免疫电镜的细胞化学技术应用
免疫电镜技术(immunoelectron-microscopy-IEM)又称为免
免疫电镜技术（immunoelectron microscopy，IEM）又称为免疫细胞化学技术，是在免疫组织化学技术（immunohistochemistry）的基础上发展起来的，它是利用抗原与抗体特异性结合的原理，在超微结构水平上定位、定性及半定量抗原的技术方法。
该方法为精确定位各种抗原的存在部位、研究细胞结构与功能的关系及其在病理情况下所发生的变化提供了有效的手段。
免疫电镜技术主要经历了铁蛋白标记技术、酶标记技术以及胶体金标记技术三个主要发展阶段。
铁蛋白标记技术适用于细胞膜表面抗原的定位，由于其分子量较大，不易穿透细胞膜，定位细胞内抗原较为困难。
铁蛋白对电镜包埋剂的非特异性吸附很强，不适用于包埋后免疫标记，使其应用受到一定限制。
酶标记免疫电镜技术是将酶（主要是过氧化物酶）与抗体相交联，抗原抗体反应后，加底物显示酶的活性部位，酶反应产物经OsO4处理变为具有一定电子密度的锇黑，可在电镜下观察。
过氧化物酶的相对分子量较小，与其交联的抗体较易穿透经处理的细胞膜，可用于细胞内抗原的定位。
但是酶反应产物比较弥散，因此分辨率不如颗粒性标记物高。
胶体金标记免疫电镜技术是目前应用最广的免疫电镜标记物，该技术是将胶体金作为抗体的标记物，用于细胞表面和细胞内多种抗原的精确定位。
胶体金主要具有以下几个优点：（1）胶体金能稳定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活性不发生明显改变，可制备抗体-胶体金、蛋白A-胶体金、卵白素-胶体金、植物凝集素-胶体金等用于免疫电镜；（2）在电镜下金颗粒电子密度高、圆形且界线清晰，易于辨认，定位比酶反应物更精确；（3）胶体金标记物易于制备，并可以根据需要制备大小不同（1～150nm）的胶体金，因此可进行免疫电镜的双重或多重标记；（4）金颗粒能发射强烈的二次电子，是扫描电镜的理想标记物；（5）胶体金经过银显影增强后，金颗粒外周吸附大量银颗粒而呈现黑色或黑褐色，因此也能用于光学显微镜观察。
光镜和电镜在病理诊断中的应用
光镜和电镜在病理诊断中的应用光学显微镜和电子显微镜是病理诊断中常用的两种显微镜。
光学显微镜（简称光镜）是一种基于光学原理工作的显微镜，能够提供高分辨率的图像，可用于观察组织和细胞的形态和结构。
而电子显微镜（简称电镜）则是一种利用电子束代替光束进行成像的显微镜，具有更高的分辨率和更大的倍率，可用于观察更微小的细胞和组织结构。
下面将分别介绍光镜和电镜在病理诊断中的应用。
光镜在病理诊断中的应用光镜广泛应用于组织学和细胞学的病理诊断中，主要有以下几个方面的应用：1.组织学检查：通过对组织样本进行染色和切片后，使用光镜观察组织的形态和结构，以检测异常变化。
在肿瘤的病理诊断中，光镜能够帮助鉴别肿瘤类型、判断肿瘤的恶性程度以及评估肿瘤的分级和分期。
2.细胞学检查：光镜也被用于观察和分析细胞的形态和结构，以判断细胞的异常变化。
例如，在涂片染色后，光镜可用于检测细胞的形态特征、细胞核的变化、细胞器的变化等。
细胞学检查对于早期癌症的早期诊断和病情监测具有重要意义。
3.免疫组织化学：光镜结合免疫染色技术可以检测组织和细胞中的特定抗原或标记物，以确定特定疾病的诊断和预后。
例如，在肿瘤诊断中，通过免疫组织化学可以检测特定肿瘤标记物的表达情况，有助于区分不同类型的肿瘤。
4.高分辨率成像：光镜的高分辨率成像能力可以提供详细的组织结构信息，帮助病理学家观察微小的病理变化。
这对于病理学家进行病变定位和病变性质评估非常重要，有助于制定最佳的治疗方案。
电镜在病理诊断中的应用相较于光镜，电镜具有更高的分辨率和更大的倍率，能够观察到更细微的结构细节，因此电镜在病理诊断中也发挥着重要作用：1.细胞超微结构的观察：电镜能够观察到细胞和组织的超微结构，如细胞器、细胞核内的核仁、线粒体、内质网等。
通过电镜观察，可以检测细胞内的超微结构变化，判断细胞的功能状态和异常变化。
2.病原微生物的观察：某些病原微生物的大小远小于光限的分辨率，因此光镜很难直接观察到它们。
医疗器械在免疫学研究中的应用
医疗器械在免疫学研究中的应用在现代医疗领域，医疗器械在免疫学研究中扮演着至关重要的角色。
随着科技的不断进步，医疗器械的功能和应用范围也得到了极大的拓展。
本文将重点探讨医疗器械在免疫学研究中的应用，并介绍一些具体的案例，展示这些技术在提高免疫学研究水平和促进医学进步方面的巨大潜力。
一．流式细胞仪流式细胞仪是一种广泛应用于免疫学研究的高级仪器。
可以用于细胞表面标志物的检测、细胞分选和生物荧光标记物的测定等方面。
其功能强大，操作灵活，有效地帮助科研人员开展免疫学研究。
流式细胞仪通过染色或标记细胞上的特定抗原来分析细胞表型，从而定量评估免疫应答或者识别特定的细胞类型。
