扫描电镜及其制样技术
扫描电镜制样
扫描电子显微镜(SEM)常规样品制备技术SEM常规制样方法（一）——试样的取材、固定、脱水和置换一、实验目的掌握扫描电镜制样过程：从取材、固定、脱水、置换、干燥、喷涂这一过程中样品怎样保持生活状态，从而得出接近生活状态的样品。
二、实验原理不论动物或植物组织，要求取材时操作必须快速，组织表面要清洁，必要时需超声波清洗，原理同TEM取材，但需强调的是SEM观察表面结构，所以应注意表面结构的清洁、完整和电镜下反应真实的形貌。
取材时动作要快、轻、准、大小在1mm-1cm之间，所用的器械要锋利、洁静，避免任何牵拉和挤揉样品表面的损伤，常用的固定剂有2-4%戊二醛和1%锇酸。
三、实验器材样品（动物或植物）、双面刀片、培养皿、l.5ml离心管、牙签、2-4%戊二醛、1%锇酸、0. 1M PBS缓冲液，乙醇、乙酸异戊酯。
四、实验步骤1、取材要求动作轻、迅速、准确，为了保持生活状态，应在固定前清洗掉表面杂质，即，迅速将标本放在PBS缓冲液中冲洗，也可超声波器中超10s-30s，使样品所带的污物除去（如：气管内壁上的粘液、植物叶上的灰尘等）。
2、固定（前固定）经过清洗的样品迅速投入2-4%戊二醛囤定液中，间歇振荡且室温固定约2-4小时即可。
样品固定的目的：使样品细胞的微细结构完整真实地保存下来。
如果样品没有很好地固定，那么样品在脱水时可能变形，破坏了样品的生活状态，也就是说，固定不好的材料，电镜下不能反映真实结构，所以这一步很重要。
3、冲洗0. 1M PH7.2 PBS缓冲液洗：30分钟中间换3-4次，因戊二醛与锇酸反应生成细微的沉淀，所以在后固定之前，用0. IM PBS缓冲液洗去多余的戊二醛之后，样品才可能进入锇酸固定液。
4、后固定：1%四氧化锇后固定1-2小时。
5、冲洗：重蒸水冲洗30分钟中间换3-4次，因四氧化锇与乙醇反应，所以在脱水前充分洗去残留的四氧化锇，样品才能进行脱水。
6、脱水脱水剂为乙醇，室温进行为了减少人工损伤，需要梯度脱水：30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%，每级15-20分钟，如果是动物样品，脱水时间可5-10分钟，脱水要充分完全地进行直到除尽样品中的水份为止，最后100%乙醇要重复2-3次，保证样品绝对无水。
扫描电镜SEM制样步骤
扫描电镜S E M制样步骤-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN扫描电镜观察制样步骤固定：1、用灭菌镊子挑出少量的的样品（碳粒/碳毡）,放入 5ml 的离心管中,2、加入2.5%戊二醛, 加量为淹没碳粒/碳毡样品为宜,室温固定1小时3、置于 4℃冰箱中固定12小时。
冲洗：用 0.2mol pH 7.4的磷酸缓冲溶液冲洗 3 次，每次 10 分钟。
每次冲洗时先用注射器缓慢吸走上一步骤的冲洗液。
Or 离心脱水：分别用浓度为30%， 50%，75%，90%, 95%, 100% v/v 的乙醇进行脱水，每次10分钟，干燥：将样品放在离心管里，置入干燥器中干燥 12 小时。
粘样：用双面胶将样品观察面向上粘贴在扫描电镜铜板上预处理好的样品放入干净离心管中待检。
SEM上机测样--测定条件参数设置分子克隆实验指南第三版，1568页：25度下0.1mol/L磷酸钾缓冲液的配制；先配0.1mol/L K2HPO4，0.1mol/L KH2PO4配PH7.4，100ml磷酸钾缓冲液需：0.1mol/L K2HPO4，80.2ml0.1mol/L KH2PO4，19.8ml混合即是，不用酸碱调PH。
