6、微生物的生长与环境条件

6、生理指标法
测含氮量 蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，蛋白质 含氮量是16%。细菌蛋白质含量占细菌固形物的50%-80%，一般以65%为代 表。通过测含氮量就可推知微生物的浓度。 蛋白质总量=含氮量×6.25 细菌总量=蛋白质含量÷65%
其他方法 含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸、产热、 粘度等，都可用于生长量的测定。 借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来测定相应的指标。
个体生长——微生物细胞个体吸收营养物质，进行新陈代
谢，原生质与细胞组分的增加为个体生长。
群体生长——群体中个体数目的增加。可以用重量、体积、
密度或浓度来衡量。 在微生物学中提到的“生长”，一般均指群体生长，这一 点与研究大生物时有所不同。 个体生长个体繁殖 群体生长 群体生长 = 个体生长 + 个体繁殖
直接法（血球计数板、比例计数法） 间接法（活菌计数法、液体稀释法、膜过滤法）
（二）微生物生长量和生理指标测定法 直接法(干重法，堆体积法) 间接法（比浊法，碳、氮含量法，其它生理指标）
1.血球计数板法
适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。 不适用于细菌等个体较小的细胞，因为（1）细菌细胞太 小，不易沉降；（2）在油镜下看不清网格线，超出油镜 工作距离。
步培养细胞。
二、微生物的连续培养 将微生物置于一定容积的培养ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ中,经过培养生长，最 后一次收获。
分批培养（batch culture） ：或封闭培养。将微生物臵 于一定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。 不再补充和更换，最后一次性收获。 连续培养（continuous culture） ：在微生物培养的过 程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌体及 代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数 生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种 稳定状态。
延迟期（停滞期）、 对数生长期、 稳定期 、 衰亡期。
丝状真菌的生长曲线没有单细胞微生物典型的对数生长期。 有三个阶段：延迟期、迅速生长期、衰退期。
延滞期 对数期
稳定期
衰亡期
1、延迟期（lag phase）
将少量菌种接入新鲜培养基后,在开始一段时间内菌数不立 即增加,或增加很少,生长速度接近于零。
恒浊器与恒化器的比较
装臵 控制对象 培养 基 培养基 流速 生长速 率 产物 应用 范围
恒浊器 菌体密度 无限 （内控制） 制生 长因 子
不恒定
最高
大量菌体 或与菌体 形成相平 行的产物
生产 为主
恒化器 培养基流 速（外控 制）
有限 制生 长因 子
恒定
低于最 高
不同生长 速率的菌 体
实验 室为 主
第二节 微生物的生长规律
一、微生物的个体生长和同步生长 由于微生物细胞极其微小，研究其个体生长存在着技术 上的困难。 同步生长（synchronous growth） ：一个细胞群体中各个 细胞都在同一时间进行分裂的状态，进行同步分裂的细胞称 为同步细胞。 同步培养技术（synchronous culture）：设法使群体中的所有 细胞尽量都处于同样的细胞生长和分裂周期中，然后分析此 群体的各种生物化学特征，从而了解单个细胞所发生的变化。
3、 稳定期（stationary phase）
由于营养物质消耗，代谢产物积累和pH等环境变化，逐步不适宜于细菌生 长，导致生长速率降低直至零，即细菌分裂增加的数量等于细菌死亡数。 特点： ①新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，微生物的生长速率处于动 态平衡，培养物中的细胞数目达到最高值。 ②细胞分裂速度下降，开始积累内含物，产芽孢的细菌开始产芽孢。 ③此时期的微生物开始合成次生代谢产物，对于发酵生产来说，一般在稳 定期的后期产物积累达到高峰，是最佳的收获时期。 产生原因： 营养物尤其是生长限制因子的耗尽 营养物的比例失调，如碳氮比不合适; 有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等） 物化条件（pH、氧化还原势等）不合适
应用意义： 稳定期的长短，与菌种和外界环境条件有关。发酵生产 形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量
延长此期，提高产量，措施如下：
• • • • 补充营养物质（补料） 调pH 调整温度 对好氧菌增加通气量或搅拌
4、衰亡期（decline phase）
营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率超过新生
连续培养技术——恒浊培养
概念：通过调节培养基流速，使培养液浊度保持恒定的连 续培养方法。 原理：通 过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速 度来维持菌浓度不变,即浊度不变。主要采用恒浊器，当 浊度高时，使新鲜培养基的流速加快，浊度降低，则减慢 培养基的流速。 特点：基质过量，微生物始终以最高速率进行生长，并可 在允许范围内控制不同的菌体密度；但工艺复杂，烦琐。 使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行的 某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。