它可以快速准确地检测细胞表面标志物的表达情况，为研究细胞免疫应答提供重要数据。
同时，流式细胞仪还可以用于细胞的分选和提纯，从而便于后续的实验研究。
二．免疫组织化学免疫组织化学是一种利用抗体与特定抗原结合进行免疫染色的技术。
该技术通过染色的方式，将细胞免疫组化抗原与特定抗体结合，从而揭示细胞、组织或器官中特定抗原的存在和位置。
它可以帮助科研人员快速准确地分析免疫相关疾病的发生机制和病理变化。
免疫组织化学广泛运用于免疫学研究中。
研究人员可以利用这一技术确定特定免疫细胞的存在和分布情况，揭示免疫反应的机制。
此外，免疫组织化学对于疾病的诊断和治疗也具有重要意义，可以帮助医生更准确地判断病情和制定治疗方案。
三．免疫荧光分析免疫荧光分析是一种利用特定特异性抗体与荧光标记物结合的技术，通过观察样本中的荧光信号来分析免疫相关的蛋白质表达和细胞定位。
它在免疫学研究中被广泛应用，能够提供高灵敏度和高分辨率的结果。
免疫荧光分析可以用于检测特定抗体的结合和相互作用，包括抗体与抗原、抗体与细胞表面受体的结合等。
通过观察荧光信号的分布和强度变化，可以探究分子相互作用的机制，研究免疫应答的过程和调控机制。
此外，免疫荧光分析还可以用于研究免疫相关疾病的发生和发展，为临床研究提供重要的实验依据。
4.免疫电镜细胞化学技术
铁蛋白标记抗体是由Singer（1959）首创的一种
免疫细胞化学技术。这技术曾广泛应用于病毒和细胞 表面抗原的检测。铁蛋白作为电镜观察的标记物，具 有颗粒大、分辨率高、散射力强的特点，可用于细胞 膜表面抗原的准确定位。所以，虽然40年后的今天已 发展了多种免疫电镜细胞化学技术，但铁蛋白标记法 仍然是一种基本技术。
优点：
①胶体金能稳定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的
生物活性不发生明显的变化。
②金颗粒具有很高的电子密度，在电镜下金颗粒
清晰可辨，易精确定位。
③不仅可以用于透射电镜的超薄切片观察，也可以用于 扫描电镜对细胞表面的抗原、受体进行标记定位观察。 ④胶体金标记物易于制备，而且可以根据需要制备不同 大小的胶体金，因此可以进行免疫电镜的双重标记。 ⑤根据抗原抗体反应部分结合金颗粒数量的多少，可进 行粗略的免疫细胞化学定量研究。
（2）电镜包埋前免疫金染色
① 新鲜组织经适当固定（0.5%戊二醛-2%多聚甲 醛固定0.5～1h），制成厚切片。 ② 0.05mol/L TBS pH7.4漂洗3次，每次 15min。 ③ 0.1mol/L甘氨酸漂洗10min，灭活自由醛基。 ④ TBS漂洗，5min×3次， ⑤ 1%牛血清孵育组织块30min。
3）样品与染液的均匀分散度为促进样品与染料的均匀
分散提高染色效果，可以采用某些分散剂 4）悬液与染液的酸碱度 一般以中性或略偏酸性（PH 6.4－7）为宜。 5）染色时机的把握 吸去过多样品悬液后尽快滴加负染色液
1、标本－染液混合染色法：
病毒悬液和2％的磷钨酸染液等量混合
用毛细管滴到有膜的载网上（吸去过多的病毒－
（3）电镜包埋后免疫金染色法 ①超薄切片50～70nm，置于镍网或金网中。
电子显微镜免疫细胞化学技术
电子显微镜免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术为在细胞水平上研究免疫反应做出了贡献，但由于光学分辨率的限制，不可能从细胞超微结构水平观察和研究免疫反应。
因此，Singer 于1959年首先提出用电子密度较高的物质铁蛋白（ferritin ）标记抗体的方法，为在细胞超微结构水平研究抗原抗体反应提供了可能。
在此基础上，相继发展了杂交抗体技术、铁蛋白抗铁蛋白复合物技术、蛋白A-铁蛋白标记技术、免疫酶技术及胶体金技术等。
电子显微镜免疫细胞化学技术（以下简称免疫电镜技术技术）区别于免疫细胞化学和常规电镜技术主要在以下几方面：一、组织固定与取材在这方面的要求是即要保存良好的细胞超微结构，又要注意保持组织的抗原性。
因此，选用固定剂不宜过强。
常用的免疫电镜固定剂有多聚甲醛—戊二醛混合液和过碘酸-赖氨酸—多聚甲醛液（Periodate—Lysine –Paraformaldehyde 简称PLP 液）。
也有采用Bouin 氏液、Zamboni 氏液或4%多聚甲醛液（其配制法见附录）。
国外不少文献推荐应用PLP 液于免疫电镜技术，认为该固定液对含糖类丰富的组织固定效果特佳，因为组织抗原绝大多数由蛋白质和糖两部分组成，抗原决定簇位于蛋白部分，有选择性地使糖类固定，就可使抗原性稳定。
PLP 液中过碘酸能氧化糖类，使其产生醛基，再经赖氨酸作用，使新形成的醛基分子间和分子内相互连接，稳定组织抗原。
但赖氨酸价格较贵，不如多聚甲醛戊二醛固定液经济、简便、效果佳。
在取材方面，免疫电镜技术较光镜免疫化学技术要求更迅速、精细。