参考文献：DOI:?10.1021/es902165yMicrobial fuel cell?based on Klebsiella pneumoniae biofilmSelecting?anode-respiring bacteria based on?anode?potential: phylogenetic, electrochemical, and?microscopic?characterizationA severe reduction in the cytochrome C content of?Geobacter sulfurreducens?eliminates its capacity for extracellular electron transfer2。
场发射扫描电镜的样品制备和操作步骤
场发射扫描电镜的样品制备和操作步骤场发射扫描电镜（Field Emission Scanning Electron Microscopy）是一种高分辨率的电子显微镜技术，可用于观察和分析各种材料的表面形貌和微观结构。
为了获得清晰的显微图像，样品制备和操作步骤非常重要。
一、样品制备1. 样品的选择：场发射扫描电镜适用于不同种类的材料，如金属、陶瓷、聚合物等。
选择合适的样品很关键，它应具备研究对象的特性，并且能够承受电子束的辐照。
2. 样品的固定：为了保持样品的形状和结构不变，通常需要将其进行固定。
对于固态材料，可以使用金属夹片或导电胶进行固定。
对于液态材料，可以将其冷冻或凝胶化，以保持其形状。
3. 样品的切割和打磨：有时候，需要将样品切割成适当的尺寸，以便放入样品架中。
这可以通过使用金刚石切割机、电解或机械研磨仪器等设备来完成。
4. 样品的真空处理：在将样品放入场发射扫描电镜前，通常需要将其进行真空处理。
这可以通过将样品放入真空干燥器中、在低压下进行加热或冷冻干燥来完成。
真空处理有助于去除空气中的水分和气体，以减小背景干扰。
二、操作步骤1. 打开电镜系统：在开始操作前，需要将场发射扫描电镜系统打开并进行预热。
预热时间通常需要几十分钟，以保证系统内部达到稳定的工作温度。
2. 放置样品：将样品放置在样品架上，并确保其良好接触。
对于粉末状样品，可以使用导电胶将其固定在样品支架上。
对于固态样品，可以使用金属夹片固定在样品架上。
3. 调整显微镜参数：通过调整电子束能量、聚焦、工作距离等参数，来优化扫描电子显微镜的成像质量。
这些参数的选择取决于样品的特性和所需的分辨率。
4. 开始观察：一切准备就绪后，可以开始观察样品。
通过控制电子束的扫描和探测系统，可以获得样品的表面形貌和微观结构的信息。
在观察过程中，要注意避免样品表面的污染和损坏。
5. 数据分析：场发射扫描电镜获得的图像可以进一步进行数据分析。
可以通过对图像进行增强、测量尺寸和形状、进行结构分析等手段，来得到更详细的样品信息。
扫描电镜样品制备
扫描电镜样品制备扫描电子显微镜生物样品制备技术无论是透射电镜或是扫描电镜，样品均处于电镜镜筒的真空之中。
而大多数的生物样品都是柔软而且含大量水分的。
因此，也和透射电镜的样品一样，在进行扫描电镜观察前，必须对生物样品作相应的处理。
扫描电镜的功能很多，不同的功能对样品的要求不同。
例如二次电子像与背散射电子像和吸收电子像对样品的要求基本相同，而与X射线微区分析对样品的要求相差较远。
我们首先介绍二次电子像的生物样品制备技术。
此外，由于样品的性质不同，其处理方法和程序也有不同。
主要分两大类，一类为含水量少的硬组织，如毛发、牙齿及植物的花粉、孢子、种子等。
此类样品一般含硅质、钙质，角质，砝琅质和纤维素等成份，所以通常只经过表面清洁、装台(粘胶)、导电处理等简单过程即可进行观察。
如要观察其断面或内部结构时，经断裂、解剖或酶消化、蚀刻等再装台、镀膜处理，即可进行观察拍照。
