免疫电镜的细胞化学技术应用
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3．漂洗后的厚切片可按免疫组化步骤进行标记染色。 4．DAB显色后再进行锇酸后固定以及电镜包埋切片处理。 5. 如果确定待测抗原的抗原性不会由于脱水包埋引起失活
的前提下可在包埋切片后做标记染色。
三、免疫染色
包埋前染色：是指在未经包埋的预切厚片上先进行免疫染色，然后 再进行脱水包埋超薄切片。 优点：（1）切片染色前未经四氧化锇固定、脱水、包埋等处理， 对抗原性破坏较小。（2）可在定位后再进行超薄切片，提高阳性检 出率.（3）免疫染色后，用四氧化锇后固定，有利于膜型结构的保 存。
生物活性不发生明显的变化。 ②金颗粒具有很高的电子密度，在电镜下金颗粒
清晰可辨，易精确定位。
③不仅可以用于透射电镜的超薄切片观察，也可以用于 扫描电镜对细胞表面的抗原、受体进行标记定位观察。
④胶体金标记物易于制备，而且可以根据需要制备不同 大小的胶体金，因此可以进行免疫电镜的双重标记。
⑤根据抗原抗体反应部分结合金颗粒数量的多少，可进 行粗略的免疫细胞化学定量研究。
用以标记抗体的酶要具备以下条件： 1.与抗体（或抗原）结合后，仍能保持酶和抗体（或抗原）的生物活性。 2.酶的纯度高、特异性强、稳定、可溶性好、敏感、廉价。 3.在体液或组织中不存在该酶的底物。 酶标技术中最常用的标记酶是辣根过氧化物酶（HRP）
电镜免疫细胞化学技术的标本处理原则
1、取材与固定 取材原则与常规电镜取材相同，力求保持组织新鲜，标本固定要求
鞣酸-柠檬酸钠还原法制备不同大小胶体金颗粒的配方
1%柠檬酸三钠 1%鞣酸 0.025 mol/L K2CO3 径
（ml)
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（nm）
去离子双蒸水 胶体金颗粒直 （ml）
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19.98 19.90 15.00 14.00
优点： ①胶体金能稳定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的
是既要保持组织成分的抗原性，又要保存细胞的超微结构。低浓度的 甲醛短时固定队抗原性保存好，但是超微结构保存又受影响。
（1）2%多聚甲醛液 （2）2%多聚甲醛-0.01%～0.05%戊二醛
（3）4%多聚甲醛-0.5%苦味酸-0.5%戊二醛
2．通过冰冻切片或震动切片获得厚切片。 冰冻切片 8µm ，震动切片20～80µm。
（2）电镜包埋前免疫金染色
① 新鲜组织经适当固定（0.5%戊二醛-2%多聚甲 醛固定0.5～1h），制成厚切片。
② 0.05mol/L TBS pH7.4漂洗3次，每次 15min。
③ 0.1mol/L甘氨酸漂洗10min，灭活自由醛基。 ④ TBS漂洗，5min×3次， ⑤ 1%牛血清孵育组织块30min。
结果判定 在已知阳性、阴性样品成立的前提下，出现高
电子密度的颗粒，即指示抗原抗体的存在。
（二）胶体金免疫电镜技术
利用胶体金在碱性环境中带负电荷的性质，使其 与抗体相互吸引从而将抗体标记。再以金标记的抗体 与待检抗原相互结合，由于金颗粒的电子密度高，电 镜观察到金颗粒的位置，即抗原所在。
2、胶体金的特性 ①颜色：胶体金的颜色与金粒子的直径有关，5-60nm时 为红色，95nm是为蓝色，用于免疫细胞化学的胶体金 呈红葡萄酒色。 ②影响胶体金稳定的因素： a.电解质：少量有促进稳定的作用，过量则破坏。 b.胶体金的浓度：浓度越高容易导致胶体金凝集。 c.温度：长时间加热可使稳定性有所下降。
（1）胶体金的制备
①柠檬酸三钠还原法（15nm） ②鞣酸-柠檬酸钠还原法（6nm）
檬酸三钠的用量与胶体金直径的关系
0.01%氯化金 1%柠檬酸三钠
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胶体金颗粒直径 （nm）
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19.0 15.0 12.5 24.5 41.0 71.5
免疫电镜技术
免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的 产物，根据抗原抗体的高度特异性结合原理，用高电 子密度的标记物（如：金、铁蛋白等）在超微结构水 平上检测某些抗原性物质的定位、定性、半定量的一 种方法。
目前免疫电镜技术主要包括酶免疫电镜技术，免疫铁蛋白技术和免疫胶 体金技术，此外还有抗体杂交技术、凝集素电镜标记技术和铁蛋白-抗 铁蛋白电镜复合物技术。
免疫电镜的细胞化学技术应用
电镜细胞化学技术
电镜细胞化学技术是电镜技术与细胞化学技术相结合 产生的一门新技术，也称超微结构细胞化学。
目的：将化学研究与形态观察相统一，要求在细胞 超微结构水平上研究细胞内各种生化物质（蛋白质、核 酸、脂肪、碳水化合物等）的定位情况以及这些生化物 质在细胞内的动态变化，用以阐明细胞、细胞器结构与 功能的相互关系。
60min，常规脱水，包埋，切片染色后电镜观察。
（3）电镜包埋后免疫金染色法
①超薄切片50～70nm，置于镍网或金网中。 ②1% H2O2蚀刻，使试剂能穿透标本。
EPON包埋的组织蚀刻时间约10min，而 LRWhite、LR Gold包埋的组织蚀刻时间则 常小于5min.