二、免疫染色分为包埋前染色、包埋后染色和超薄切片免疫染色三种。
1．包埋前染色 即先行免疫染色，在解剖显微镜下将免疫反应阳性部位取出，修整成小块，按常规电镜方法处理，经锇酸固定、脱水、包埋。
如果特异性免疫反应的范围太小，为了准确定位，可作第二次包埋，即第一次包埋时将组织置于两层thermanox 塑料片之间，中夹环氧树脂如夹心面包式，进行高温聚合，然后在解剖显微镜下取出需要部位作第二次包埋。
电子显微镜的医学应用
电镜技术不仅成了医学领域中诸多形态学科的不可缺少的丁具，而且在临床病理分析和研究、临床医学检验诊断等方面都发挥着重要的作用。
特别是对病毒学和细胞学的发展起着重要的作用。
(一)在细胞生物学和分子生物学方面的应用电镜具有很高的分辨率和放大倍数，人们已经能够观察和司「究业细胞的超微结构，例如细胞膜、内质网、细胞骨架、细胞器等的结构，并能把形态结构和生理功能联系起来进行动态研究。
大量的组织、细胞和微生物在病理状态下超微结构变异的实验事实，极大地丰富了细胞生物学的内容，促进了基础医学与临床医学的结合。
例如，利用冷冻蚀刻方法观察到细胞膜的内、外表面，揭示了许多过去未见到的生命科学的新现象、新事实。
超高压电镜有希望对活标本的生命状态进行直接观察。
电镜技术在染色体、生物大分子的结构观察研究方面具有广泛应用，为分子遗传学、生物遗传工程的发展提供了形态学研究的有力工具。
日前，主要应用于蛋白质、核酸、氨基酸系列，以及转录和翻译的基因片段的研究上。
(二)在解剖学中的应用目前用电镜可观察研究所有的人体组织和器官、可观察到血管的微细结构、可研究微血管在各种组织和器官中空间分布的形态特征、能看到骨组织表面的超微结构、还能看到骨细胞的超微结构和骨基质中钙盐在胶原纤维间的沉积过程。
电镜在解剖学中的应用，使得对人体组织结构的认识进入超微结构层次，促进了解剖学的深入发展。
电镜不仅为神经纤维的形态学研究同时也为神经生物学的发展贡献力量。
(三)在病毒研究方面的应用病毒是目前人类认识的最小的生命状态，而电镜是对它们进行直接观察的唯一工具。
许多病毒的发现都依赖于电镜的应用。
利用电镜技术对病毒形态结构、发展发育以及对靶细胞的作用的研究，为病毒性疾病的病因分析及防治提供了形态学资料。
对于不会明显引起细胞发生明显病变的病毒如风疹病毒、鼻病毒等，电镜技术是一种可靠的鉴定、诊断手段。
(四)在临床检验方面的应用随着超微结构诊断学的研究发展，电镜对血液病、肿瘤、肝胆、消化、泌尿、皮肤等方面的多种疑难病症的临床诊断都可提供有价值的资料。
免疫胶体金细胞电镜制样
免疫胶体金细胞电镜制样免疫胶体金细胞电镜制样是一种常用的技术手段，用于观察和研究细胞和组织中的抗原和抗体的相互作用。
本文将详细介绍免疫胶体金细胞电镜制样的方法和步骤，以及其在生物学研究中的应用。
一、胶体金的特性和应用胶体金是一种粒径较小的金颗粒悬浮液，具有良好的生物相容性和稳定性。
在光线照射下，胶体金颗粒呈现出特殊的颜色，可以方便地观察和分析。
由于胶体金颗粒表面具有丰富的官能团，可以与抗体或其他生物分子进行特异性的结合，因此被广泛应用于免疫学研究中。
免疫胶体金细胞电镜制样的原理基于抗原和抗体的特异性结合。
首先，将待观察的细胞或组织样品固定、包埋和切片。
然后，用特异性的一抗与样品中的目标抗原结合。
接着，加入与一抗结合的二抗，二抗上结合有胶体金颗粒。
最后，通过电镜观察和分析胶体金颗粒的位置和分布，从而得到目标抗原的位置和表达情况。
三、免疫胶体金细胞电镜制样的步骤1. 样品的固定：将细胞或组织样品用适当的固定液固定，保持其形态和结构的完整性。
2. 包埋和切片：将固定后的样品进行包埋和切片处理，制备出适合电镜观察的超薄切片。
3. 抗原解露：将切片进行抗原解露处理，使目标抗原暴露在切片表面，方便抗体的结合。
4. 一抗的结合：加入特异性的一抗，使其与目标抗原结合，并进行适当的洗涤，去除非特异性结合物。
5. 二抗的结合：加入与一抗结合的二抗，二抗上结合有胶体金颗粒，形成免疫复合物。
6. 后续处理：对切片进行适当的洗涤和固定处理，以稳定免疫复合物的结构和位置。
7. 电镜观察：使用电镜对样品进行观察和拍摄，分析胶体金颗粒的位置和分布，得到目标抗原的位置和表达情况。
四、免疫胶体金细胞电镜制样的应用免疫胶体金细胞电镜制样技术广泛应用于生物学研究中。
通过该技术，可以观察和研究细胞和组织中的抗原和抗体的相互作用，揭示细胞和组织的分子结构和功能。
具体应用包括以下几个方面：1. 免疫细胞化学：通过观察细胞中特定抗原的表达情况，研究细胞的功能和分化状态。
7免疫细胞化学综合应用
空载： 核为主
短SIRT3： 弥散
长SIRT3： 细胞质， 细胞器
Fig. 3. Cellular localization of SIRT3
full-length and truncated proteins in
Cos7 cells.