另-类为含水分较多的软组织，如大多数的动植物器官、组织及细菌等均属此类。
对于此类样品，在金属镀膜前，一般都需经过固定、脱水、干燥等处理，如不经处理或处理不当，就会造成样品损伤和变形，出现各种假像，因此对每一处理步骤都应给予重视。
但是，不管是那一类样品的制备，都应达到以下要求：∙尽可能保持样品活体时的形貌和结构，以便如实地反映样品本来面目。
∙在样品的干燥过程尽可能减少样品变形。
∙样品表面应有良好导电性能和二次电子发射率，以防止和减少样品的荷电效应。
样品的前期处理扫描电镜样品的前期处理主要包括表面清洁、固定、漂洗和脱水等过程。
而每一过程的处理方法基本上都是沿用透射电镜样品的处理方法的，所以，这里不一一再作详述。
但是，由于两种电镜观察的要求不同，因此，在处理中也有不同之处：1. 透射电镜主要研究样品的内部结构要求内部结构保存好，因而样品宜尽可能小使固定液能迅时渗入固定。
扫描电镜观察表面形貌，而且为了操作方便选取较大样品。
一般在8～10mm2左右，高度可达5mm。
11.第六章 扫描电镜样品制备技术
（2）、冷冻干燥法：本方法是将新鲜的样品或经固 定、脱水的样品迅速冷冻后，放入真空环境中，使 玻璃态的冰直接升华跑掉，最终样品干燥。在样品 的干燥过程中不存在液体的挥发，也就消除了液体 表面张力的作用了，从理论上讲可以最大程度的保 存样品的原始形貌。但是本法的干燥速度太慢，有 人做过试验一块0.5平方毫米生物样品，在－80度中 干燥需要24小时。，如果样品块再大一些干燥需要 的时间会更长。所以本法在扫描样品制备时也不常 用。 （3）、莰烯低真空干燥法：莰烯是一种具有樟脑味， 无色透明的结晶。能溶于醚、环己烷、氯仿和丙酮 中，它在室温下为固态，遇空气很易升华，升华的 速度与温度成正比。
D.样品筐的底部和顶部要盖一层滤纸，防止样品 的污染。 E.严格控制操作温度和压力，严守操作规程。 F.保证所用二氧化碳的纯度，不纯会使干燥失败。
5、粘托
样品干燥后，需要用胶粘物质将干燥的样品粘 到样品托上。 1）、粘托时所选用的胶粘物质应具备以下条件： （1）、有一定的粘度，在室温下易干燥。 （2）、具有较低的电阻率，导电性能好，颗粒细。 （3）、干燥后收缩率小，胶膜平滑。 （4）、化学性质稳定，受电子束轰击不分解。
1）、取材的方法
动物和植物组织的取材：方法与超薄切片的取材 基本相同，只是因为扫描电镜主要是观察组织的游离 表面形态结构，因此在取材时一定要保护好所需要的 游离表面的部位，不能造成任何损伤；另外所取样品 块可稍大一些，一般观察面大小可在长X宽大约为 3X5毫米（可根据样品的性质变化取材的大小）。 离体培养的细胞取材：可在接种时把处理好的盖 玻片放在培养瓶内，让细胞长在盖片上，把带有细胞 的盖片直接进行制样处理。 细菌的取材：平板和斜面培养的，可用牙签取菌 落涂到干净的盖片上，进行制样。 悬液培养的细胞或细菌要离心收集细胞或细菌， 然后再进行制样。
扫描电子显微镜对样品的要求及样品的制备
扫描电子显微镜对样品的要求及样品的制备扫描电子显微镜是一种大型的分析仪器,主要功能是用于固态物质的形貌显微分析和对常规成分的微区分析,广泛应用于化工、材料、医药、生物、矿产、司法等领域.由于其价格昂贵及特殊的工作原理,它对样品制备有着较高的要求,样品的制备好坏,直接影响着样品分析是否成功,为此,本文着重介绍一下扫描电子显微镜应用中有关样品制备的相关知识和技术.1 扫描电子显微镜对样品的要求(1)样品必须是无毒、无放射性的物质,以保证工作人员的人身安全.(2)样品可以是块状、片状、纤维状;也可以是颗粒或粉末状,无论是什么样的样品都不能是有机挥发物和含有水分.