大， 属质子受体溶剂； VII 组的 xd 值较大，属质子给于体溶剂； V 组
高效液相色谱法
高效液相色谱法《中国药典》2015年版高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。
色谱柱内径一般为3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。
超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。
（1）色谱柱反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。
常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。
离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。
有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。
色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。
温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。
为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。
残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在2～8之间。
残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。
（2）检测器最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。
《仪器分析》4-高效液相色谱法
(4) 示差折光检测器： 是一种中等灵敏度(10–6 g/mL)的通用型检测器。
是利用纯流动相和含有待测组分的流动相之间折射率的 差别进行检测的。
可分为三类：反射式；折射式（偏振式）和干涉式。常 用前两种。
优点：灵敏度适宜，操作简便是一种通用型的检测器； 缺点：对温度变化敏感，不能用于梯度洗脱。 应用范围：聚合物、糖。还用于分析以紫外检测和荧光
精选课件
药典中的液相色谱检测器
精选课件
常用的检测器:
(1) 紫外光度检测器：是一种选择性浓度检测器，仅 对那些在紫外波长有吸收的物质有响应。
作用原理：基于待测试样对特定波长的紫外光有选择 性的吸收，试样浓度与吸光度的关系服从比尔定律。
结构：
1－低压汞灯 2－透镜 3－遮光板 4－测量池 5－参比池 6－紫外滤光片 7－双紫外光敏电阻
精选课件
⑶ 色谱柱 GC柱很长，特别是毛细管柱可长至几十米至上百米，柱效
很高(理论塔板数N = 104~106)。HPLC柱较短，一般为15~25 cm，柱效(理论塔板数N = 103~104)，低于GC柱。 ⑷ 检测器
与GC相比，HPLC检测器种类较多。 ⑸ 制备色谱
GC难以制备样品，因为进样量小，难以收集或被破坏。 HPLC可进行制备，即制备色谱。
精选课件
2. 进样系统
在高效液相色谱中，常用的进样方式： 高压阀进样：优点是能用于高压，适于大体积进样，重现性
好；缺点是进样阀进样时需排掉一部分试样，不同的进样 量需用不同的定量管，同时峰的扩展也比注射进样大。 微量注射器进样：也可由微量注射器注入取样环少量样品， 即采用较大体积取样环而进少量试样，进样量由注射器控 制，试样不充满取样环，只填充一部分体积。
高效液相色谱仪的测定原理
一． 实验目的：
1． 学习高效液相色谱法的测定原理；
2． 了解并掌握高效液相色谱仪（HP1100） 的基本构造。
二． 实验原理：
高效液相色谱法是重要的色谱方法，是在经典 液相色谱法和气相色谱的基础上发展起来的，（经 典液相色谱法使用粗粒多孔固定相，装填在大口径、 长玻璃管柱内，流动相仅靠重力流经色谱柱，溶质 在固定相的传质、扩散速度极其缓慢，柱入口压力 低，仅有低的柱效，分析时间长；气相色谱原理类 似，流动相为气体，只能分离小分子量、低沸点的 有机化合物，配合程序升温可分析高沸点的有机化 合物。）弥补了经典液相色谱法和气相色谱的缺点。
（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类
等）。
反相色谱法 一般用非极性固定相（如C18、
C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、
异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以
调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化
合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统
计，它占整个HPLC应用的80%左右。
随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应 用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样
品或易解离样品的分析。为控制样品在分
析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的 pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的 pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值 会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷 基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.5~10范定相极性 流动相极性 组分洗脱次序
5． 检测器：常用的有紫外检测器 （VWD），光电二极管矩阵检测器（DAD）折光指 数检测器（RID），电导检测器（ECD），荧光检测 器（FD）。
折光指数检测器（RID），电导检测器 （ECD）分别测定柱后流出液的总体折射率和电 导率，测定灵敏度低，易受流量和温度的影响，造 成较大的漂移和噪声，不适合痕量分析。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
四、高效液相色谱仪的结构
高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统等五大部分组成（图3-1-2）。
分析前，选择适当的色谱柱和流动相，开泵，冲洗柱子，待柱子达到平衡而且基线平直后，用微量注射器把样品注入进样口，流动相把试样带入色谱柱进行分离，分离后的组分依次流入检测器的流通池，最后和洗脱液一起排入流出物收集器。
当有样品组分流过流通池时，检测器把组分浓度转变成电信号，经过放大，用记录器记录下来就得到色谱图。
色谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。
图3-1-2 高效液相色谱仪的结构示意图
1.高压输液系统
高压输液系统由溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱装置和压力表等组成。
(1) 溶剂贮存器。
溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容量为1～2L，用来贮存足够数量、符合要求的流动相。
(2) 高压输液泵。
高压输液泵（图3-1-3）是高效液相色谱仪中关键部件之一，其功能是将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。
由于液相色谱仪所用色谱柱径较细，所填固定相粒度很小，因此，对流动相的阻力较大，为了使流动相能较快地流过色谱柱，就需要高压泵注入流动相。
对泵的要求：输出压力高、流量范围大、流量恒定、无脉动，流量精度和重复性为0.5%左右。
此外，还应耐腐蚀，密封性好。
高压输液泵，按其性质可分为恒压泵和恒流泵两大类。
恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相粘度和柱渗透无关。
恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流量。
图3-1-3 恒流柱塞泵
(3) 梯度洗脱装置。
梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。
梯度洗脱装置分为两类：
一类是外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。
另一类是内梯度装置（又称高压梯度），将两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再输至柱系统。
梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。
它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度程序）来达到。
2.进样系统
进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。
六通进样阀是最理想的进样器，其结构如图3-1-4。
图3-1-4 六通进样阀装置
3.分离系统
分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。
色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成，如图3-1-5。
其内径为2 ~ 6mm，柱长为10 ~50cm，柱形多为直形，内部充满微粒固定相，柱温一般为室温或接近室温。
图3-1-5 常见色谱柱外形
4.检测器
最常用的检测器为紫外吸收检测器，它的典型结构如图3-1-6。
图3-1-6 紫外检测器光路图
1-低压汞灯2-透镜3-遮光板4-测量池5-参比池6-紫外滤光片7-双紫外光敏电阻检测器是液相色谱仪的关键部件之一。
对检测器的要求是：灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等。
在液相色谱中，有两种类型的检测器，一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或物理化学特性有响应。
属于此类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等；另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理和化学性质响应。
属于此类检测器有示差折光检测器等。