(A)Shown are cells transfected with vector plasmid. Strong expression of the EGFP in the nucleus and also expression in the cytoplasm is evident. Nuclei were stained with DAPI and colored red, hence the yellow coloration when the green and red signals are superimposed in the nucleus. (B) The N-terminal (1–142 aa) deleted SIR2T3 gene fused in-frame to the EGFP was transfected. Note the diffused expression of the chimeric EGFP protein throughout the cell. Unlike with the EGFP shown above, there was no preferential expression of the chimeric protein in the nucleus. (C) SIR2T3 fused to EGFP (green), localized predominantly around the nuclear periphery. Red shows the nucleus detected by counterstaining with DAPI .
免疫电镜技术(immunoelectron microscopy,IEM)又称为免
免疫电镜技术（immunoelectron microscopy，IEM）又称为免疫细胞化学技术，是在免疫组织化学技术（immunohistochemistry）的基础上发展起来的，它是利用抗原与抗体特异性结合的原理，在超微结构水平上定位、定性及半定量抗原的技术方法。
该方法为精确定位各种抗原的存在部位、研究细胞结构与功能的关系及其在病理情况下所发生的变化提供了有效的手段。
免疫电镜技术主要经历了铁蛋白标记技术、酶标记技术以及胶体金标记技术三个主要发展阶段。
铁蛋白标记技术适用于细胞膜表面抗原的定位，由于其分子量较大，不易穿透细胞膜，定位细胞内抗原较为困难。
铁蛋白对电镜包埋剂的非特异性吸附很强，不适用于包埋后免疫标记，使其应用受到一定限制。
酶标记免疫电镜技术是将酶（主要是过氧化物酶）与抗体相交联，抗原抗体反应后，加底物显示酶的活性部位，酶反应产物经OsO4处理变为具有一定电子密度的锇黑，可在电镜下观察。
过氧化物酶的相对分子量较小，与其交联的抗体较易穿透经处理的细胞膜，可用于细胞内抗原的定位。
但是酶反应产物比较弥散，因此分辨率不如颗粒性标记物高。
胶体金标记免疫电镜技术是目前应用最广的免疫电镜标记物，该技术是将胶体金作为抗体的标记物，用于细胞表面和细胞内多种抗原的精确定位。
胶体金主要具有以下几个优点：（1）胶体金能稳定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活性不发生明显改变，可制备抗体-胶体金、蛋白A-胶体金、卵白素-胶体金、植物凝集素-胶体金等用于免疫电镜；（2）在电镜下金颗粒电子密度高、圆形且界线清晰，易于辨认，定位比酶反应物更精确；（3）胶体金标记物易于制备，并可以根据需要制备大小不同（1～150nm）的胶体金，因此可进行免疫电镜的双重或多重标记；（4）金颗粒能发射强烈的二次电子，是扫描电镜的理想标记物；（5）胶体金经过银显影增强后，金颗粒外周吸附大量银颗粒而呈现黑色或黑褐色，因此也能用于光学显微镜观察。
免疫电镜实验步骤
免疫电镜实验步骤免疫电镜（immuno-electron microscopy，IEM）是一种结合了免疫学和电镜技术的方法，能够直接在细胞或组织水平上观察和定位特定抗原。
它是一种有力的工具，可以帮助研究人员研究细胞和组织中的蛋白质相互作用，了解其在亚细胞水平的功能和定位。
免疫电镜实验步骤如下：1. 细胞或组织固定：首先，需要处理样品以使其具有电镜处理所需的高度稳定性。
通常，细胞或组织样本会使用交联剂如戊二醛进行固定。
固定的目的是保持样本的形态和结构，并防止其在后续处理过程中发生破坏。
2. 裁剪：将固定的细胞或组织样品切成适当的尺寸和形状以适应电镜的观察要求。
这通常需要非常小的块，以便于后续处理。
3. 过渡液处理：将样品经过一系列的过渡液处理，以去除残留的固定剂和使样品适应后续处理步骤。
这些过渡液通常是缓冲液，比如磷酸盐缓冲液。
4. 与抗原特异性的抗体结合：将样品与抗原特异性的抗体结合，以实现对特定抗原的检测。
这一步骤是免疫电镜实验的核心。