如果将含有水分的样品放在镜筒内能产生三种严重不良后果:一是当真空达不到要求强行通高压时,其产生的水蒸汽遭遇高能电子流产生电离而放电引起束流大幅度波动,使所成的像模糊,或根本不能成像;二是造成镜筒污染;三是损坏灯丝,当高能电压通过灯丝时,温度高达2000Ο,碰到水蒸汽而氧化变质或熔断,因此,应先烘干样品中的水分.(3)无论是块状样品,还是粉末颗粒状样品,其化学、物理性质要稳定,在高真空中的电子束照射下,都要能保持成分稳定和形态不变.(4)表面受到污染的样品,要在不破坏样品表面结构的前提下,进行适当清洗、烘干.(5)无论是样品的表面,还是样品新断开的断口或断面,一般不需要进行处理,以保持其原始的结构状态.(6)对磁性样品要预先去磁,以免观察时电子束受到磁场的影响.(7)粉末样品要适量,不易过多;块状样品大小要适合仪器专用样品底座的尺寸,不能过大.一般小的样品座Φ3～5mm,大的样品座为Φ30～50mm,以分别用来放置不同大小的样品,样品的高度一般限制在5～10mm左右.2 样品的制备技术2.1 块状样品的制备对于块状导电样品,基本上不需要进行什么制备,只要其大小适合电镜样品底座尺寸大小,即可直接用导电胶带把样品黏结在样品底座上,放到扫描电镜中观察,为防止假象的存在,在放试样前应先将试样用丙酮或酒精等进行清洗,必要时用超声波清洗器进行清洗.对于块状的非导电样品或导电性较差的样品,要先进行镀膜处理,否则,样品的表面会在高强度电子束作用下产生电荷堆积,影响入射电子束斑和样品发射的二次电子运动轨迹,使图像质量下降,因此这类样品要在观察前进行喷镀导电层的处理,在材料表面形成一层导电膜,避免样品表面的电荷积累,提高图象质量,并可防止样品的热损伤。
扫描电镜SEM和透射电镜TEM样品制备技术
凹槽 21
PP2000T冷冻样品制备室
各种样品台
样品支架安装在转移装置上 （旁边是插入液氮装置，背 景是控制器）
样品插入冷冻剂
2
S E M 制 样 技 术
样品 取样 不含水或 含水少 样品种类 含水 多 清洗 导电 不导电 固定 脱水干燥
镀金 SEM观察并照相
3
SEM的制样准则 • 尽可能保持样品本来的形貌和结构 • 在样品的干燥过程尽可能减少样品变形 • 样品表面应有良好导电性能和二次电子 发射率
4
微 胶 囊 化 产 品 的 超 微 结 构
表面结构的观察：
在SEM样品台上贴上双面胶，将少许微胶囊化产品的粉末撒于双面胶 上，吹去多余的粉末，然后喷金，采用SEM进行观察。加速电压为 15kV。
内部结构的观察：
撒少许微胶囊化DHA和EPA产品在贴了双面胶的样品台上，稍稍压 实，使一部分粉末陷入双面胶的胶基中。用刀片刮去表面的粉末，然后轻 刮双面胶的表面，立即喷金，然后用SEM进行观察，加速电压为15kV。
9
• 临界点干燥（Critical-point drying, CPD）
31.3℃ 72.8 atm
在31.3℃以下， CO2以液态形式存在，在临界温度31.3℃以 上，CO2以气态形式存在，在任何压力下都不能使CO2液化。 在临界温度下，使CO2气体液化所需的最小压力Pc为临界压 力。
10
低温（5～10℃）时，将样 品加到液体CO2中，液体CO2 取代有机溶剂，当温度升高到 31.3℃，液体CO2转化成CO2 气体，从加压池中把CO2气体 放出，由于在临界态气液不 分，当液体CO2转化成CO2气 体时，样品干燥未经过两相界 SPI # 13200-AB临界点干燥机 面。
扫描电子显微镜的样品制备一些技术
