电镜技术

• 切片 超薄切片50nm ± 粘附于铜网上
• 染色
“电子染色” 结构图像之间的反差 醋酸铀—柠檬酸铅双染色法 重金属盐类染色剂
• 电镜观察
免疫电子显微镜技术
免疫电镜（Immunoelectron microscopy,IEM ） 免疫细胞化学反应 高电子密度 亚 细胞水平定位抗原（抗体）
探讨：病因、发病机制，组织发生
注意结合光镜
←X7,500
X45,000→
标记物
酶、铁蛋白、胶体金
1 .酶标记－HRP(40KD) 小，易穿透，稳定
通过戊二醛（过碘酸钠），将抗体IgG或SPA与HRP交联 直接法、间接法、PAP法、ABC法等均可 Fab’－HRP 分子量小（70KD）利于抗体穿透
优点：可借鉴免疫组化（光镜）所用之试剂、操作
步骤、及所示结果，易获成功
缺点：弥散，密度较低，定位精确性较差，不宜对比染色
PDGF-R
2.铁蛋白
12nm颗粒（大），中心是Fe(OH)3 外围蛋白质 分子量大（440KD），穿透力差 易与环氧树脂非特异吸附而出现背景“着色”
3.胶体金 理想
2HAuCl4+ 3H2O2
(还原剂)
2Au–+8HCl+3O2
胶体金颗粒 （溶胶) —— Au
IgG
(IG)
Au SPA
(PAG)
密度梯度离心 柱层析（S－400） 去除大颗粒聚合物及未标记蛋白 还原剂 白磷 抗坏血酸 枸橼酸钠 5nm 8～13nm >15nm
双标或多标
TNF-R2 ×46000
TNF-R1 ×21000
VWF ×73000
胶金标记之优点：
① ③ ④ ⑤ 抗体活性高 ② 可作光镜对照观察（免疫金银法） 可作对比染色，超微结构清晰 可作双标或多标记 颗粒可定量计数
注意： ⒈ 间接法时，一抗不能用Fab’；用PAG时，一抗不能用羊IgG
⒉
小颗粒（5nm）胶体金不易观察
包埋前法（浸透法） 免疫细胞化学反应→超薄切片制备 → 电镜观察
（厚片）
改用丙烯酸树脂类（acrylic resins）包埋介质 脱水无需太净，粘性小，聚合温度低，非特异性吸附少 如LR White 48～50℃聚合 Lowiryl K4M -35℃聚合 紫外光照启动聚合 HM20/80 -50℃聚合 紫外光照启动聚合 HM23 -80℃聚合 紫外光照启动聚合
不包埋法（冰冻超薄切片法）
包埋后法（浅表法） 超薄切片制备 → 免疫细胞化学反应→电镜观察
（固定、脱水、包埋、超薄切片）
不包埋法 冰冻超薄切片→免疫细胞化学反应→电镜观察
包埋前法
1. 取材：新鲜、1mm3（脑、脊髓灌注固定后取） 2. 固定与切片： ①前固定：处理好“保持抗原性与保持超微结构”的矛盾 ②复合固定液的应用 PG固定液：1 ～ 4% Paraformaldehyde 0.01～0.2％ Glutaraldehyde PLP固定液：Periodate-lysine-Paraformaldehyde （配制方法见附录） ③厚切片（10～40μm） 振动切片机的应用，或浸泡于20～30%蔗糖溶液、 速冻、冰冻切片 ④继续固定 4℃ 4～5h ⑤彻底清洗 4℃ PBS(含2～5％蔗糖)过夜
电镜观察）
包埋后法
制备超薄切片
（镍网或金网）
→ 免疫细胞化学染色
（无需脱树脂）
优点：简便、重复性好、可作多标记 缺点：操作过程中抗原性受损，阳性率低
对策
⒈改用PG、PLP固定 ⒉改用亲水、低温聚合包埋介质
常规用环氧树脂类（epoxy resins）包埋介质 如epon，spurr，araldite等， 疏水、60℃高温聚合
3．免疫细胞化学标记
①用漂染
注意：
② 增加抗体浓度（4～5倍）
③ 1%BSA的应用 ④ 用免疫酶标时，免用H2O2 ⑤ 想方设法增加抗体之穿透力
增加抗体穿透力的措施
① 去垢剂的应用
0.01～0.2% Saponin或Triton X-100 5-10’
② 反复冻融
先浸泡于20％甘油或蔗糖（或10％DMSO），液氮速冻， 室温溶解，重复2～3次
③ 增加PBS的离子浓度
④ 应用Fab’－HRP以减少抗体分子量
⑤ 延长作用时间，4℃过夜
⑥ 反复脱水、水化（不适用于膜受体的研究）
4.超薄切片制备
⒈1％锇酸后固定，1h ⒉0.01mol/L pH 7.4 二甲砷酸钠缓冲液内过夜
⒊脱水、浸透（适当压缩时间）
⒋包埋、聚合
⒌超薄切片（如为免疫酶标，不作对比染色，应尽早
免疫电子显微镜技术
0.2mm
0.2μm
0.2nm
像差、衍 射效应 像差
电镜基本技术
取材，固定，脱水，浸透，包埋，切片，染色
• 取材 关键 快、准、轻、小 1mm3 组织块
• 固定 戊二醛 — 锇酸双重固定 保存组织的精细结构
• 脱水 丙酮、乙醇梯度脱水
• 包埋 包埋剂—多用环氧树脂类 高温聚合（60oC 恒温箱）
兼具包埋前法及包埋后法的优点
步骤： 1.小块组织1～4％多聚甲醛固定（增加组织硬度） 2.浸泡于2.3mol/L蔗糖溶液，平衡渗透压 3.包埋于10％明胶，液氮速冻，超薄切片（50～60nm） 4.置镍网免疫细胞化学染色
双标பைடு நூலகம்或多标记
选包埋后法，金标记（针对不同抗原标以不同直径之胶金颗粒）， 如用间接法，标以不同直径胶金颗粒之二抗如来自同一种类动物时， 防止叠加污染之方法有： 1．双面分别标记，谨慎操作 2．分步固定（灭活） 第一重特异一抗 过量金标记二抗
（饱和第一重一抗之Fc）
多聚甲醛固定
（灭活二抗中未被中和之Fab）
第二重特异一抗
第二重金标记二抗
IEM技术除广泛应用于透射电镜外亦可
应用于扫描及冷冻蚀刻电镜技术（略）
IFNg-R
IgG
Κ ，λ