抗体可以直接标记电镜可见的标记物，如金颗粒，或作为未标记抗体来标记后续参与复合物的二级抗体。
5. 渗透处理：对样品进行渗透处理，旨在增强电镜对样品的可见度。
渗透剂的选择基于具体的研究问题，可以使用醋酸铀、酸酮铀等物质。
6. 样品固化：使用适当的聚合剂，如聚合酮树脂，对样品进行固化，以使其能够保持其形态和结构，并便于切片后的后续处理。
7. 切片：将固化的样品切成极薄的切片，通常在50-100 nm的范围内。
切片过程通常通过使用超微切片机或超声刀来完成。
8. 样品染色：对切片的样品进行染色以增强对抗原的可见度。
可以使用核苷酸染料如乌尔红，或金标记等染色剂。
9. 电镜观察：将样品放置在电子显微镜中，并使用适当的电压和放大倍数进行观察和记录。
通过观察电镜图像，可以获得关于抗原的位置、分布和亚细胞定位的信息。
总结：免疫电镜实验是一种强大的技术，可以帮助研究人员观察和定位特定抗原。
免疫电镜技术在植物病毒研究中的应用
免疫电镜技术在植物病毒研究中的应用李文财;周常勇【摘要】免疫电镜技术通过将免疫学与超微结构形态学相结合,利用抗原-抗体的专化性反应对抗原或抗体进行精确定位.介绍免疫电镜技术的原理、发展阶段及其在植物病毒研究中的应用.【期刊名称】《南方农业》【年(卷),期】2011(005)003【总页数】3页(P84-86)【关键词】免疫电镜技术;病原检测;病毒定位【作者】李文财;周常勇【作者单位】西南大学植物保护学院,重庆,400716;西南大学植物保护学院,重庆,400716;中国农业科学院柑橘研究所,重庆,400716【正文语种】中文【中图分类】S432.41免疫电镜技术（Immune electron microscopy，IEM）又称为免疫细胞化学技术（Immunocytochemistry），出现于20世纪50年代。
Singer（1959）首次将铁蛋白作为标记物，用于透射电镜观察取得了成功。
随后，Nakane和Pierce(1966)成功使用辣根过氧化酶（HRP）标记抗体来显示抗原—抗体反应部位。
随着电镜技术的不断发展和完善，免疫电镜技术已被广泛应用于病害诊断、病原鉴定和机理研究等许多领域。
本文主要就免疫电镜技术的原理、发展阶段及其在植物病毒研究中的应用等进行概述。
1 免疫电镜技术的原理与分类1.1 原理利用带有特殊标记的抗体与相应抗原相结合形成具有一定的电子密度的复合物，其能在电镜下观测出相应抗原所在部位。
1.2 发展阶段免疫电镜技术的发展经历了3个阶段：铁蛋白标记免疫电镜技术、酶免疫电镜技术和胶体金免疫电镜定位技术。
（1）铁蛋白标记免疫电镜技术。
铁蛋白是一种含铁量约23%，直径为12～14 nm，大小约750 kDa的球形蛋白，其核心是由4个铁亚基组成的高电子密度氢氧化铁胶态分子团，外层由24个蛋白质亚单位组成近似球形的外壳[1～2]。
铁蛋白通过双功能交联剂与抗体、葡萄球菌A蛋白（SPA）等共价结合，具有分辩率高、散射能力强、可对抗原抗体复合物定位进行准确描述等特点[3]。
免疫组织化学及其在病理诊断中的应用
3. 改善组织的透过性 原因：当待检抗原是存在细胞内或有膜
被、而抗体是大分子的时候，抗体 就很难通过细胞的质膜顺利达到接 触抗原。
办法：用净化剂（即表面活性剂三硝基甲 苯）TritonX－100溶解于PBS中，液 体浸洗组织切片或涂片。
第二部分
免疫组化在临床中的应用
一、免疫组化临床应用的范围及意义
各1支；相应的吸嘴。 磨砂玻片； 空调1台； 恒温箱1台； pH计1台(PHS-25型)。
免疫组化室常用设备
全自动免疫组化染色机
二、免疫酶标技术
20世纪70年代建立 80年代为发展高峰 90年代在国、内外病理科广泛应用
1.免疫酶标技术原理：
将抗原和抗体反应与酶的催化反应相结合 而建立的一种免疫检测技术。
对肿瘤临床有意义的主要有： c-erbB：肿瘤恶性度高→阳性率↑ c-myc：核内瘤蛋白，高表达预示促进肿瘤生 长、发展→ 易出现浸润、转移 p53：通常检测的为突变型，高表达→ 预后差。
组织脱水、浸蜡、包埋等） 缓冲液及有关试剂的配制 抗体的稀释 内源性过氧化物酶的阻断 非特异性染色的消除 实验对照及结果的观察分析等。
基本过程（SP法）
1.切片脱蜡至水。 2.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。 3.水洗。 4.抗原修复。 5.PBS洗3次，1分钟/次。 6.加入血清孵育10分钟。 7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分钟。 8.PBS洗3次，每次2分钟。 9.加入二抗，孵育20分钟。
1.基本原理
维生素H（biotin，生物素）缺乏症：给动 物喂养大量卵蛋白，会导致动物出现维生 素H缺乏症，即蛋白质伤害。