③ 双蒸水漂洗3次，每次10min。 ④ 1%牛血清孵育切片15min。 ⑤ 载网不冲洗，摔干后直接移至第一抗滴上，在室温孵育1～2h或
⑥ 第一抗体4℃孵育过夜后室温继续放置2h。 ⑦ TBS漂洗，5min×3次， ⑧ 室温下适当稀释度的胶体金标记探针（二抗胶体金探
针或蛋白A胶体金探针等）孵育60min。 ⑨ TBS漂洗，3min×3次，后再用双蒸水漂洗切片。 ⑩ 2%戊二醛-2多聚甲醛固定1h，1%锇酸固定30～
包埋后染色：是指在超薄切片上进行免疫染色。 优点：抗原暴露在超薄切片上，不存在免疫试剂分子穿透障碍，不
需要穿透剂。
2.免疫染色
① 直接法：用酶标抗体直接与标本中的相应抗原反应结合， 尔后进行酶与底物反应，终产物沉淀在抗原抗体反应部位。
② 间接法：依次使用两种不同抗体，先使用未标记的特异性 抗体即第一抗体，后者与标本中的抗原反应。然后使用过 氧化物酶标记第二抗体，最后酶与底物反应，生产沉淀。
4℃18～24h。
的前提下可在包埋切片后做标记染色。
三、免疫染色
包埋前染色：是指在未经包埋的预切厚片上先进行免疫染色，然后 再进行脱水包埋超薄切片。 优点：（1）切片染色前未经四氧化锇固定、脱水、包埋等处理， 对抗原性破坏较小。（2）可在定位后再进行超薄切片，提高阳性检 出率.（3）免疫染色后，用四氧化锇后固定，有利于膜型结构的保 存。
生物活性不发生明显的变化。 ②金颗粒具有很高的电子密度，在电镜下金颗粒
清晰可辨，易精确定位。
③不仅可以用于透射电镜的超薄切片观察，也可以用于 扫描电镜对细胞表面的抗原、受体进行标记定位观察。
④胶体金标记物易于制备，而且可以根据需要制备不同 大小的胶体金，因此可以进行免疫电镜的双重标记。
⑤根据抗原抗体反应部分结合金颗粒数量的多少，可进 行粗略的免疫细胞化学定量研究。
用以标记抗体的酶要具备以下条件： 1.与抗体（或抗原）结合后，仍能保持酶和抗体（或抗原）的生物活性。 2.酶的纯度高、特异性强、稳定、可溶性好、敏感、廉价。 3.在体液或组织中不存在该酶的底物。 酶标技术中最常用的标记酶是辣根过氧化物酶（HRP）
电镜免疫细胞化学技术的标本处理原则
1、取材与固定 取材原则与常规电镜取材相同，力求保持组织新鲜，标本固定要求
鞣酸-柠檬酸钠还原法制备不同大小胶体金颗粒的配方
1%柠檬酸三钠 1%鞣酸 0.025 mol/L K2CO3 径
（ml)
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（nm）
去离子双蒸水 胶体金颗粒直 （ml）
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19.98 19.90 15.00 14.00
优点： ①胶体金能稳定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的
是既要保持组织成分的抗原性，又要保存细胞的超微结构。低浓度的 甲醛短时固定队抗原性保存好，但是超微结构保存又受影响。
（1）2%多聚甲醛液 （2）2%多聚甲醛-0.01%～0.05%戊二醛
（3）4%多聚甲醛-0.5%苦味酸-0.5%戊二醛
2．通过冰冻切片或震动切片获得厚切片。 冰冻切片 8µm ，震动切片20～80µm。
（2）电镜包埋前免疫金染色
① 新鲜组织经适当固定（0.5%戊二醛-2%多聚甲 醛固定0.5～1h），制成厚切片。