2.样品室内压力达不到要求： （1）注入液态二氧化碳量过少：可能会使样品位于二氧 化碳的气液面交界处，样品受到液体二氧化碳表面张力的 作用，尽管比水的表面张力小的多，但仍会影响样品的精 细结构。 （2）样品室密闭不良：这可能是因为垫圈老化，有裂纹， 或垫圈下有异物等。 3.注入液体二氧化碳困难：主要因为样品室的温度高，没有 事先降温。夏季室温高于30度时更易造成注入困难。降温 的办法有两种：一是用少许液体二氧化碳充盈2-3次，再 放掉气体的二氧化碳；二是用控温钮调制低于室温10度。
脱水处理：对保证金属镀膜装置和电镜的镜筒真空度和防止 样品在高真空状态下的龟裂和变形等有重要的作用。采用不 同浓度的乙醇或丙酮梯度脱水逐步的除去样品中的水分。
6.2.2 样品的干燥：
1. 自然干燥法：把样品暴露在空气中直接干燥，只适用于表 面比较坚硬或含水分较少的生物样品。如：昆虫、骨骼、牙 齿、毛发、种子、果壳、花粉、植物标本，以及微小材料如 细菌等。具体做法是：先将样品固定，并系列脱水到100％， 在大气中让脱水剂自然挥发即可，但注意环境要干燥。因为 脱水剂的表面张力系数比水小所以样品在脱水剂中不会过多 变形而影响其结构。
6.1.4常规生物样品制备技术
制备过程如下： ①取材 根据需要，切取适当大小的样品。专门的SEM备有 灵活可动，范围较大的样品台，样品可大些。装在透射电 镜上的扫描附件，活动范围较小，样品直径应在3～4mm左 右。 ②漂洗 用缓冲液把组织表面洗净，否则会影响正常形态， 但以快速和轻巧为宜，尽量保护器官或组织的表面结构， 使其不致因不慎的操作造成人为损伤。 ③固定 用2.5～5％戊二醛/缓冲液在室温或4摄氏度下前固定。 具体时间可根据样品的需要而定，一般单细胞10-30分钟， 较大的或较硬的样品可达1-2h或更长时间。 ④漂洗 用缓冲液洗3次，洗去未结合的戊二醛。 ⑤重固定 1％锇酸/缓冲液4摄氏度下后固定10～60min。有 时为了提高样品的反差和固定效果，可以综合固定液，如 随意选用戊二醛、多聚甲醛、锇酸等按照不同的比例混合 使用。
扫描电镜的样品制备
扫描电镜的样品制备
扫描电镜（Scanning Electron Microscope，SEM）是一种高分辨率的显微镜，对于复杂的样品结构、微观形态和表面形貌的分析非常有用。
然而，要获得良好的扫描电镜显像效果，样品的制备至关重要。
下面将介绍几种常用的扫描电镜样品制备技术。
1. 金属喷涂法
金属喷涂法是扫描电镜样品制备的经典方法。
该方法使用金属喷涂仪将金属颗粒喷在样品表面，使其形成一层均匀、导电性良好的金属膜，以便在扫描电镜中观察样品的表面结构。
该方法适用于非导电样品，如细胞、生物组织、聚合物等。
2. 离子切割法
离子切割法利用离子切割机将样品切割成纤细的薄片，以便于在扫描电镜中观察。
这种方法适用于非常薄的样品，如材料薄片、芯片等。
它可以提供非常高分辨率的图像，并且可以通过纵向切割获得样品的三维结构。
3. 冷冻切片法
冷冻切片法是一种用于生物样品的扫描电镜制备方法。
该方法使用超低温技术将样品冻结，并使用超薄刀片切割成极薄的切片，通常为50~200纳米。
这可以保留样品的水感性和原始形态，并使其在扫描电镜中观察更加清晰。
4. 化学蚀刻法
化学蚀刻法是用于金属样品的扫描电镜制备方法。
该方法使用酸或碱对样品表面进行蚀刻，以去除不需要观察的材料，形成清晰的样品结构。
该方法适用于金属薄膜、晶体和合金等金属材料。
总之，良好的扫描电镜样品制备是获得高品质扫描电镜图像的关键。
每种样品都有其独特的制备方法，为了获得最好的结果，在选择合适的制备方法时需要谨慎选择。
扫描电镜样品制备及图像质量影响因素分析①
扫描电镜样品制备及图像质量影响因素分析①扫描电镜是一种非常重要的分析工具，它可以用来观察微观颗粒和组织结构。
在使用扫描电镜进行观察时，样品的制备和图像的质量是非常重要的因素。