卵蛋白（avidin）与生物素有极高的亲和力， 且具有与其它示踪物质（荧光素、铁蛋白、 过氧化酶等）相结合的能力。
免疫电镜技术(immunoelectronmicroscopy)的染色方法
免疫电镜技术（immunoelectronmicroscopy）的染色方法免疫电镜技术与光镜免疫细胞化学染色方法的基本原理和试剂准备基本相同，相关内容可参考本书第四章，这里仅介绍免疫电镜的几种染色方法，包括包埋前染色、包埋后染色和冰冻超薄切片免疫染色三种。
1．包埋前染色包埋前染色即在进行常规电镜包埋处理前先行免疫组织化学染色，然后于解剖显微镜下将免疫反应阳性部位取出，修成2～4mm3大小的组织块，再按常规电镜方法处理，包括戊二醛的再固定、锇酸后固定、脱水、包埋、超薄切片和电镜观察等。
如果特三性免疫反应的范围太小或只观察特定部位的免疫反应，为了准确定位，可做第二次包埋，引第一次包埋时将已进行免疫反应的组织经戊二醛再固定、锇酸后固定、脱水及包埋剂浸透三置于两层耐高温的透明塑料薄膜之间(类似夹心面包)，高温聚合后。
在解剖显微镜下取出需要的阳性部位作第二次包埋，或将取出的阳性部位用强力快干胶粘在已聚合的包埋剂块上供切片观察。
包埋前染色的组织，以中间部位的结构较理想，表层因受机械修整、挤压的影响，超微结构保存往往不甚理想。
为提高工作效率，进行超薄切片制作前，亦应先制作半薄切片观察。
为避免超薄切片电子染色所用的铅或铀与免疫染色的结果混淆，应将相邻的超薄切片分别捞在两个铜网上，一张直接进行观察，另一张电子染色后观察，对比分析。
包埋前染色法的主要优点：①因组织细胞免疫染色前未经OsO4固定、脱水及树脂包埋等处理，故组织细胞的抗原性保存相对较好，可获得较好的免疫染色效果；②可在光镜下选取免疫反应阳性部位定位制作超薄切片，有利于提高电镜的工作效率。
主要缺点是受到抗体穿透性的限制，组织深层细胞内抗原难以标记。
2．包埋后染色包埋后染色即组织标本经OsO4固定、脱水、树脂包埋及超薄切片后再行免疫组织化学染色。
值得注意的是，在包埋后染色标本制备时，OsO4固定可以省略或尽量缩短后固定时间，因为不少实验表明，OsO4可使组织细胞的抗原性明显减弱。
6.电镜组织化学与免疫电镜技术
第八章 电镜组织化学与免疫电镜技术电镜组织化学技术(electron microscopic histochemistry)，也称电镜细胞化学技术(electron microscopic cytochemistry)，是将组织化学（细胞化学）与电镜技术相结合，用于研究组织细胞的微细结构与功能的一项新技术。
它是在普通光镜组织化学技术的基础上发展起来的，所以，在应用此技术前，需对电镜技术和光镜组织化学技术有所了解。
有关光镜组织化学的基本原理和一些操作注意事项可参考本书其它相关章节，本章主要介绍电镜技术和常用电镜组织化学技术以及免疫电镜技术等。
第一节电镜技术电子显微镜（electron microscope，EM）简称电镜，根据其性能不同，可分为透射电镜（transmission EM，TEM），即通常所说的电镜，另外，有扫描电镜（scanning EM，SEM）)，电子探针分析电镜（electron probe micro analyzer EM），超高压电镜（ultra high pressure EM），冰冻电镜(cryo-EM)，冰冻蚀刻电镜等等。
电镜最大的优势在于具有非常高的分辨率，目前电镜的分辨率已达0.14 nm，远高于光镜分辨率（0.2μm），它将人们带入了微观世界，是生命科学研究者日常工作的重要实验工具，在研究组织细胞的微细构造，蛋白、核酸在亚细胞的分布和功能等方面具有不可替代的优势。
一、TEM的基本原理TEM的应用最为广泛，所以，掌握TEM技术对于理解和应用其它相关电镜技术非常重要。
TEM的基本原理与光镜相似，但TEM是用产生电子束的电子枪代替可见光源，以轴对称的电磁场代替光学的玻璃透镜，将肉眼不可见的电子束成像在荧光屏上，进行观察和记录。
二、超薄切片技术因电子束的穿透能力较低，可被样品吸收，因此，观察的样品必须相当薄，通常为50~80 nm，过厚，电子束易被吸收，不利于TEM观察，过薄，电子束易穿透，但反差低，镜下难以区别组织细胞的微细构造，所以，制作超薄切片是TEM最关键和最基本技术。
电镜酶细胞化学技术-七年制
一、基本原理
(一)X线的产生：
X线是1895年伦琴发现的波长范围0.1～100Å的 电磁辐射，分为特征X线和连续X线。
1.特征X线
入射电子轰击样品，使其原子内壳层发生电离 产生空位，由外壳层电子填补空位时，以辐射 的形式释放出来的能量称为特征X线。
原子由原子核(质子、中子)和核外电子组成。
* 核外电子位于壳层上（K、L、M、N等壳层）； * 每个壳层还可分为若干亚壳层；
(2)组织样品的处理