连续培养器
按控制方式分 内控制（控制菌体密度）：恒浊器 外控制（控制培养液流速、以控制生长速 率）：恒化器 单级连续培养器 多级连续培养器
按培养器的级数分
按细胞状态分
一般连续培养器 固定化细胞连续培养器
按用途分
实验室科研用：连续培养器 发酵生产用：连续发酵罐
连续培养技术——恒化连续培养
概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的 方法。 原理：通过控制某一种营养物浓度（如碳、氮源、生长因子等） ， 使其始终成为生长限制因子，而达到控制培养液流速保持不变，并 使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖。 特点：维持营养成分的亚适量，控制微生物生长速率。菌体生长速 率恒定，菌体均一、密度稳定，产量低于最高菌体产量。 应用范围：实验室科学研究
特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率。
缺点: 不能区分死菌与活菌; 不适于对运动细菌的计数; 需要相对高的细菌浓度; 个体小的细菌在显微镜下难以观察。
2.平板菌落计数法
一个菌落可能是多个细胞一起形成,所以在科研中一般用 菌落形成单位(colony forming units, CFU)来表示,而不 是直接表示为细胞数。
◆接种量：一般来说， 接种量增大可缩短甚至消除延迟期 （发酵工业上一般采用1/10的接种量）；
◆培养基成分： ◇在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成 培养基上生长时短；◇接种后培养基成分有较大变化时， 会使延滞期加长，所以发酵工业上尽量使发酵培养基的成 分与种子培养基接近。
在生产实践中的常用以下手段缩短迟缓期:
同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的同一相，彼此间形态、 生化特征都很一致，因而是细胞学、生理学和生物化学等研究的良好材 料。
同步培养法
诱导法
筛选法
化学诱导 物理诱导
过滤法 区带密度梯度离心法 膜洗脱法
获得同步生长的方法主要有两类： 环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等。造成与正常细胞周期不同 的周期变化。
第一节 微生物生长的测定
微生物生长情况可以单位时间里微生物数量或生物量 (Biomass)的变化来评价。
评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响；
评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)作用 的效果； 客观地反映微生物生长的规律；
描述不同种类、不同生长状态的微生物生长情况，需选用 不同的测定指标。 （一）微生物细胞数目的检测法
延长措施：定时定量加入营养物质，同时排出代谢 产物，或使用连续培养。 应用意义
①由于此时期的菌种比较健壮，增殖噬菌体的最适菌龄；生产 上用作接种的最佳菌龄； ②发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度 ③食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期 ④是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等的良好材料。
连续发酵，与单批发酵相比 优点： 缩短发酵周期，提高设备利用率； 便于自动控制； 降低动力消耗及体力劳动强度； 产品质量较稳定； 缺点：杂菌污染和菌种退化
连续发酵的生产时间受以上因素限制，一般 只能维持数月~1年。
三、微生物的纯培养生长曲线 将少量细菌接种到一种新鲜的、定量的液体培养基中 进行分批培养，定时取样计数，以细菌个数或细菌数的对 数为纵坐标，以培养时间为横坐标，连接坐标纸上各点成 一条曲线即细菌的生长曲线。 生长曲线可分为四个时期：
技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速 （15~20min完成操作），严格无菌操作；
同一稀释度三个以上重复，取平均值；每支 移液管及涂布棒只能接触一个稀释度的菌液；
适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营 养琼脂上生长的微生物。
误差：多次稀释造成的误差是主要来源，其 次还有由于样品内菌体分布不均匀、以及不 当操作。
特点： 生长速率= 0
细胞形态变大或增长
细胞内RNA特别是rRNA含量增高 合成代谢活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快），易产生诱导酶 对外界不良条件敏感，如氯化钠浓度、温度、抗生素等化学药物 原因：适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物
影响延迟期长短的因素
◆菌种 ： 繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短； ◆接种物菌龄 ： 用对数生长期的菌种接种时，其延迟期 较短，甚至检查不到延迟期；
第一节 微生物的生长测定 第二节 微生物的生长规律 第三节 影响微生物生长因素
生长：微生物在适宜的环境条件下进行新陈代谢，
当同化作用>异化作用时，生命个体的重量和体积 不断增大的过程。
繁殖：单细胞微生物生长到一定程度时，就以二
分裂等方式形成子细胞，引起个体数目的增加， 称为繁殖。 在高等生物里这两个过程可以明显分开,但在 低等特别是在单细胞的生物里,由于细胞小,这两个 过程是紧密联系又很难划分的过程。
选择法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择，不影响细胞代谢。
硝酸纤维素滤膜法是最经典的获得同步生长的方法