本文将介绍扫描电镜样品制备的方法，以及影响图像质量的因素，帮助读者更好地理解和掌握扫描电镜的应用。
一、扫描电镜样品制备的方法扫描电镜样品制备是观察样品的第一步，样品的制备质量直接影响到后续观察结果的准确性和可靠性。
目前扫描电镜样品制备的方法主要有化学固定法、膜支撑法以及冷冻切片法等。
1. 化学固定法化学固定法是通过用冰醋酸、乙醛等物质将样品固定在样品架上，使得样品的结构保持原状。
这种方法适用于大多数的样品，而且固定后的样品可以保存很长时间，方便后续的操作。
但是在使用化学固定法时需要注意，要避免过量的固定剂，以免对样品的形态产生破坏。
2. 膜支撑法膜支撑法是在样品的表面涂覆一层聚合物薄膜，使得样品表面平整并且增加样品的机械强度。
这种方法适用于软脆的样品，可以有效避免在样品处理过程中出现的形变和损坏。
但是在使用膜支撑法时需要注意，选择合适的薄膜材料和合适的涂覆方法，以免对样品造成干扰。
3. 冷冻切片法冷冻切片法是将样品冷冻并且切成很薄的切片，然后在扫描电镜中直接观察。
这种方法适用于生物样品或者含水样品的制备，可以有效保持样品的生物活性和结构完整性。
但是在使用冷冻切片法时需要注意，样品的冷冻和切片过程中必须迅速，并且要避免在样品表面生成冰晶，以免影响观察结果。
二、图像质量影响因素分析扫描电镜的图像质量是反映样品观察效果的重要指标，图像质量的好坏直接影响到对样品结构和特征的分析。
在扫描电镜图像质量的影响因素中，主要包括电镜参数、样品处理以及图像处理等几个方面。
1. 电镜参数电镜参数是影响扫描电镜图像质量的重要因素，主要包括电压、放大倍数和孔径等。
较高的电压可以提高电子束的穿透能力，对于较厚的样品可以选择较高的电压，而对于较薄的样品可以选择较低的电压。
扫描电镜样品制备
离子溅射镀膜法:
在低真空中进行辉光放电时，由于离子冲击，阴极金 属物质有飞溅现象称为溅射。利用离子溅射仪对样品进行 金属镀膜的方法，称为溅射镀膜法。溅射镀膜法的装置很 简单，主要由真空部分(真空泵)和溅射部分(真空罩)组成， 在真空罩内装有阴极和阳极，阴极对着阳极的一面装有用 于溅射用的金属靶(黄金靶、铂靶、白金靶或钯靶等)，样 品放在阳极的样品座上面。当真空罩内的真空度抽到10～ 1Pa时，在阴极与阳极之间加上1000～3000V的直流电压， 两极之间产生弧光放电的电场。在电场的作用下，罩内残 余的气体分子被电离为正离子和电子，正离子被阴极吸引 轰击金属靶，激发出金属颗粒和电子，并被阳极吸引附着 在样品表面而形成金属导电膜。
实验十一 扫描电镜样品制备
选作
扫描电镜即扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope，简称SEM）。主要用于观察样品的表面形貌 、割裂面结构、管腔内表面的结构等。
一、扫描电镜工作原理：
主要是利用样品表面产生的二次电子成像来对物质 的表面结构进行研究，是探索微观世界的有力工具。
5. 置换乙醇
吸出乙醇，加入醋酸异戊酯与乙醇1：1的混合 液，浸泡10-20分钟并适当摇动，再吸弃混合液， 加入纯醋酸异戊酯浸泡10-20分钟并适当摇动。
6. 样品的干燥
常规临界点干燥法。
临界点干燥法
• 临界点干燥法是一种消除了物相界面(液相／气相)，也就是 消除了表面张力来源的干燥方法。这种方法由于没有表面 张力的影响，所以样品不易收缩和损伤。具体处理步骤如 下：
• 装样： 将样品从醋酸异戊酯中挑入(或倒入)样品笼中，用 滤纸吸去样品笼外围的醋酸异戊酯，然后连笼移入仪器的 样品杯(高压容器)内，盖上盖并拧紧以防漏气。(注：在装 样前，应先打开仪器电源，将温度调节设定在0℃处预冷 10～15min，以保证液态二氧化碳有足够量进入样品杯中)。
扫描电镜测试生物样品制备技术.