目的是增强组织的通透性和核酸探针的穿透性 0.03%TritonX-100/PBS 2×10min 蛋白酶K/PBS 37℃ 10min
检测DNA用0.3～3mg蛋白酶K/PBS 37℃ 10min 检测RNA用2～10μg蛋白酶K/PBS 37℃ 10min (蛋白酶K可消化蛋白质，使核酸序列从结合的蛋 白中释放出来；还可以使细胞易被探针与金粒子穿透， 提高杂交信号。)
生物电镜技术
电镜细胞化学技术
Electron microscopic cytochemistry technique
电镜放射自显影法 电镜免疫组织和细胞化学 电镜X线微区分析 糖类、脂类和酶类电镜细胞化学
电镜酶细胞化学
( electron microscopic enzyme cytochemistry )
二.电镜原位核酸杂交的步骤
（电镜下多选用非放射性生物素化的核酸 探针，常以胶体金作为显示系统） 杂交原则 * 使靶核酸保持天然位置与生化活性。 * 使细胞和组织的超微结构保存良好。 * 保证低本底及高杂交率。
(一)杂交前准备 1.固定
要选择能保持细胞结构，并能最大限 度地保持细胞内DNA或RNA水平，使探针 易于进入细胞的固定液。 常用固定液: 4%多聚甲醛 4%多聚甲醛+0.1~3%戊二醛 固定时间: 15min至18h、4℃
免疫电镜技术又称为免
免疫电镜技术（，）又称为免疫细胞化学技术，是在免疫组织化学技术（）的基础上发展起来的，它是利用抗原与抗体特异性结合的原理，在超微结构水平上定位、定性及半定量抗原的技术方法。
该方法为精确定位各种抗原的存在部位、研究细胞结构与功能的关系及其在病理情况下所发生的变化提供了有效的手段。
免疫电镜技术主要经历了铁蛋白标记技术、酶标记技术以及胶体金标记技术三个主要发展阶段。
铁蛋白标记技术适用于细胞膜表面抗原的定位，由于其分子量较大，不易穿透细胞膜，定位细胞内抗原较为困难。
铁蛋白对电镜包埋剂的非特异性吸附很强，不适用于包埋后免疫标记，使其应用受到一定限制。
酶标记免疫电镜技术是将酶（主要是过氧化物酶）与抗体相交联，抗原抗体反应后，加底物显示酶的活性部位，酶反应产物经4处理变为具有一定电子密度的锇黑，可在电镜下观察。
过氧化物酶的相对分子量较小，与其交联的抗体较易穿透经处理的细胞膜，可用于细胞内抗原的定位。
但是酶反应产物比较弥散，因此分辨率不如颗粒性标记物高。
胶体金标记免疫电镜技术是目前应用最广的免疫电镜标记物，该技术是将胶体金作为抗体的标记物，用于细胞表面和细胞内多种抗原的精确定位。
胶体金主要具有以下几个优点：（1）胶体金能稳定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活性不发生明显改变，可制备抗体-胶体金、蛋白胶体金、卵白素-胶体金、植物凝集素-胶体金等用于免疫电镜；（2）在电镜下金颗粒电子密度高、圆形且界线清晰，易于辨认，定位比酶反应物更精确；（3）胶体金标记物易于制备，并可以根据需要制备大小不同（1～150）的胶体金，因此可进行免疫电镜的双重或多重标记；（4）金颗粒能发射强烈的二次电子，是扫描电镜的理想标记物；（5）胶体金经过银显影增强后，金颗粒外周吸附大量银颗粒而呈现黑色或黑褐色，因此也能用于光学显微镜观察。
此外，胶体金还能用于冷冻蚀刻标本的免疫标记。
抗体的制备，标本的处理，免疫标记，对照实验、结果的观察和解析。
抗体的制备特异性高、亲和力强的高效价抗体是获得理想的免疫标记结果的首要条件要。
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鞣酸-柠檬酸钠还原法制备不同大小胶体金颗粒的配方
1%柠檬酸三钠 1%鞣酸 0.025 mol/L K2CO3 径
（ml)
（ml）
（ml）
（nm）
去离子双蒸水 胶体金颗粒直 （ml）
4
0.02
0
15
4
0.1
0
10
4
0.5
0.5
6.0
4
3
3
3.5
19.98 19.90 15.00 14.00
优点： ①胶体金能稳定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的
免疫电镜的细胞化学技术应用
电镜细胞化学技术
电镜细胞化学技术是电镜技术与细胞化学技术相结合 产生的一门新技术，也称超微结构细胞化学。
目的：将化学研究与形态观察相统一，要求在细胞 超微结构水平上研究细胞内各种生化物质（蛋白质、核 酸、脂肪、碳水化合物等）的定位情况以及这些生化物 质在细胞内的动态变化，用以阐明细胞、细胞器结构与 功能的相互关系。
用以标记抗体的酶要具备以下条件： 1.与抗体（或抗原）结合后，仍能保持酶和抗体（或抗原）的生物活性。 2.酶的纯度高、特异性强、稳定、可溶性好、敏感、廉价。 3.在体液或组织中不存在该酶的底物。 酶标技术中最常用的标记酶是辣根过氧化物酶（HRP）
电镜免疫细胞化学技术的标本处理原则