② 0.05mol/L TBS pH7.4漂洗3次，每次 15min。
③ 0.1mol/L甘氨酸漂洗10min，灭活自由醛基。 ④ TBS漂洗，5min×3次， ⑤ 1%牛血清孵育组织块30min。
结果判定 在已知阳性、阴性样品成立的前提下，出现高
电子密度的颗粒，即指示抗原抗体的存在。
（二）胶体金免疫电镜技术
利用胶体金在碱性环境中带负电荷的性质，使其 与抗体相互吸引从而将抗体标记。再以金标记的抗体 与待检抗原相互结合，由于金颗粒的电子密度高，电 镜观察到金颗粒的位置，即抗原所在。
2、胶体金的特性 ①颜色：胶体金的颜色与金粒子的直径有关，5-60nm时 为红色，95nm是为蓝色，用于免疫细胞化学的胶体金 呈红葡萄酒色。 ②影响胶体金稳定的因素： a.电解质：少量有促进稳定的作用，过量则破坏。 b.胶体金的浓度：浓度越高容易导致胶体金凝集。 c.温度：长时间加热可使稳定性有所下降。
（1）胶体金的制备
①柠檬酸三钠还原法（15nm） ②鞣酸-柠檬酸钠还原法（6nm）
檬酸三钠的用量与胶体金直径的关系
0.01%氯化金 1%柠檬酸三钠
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免疫电镜技术
免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的 产物，根据抗原抗体的高度特异性结合原理，用高电 子密度的标记物（如：金、铁蛋白等）在超微结构水 平上检测某些抗原性物质的定位、定性、半定量的一 种方法。
目前免疫电镜技术主要包括酶免疫电镜技术，免疫铁蛋白技术和免疫胶 体金技术，此外还有抗体杂交技术、凝集素电镜标记技术和铁蛋白-抗 铁蛋白电镜复合物技术。
免疫电镜的细胞化学技术应用
电镜细胞化学技术
电镜细胞化学技术是电镜技术与细胞化学技术相结合 产生的一门新技术，也称超微结构细胞化学。
目的：将化学研究与形态观察相统一，要求在细胞 超微结构水平上研究细胞内各种生化物质（蛋白质、核 酸、脂肪、碳水化合物等）的定位情况以及这些生化物 质在细胞内的动态变化，用以阐明细胞、细胞器结构与 功能的相互关系。
60min，常规脱水，包埋，切片染色后电镜观察。
（3）电镜包埋后免疫金染色法
①超薄切片50～70nm，置于镍网或金网中。 ②1% H2O2蚀刻，使试剂能穿透标本。
EPON包埋的组织蚀刻时间约10min，而 LRWhite、LR Gold包埋的组织蚀刻时间则 常小于5min.
③ 双蒸水漂洗3次，每次10min。 ④ 1%牛血清孵育切片15min。 ⑤ 载网不冲洗，摔干后直接移至第一抗滴上，在室温孵育1～2h或
⑥ 第一抗体4℃孵育过夜后室温继续放置2h。 ⑦ TBS漂洗，5min×3次， ⑧ 室温下适当稀释度的胶体金标记探针（二抗胶体金探
针或蛋白A胶体金探针等）孵育60min。 ⑨ TBS漂洗，3min×3次，后再用双蒸水漂洗切片。 ⑩ 2%戊二醛-2多聚甲醛固定1h，1%锇酸固定30～
包埋后染色：是指在超薄切片上进行免疫染色。 优点：抗原暴露在超薄切片上，不存在免疫试剂分子穿透障碍，不
需要穿透剂。
2.免疫染色
① 直接法：用酶标抗体直接与标本中的相应抗原反应结合， 尔后进行酶与底物反应，终产物沉淀在抗原抗体反应部位。
② 间接法：依次使用两种不同抗体，先使用未标记的特异性 抗体即第一抗体，后者与标本中的抗原反应。然后使用过 氧化物酶标记第二抗体，最后酶与底物反应，生产沉淀。
4℃18～24h。