1、取材与固定 取材原则与常规电镜取材相同，力求保持组织新鲜，标本固定要求
包埋后染色：是指在超薄切片上进行免疫染色。 优点：抗原暴露在超薄切片上，不存在免疫试剂分子穿透障碍，不
需要穿透剂。
2.免疫染色
① 直接法：用酶标抗体直接与标本中的相应抗原反应结合， 尔后进行酶与底物反应，终产物沉淀在抗原抗体反应部位。
② 间接法：依次使用两种不同抗体，先使用未标记的特异性 抗体即第一抗体，后者与标本中的抗原反应。然后使用过 氧化物酶标记第二抗体，最后酶与底物反应，生产沉淀。
3．漂洗后的厚切片可按免疫组化步骤进行标记染色。 4．DAB显色后再进行锇酸后固定以及电镜包埋切片处理。 5. 如果确定待测抗原的抗原性不会由于脱水包埋引起失活
的前提下可在包埋切片后做标记染色。
三、免疫染色
包埋前染色：是指在未经包埋的预切厚片上先进行免疫染色，然后 再进行脱水包埋超薄切片。 优点：（1）切片染色前未经四氧化锇固定、脱水、包埋等处理， 对抗原性破坏较小。（2）可在定位后再进行超薄切片，提高阳性检 出率.（3）免疫染色后，用四氧化锇后固定，有利于膜型结构的保 存。
（2）电镜包埋前免疫金染色
① 新鲜组织经适当固定（0.5%戊二醛-2%多聚甲 醛固定0.5～1h），制成厚切片。
② 0.05mol/L TBS pH7.4漂洗3次，每次 15min。
③ 0.1mol/L甘氨酸漂洗10min，灭活自由醛基。 ④ TBS漂洗，5min×3次， ⑤ 1%牛血清孵育组织块30min。
结果判定 在已知阳性、阴性样品成立的前提下，出现高
电子密度的颗粒，即指示抗原抗体的存在。
（二）胶体金免疫电镜技术
利用胶体金在碱性环境中带负电荷的性质，使其 与抗体相互吸引从而将抗体标记。再以金标记的抗体 与待检抗原相互结合，由于金颗粒的电子密度高，电 镜观察到金颗粒的位置，即抗原所在。
2、胶体金的特性 ①颜色：胶体金的颜色与金粒子的直径有关，5-60nm时 为红色，95nm是为蓝色，用于免疫细胞化学的胶体金 呈红葡萄酒色。 ②影响胶体金稳定的因素： a.电解质：少量有促进稳定的作用，过量则破坏。 b.胶体金的浓度：浓度越高容易导致胶体金凝集。 c.温度：长时间加热可使稳定性有所下降。
⑥ 第一抗体4℃孵育过夜后室温继续放置2h。 ⑦ TBS漂洗，5min×3次， ⑧ 室温下适当稀释度的胶体金标记探针（二抗胶体金探
针或蛋白A胶体金探针等）孵育60min。 ⑨ TBS漂洗，3min×3次，后再用双蒸水漂洗切片。 ⑩ 2%戊二醛-2多聚甲醛固定1h，1%锇酸固定30～
4℃18～24h。
免疫电镜技术
免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的 产物，根据抗原抗体的高度特异性结合原理，用高电 子密度的标记物（如：金、铁蛋白等）在超微结构水 平上检测某些抗原性物质的定位、定性、半定量的一 种方法。
目前免疫电镜技术主要包括酶免疫电镜技术，免疫铁蛋白技术和免疫胶 体金技术，此外还有抗体杂交技术、凝集素电镜标记技术和铁蛋白-抗 铁蛋白电镜复合物技术。
60min，常规脱水，包埋，切片染色后电镜观察。
（3）电镜包埋后免疫金染色法
①超薄切片50～70nm，置于镍网或金网中。 ②1% H2O2蚀刻，使试剂能穿透标本。
EPON包埋的组织蚀刻时间约10min，而 LRWhite、LR Gold包埋的组织蚀刻时间则 常小于5min.
③ 双蒸水漂洗3次，每次10min。 ④ 1%牛血清孵育切片15min。 ⑤ 载网不冲洗，摔干后直接移至第一抗滴上，在室温孵育1～2h或
是既要保持组织成分的抗原性，又要保存细胞的超微结构。低浓度的 甲醛短时固定队抗原性保存好，但是超微结构保存又受影响。
（1）2%多聚甲醛液 （2）2%多聚甲醛-0.01%～0.05%戊二醛
（3）4%多聚甲醛-0.5%苦味酸-0.5%戊二醛
2．通过冰冻切片或震动切片获得厚切片。 冰冻切片 8µm ，震动切片20～80µm。
生物活性不发生明显的变化。 ②金颗粒具有很高的电子密度，在电镜下金颗粒
清晰可辨，易精确定位。
③不仅可以用于透射电镜的超薄切片观察，也可以用于 扫描电镜对细胞表面的抗原、受体进行标记定位观察。
④胶体金标记物易于制备，而且可以根据需要制备不同 大小的胶体金，因此可以进行免疫电镜的双重标记。
⑤根据抗原抗体反应部分结合金颗粒数量的多少，可进 行粗略的免疫细胞化学定量研究。
（1）胶体金的制备
①柠檬酸三钠还原法（15nm） ②鞣酸-柠檬酸钠还原法（6nm）
檬酸三钠的用量与胶体金直径的关系
0.01%氯化金 1%柠檬酸三钠
（ml)
（ml）
胶体金颗粒直径 （nm）Βιβλιοθήκη 1003.0100
4.0
100
6.0
100
1.5
100
1.0
100
0.6
19.0 15.0 12.5 24.5 41.0 71.5