扫描电镜测试生物样品制备技术大多数生物样品都含有水分,而且比较柔软,因此,在进行扫描电镜观察前,要对样品作相应的处理。
扫描电镜样品制备的主要要求是:尽可能使样品的表面结构保存好,没有变形和污染,样品干燥并且有良好导电性能。
一.样品的初步处理(一取材样品面积可为8mm×8mm,厚度可为5mm。
对于易卷曲的样品如血管、胃肠道粘膜等,可固定在滤纸或卡片纸上,以充分暴露待观察的组织表面。
(二样品的清洗用扫描电镜观察的部位常常是样品的表面,即组织的游离面。
由于样品取自活体组织,其表面常有血液、组织液或粘液附着,这会遮盖样品的表面结构,影响观察。
因此,在样品固定之前,要将这些附着物清洗干净。
清洗的方法有以下几种:1.用等渗的生理盐水或缓冲液清洗;2.用5%的苏打水清洗;3.用超声震荡或酶消化的方法进行处理。
例如清洗肠粘膜表面的粘液,可用下面的方法:清洗液配方:透明质酸酶300 (gα—糜蛋白酶 10 mg生理盐水 100 ml清洗液的pH为5.5~6。
清洗的方法是将样品浸泡在配好的清洗液中,边浸泡边震荡30分钟,最后用双蒸水洗3次。
无论用哪种清洗方法,注意在清洗时不要损伤样品。
(三固定固定样品的常用试剂为戊二醛及锇酸双固定。
由于样品体积较大,固定时间应适当延长。
也可用快速冷冻固定。
(四脱水样品经漂洗后用逐级增高浓度的酒精或丙酮脱水,然后进入中间液,一般用醋酸异戊酯作中间液。
二.样品的干燥扫描电镜观察样品要求在高真空中进行。
无论是水或脱水溶液,在高真空中都会产生剧烈地汽化,不仅影响真空度、污染样品,还会破坏样品的微细结构。
因此,样品在用电镜观察之前必须进行干燥。
干燥的方法有以下几种:(一空气干燥法空气干燥法又称自然干燥法,就是将经过脱水的样品,让其暴露在空气中使脱水剂逐渐挥发干燥。
这种方法的最大优点是简便易行和节省时间;它的主要缺点是在干燥过程中,组织会由于脱水剂挥发时表面张力的作用而产生收缩变形。
实验三扫描电子显微镜样品制备及观察
实验三扫描电子显微镜样品制备及观察实验三是关于扫描电子显微镜样品制备及观察的实验。
以下是一个超过1200字的实验报告范例：一、实验目的1.学习扫描电子显微镜（SEM）样品制备的方法。
2.理解SEM观察的原理并学会操作设备。
3.通过SEM观察不同样品的形貌结构，并分析其特点和应用。
二、实验原理扫描电子显微镜是一种通过电子束扫描样品来获得高分辨率图像的仪器。
其工作原理是将样品置于真空室中，利用极细电子束扫描样品表面，通过检测不同位置形成的信号来重建出样品的图像。
具体步骤如下：1.样品制备：常见的SEM样品制备方法有两种，即传统方法和无需真空方法。
传统方法包括金属涂覆、阴影蒸发、离子刻蚀等，而无需真空方法则是通过场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）来实现。
根据实验需要和样品性质，选择合适的方法进行样品制备。
2.SEM操作：首先，打开SEM仪器，并进行必要的预热和真空抽气等准备工作。
接下来，将制备好的样品放置在SEM样品台上，调整样品位置和角度。
然后，通过SEM软件来控制电子束的扫描和信号的收集。
最后，进行图像的调整和保存。
3.SEM观察与分析：根据实验目的和要求，选择合适的放大倍数和扫描速度来观察样品的图像。
观察过程中，可以通过调整参数和改变扫描区域来优化图像质量。
观察完毕后，可以通过图像分析软件来进行样品表面形貌特征的定量分析。
三、实验步骤1.样品制备：根据实验要求，选择适当的样品制备方法进行。
在本实验中，我们选择了金属涂覆方法。
首先，将待观察的样品表面清洗干净，以去除附着物。
然后，将样品放置在真空腔内，并进行表面蒸发金属涂覆。
2.SEM操作：打开SEM仪器，并进行必要的预热和真空抽气等准备工作。
等待SEM仪器达到稳定状态后，将制备好的金属涂覆样品放置到SEM样品台上，调整样品的位置和角度。
接下来，通过SEM软件来控制电子束的扫描和信号的收集。
调整参数直至获得清晰的样品图像。
3.SEM观察与分析：根据实验要求，选择适当的放大倍数和扫描速度来获得样品的图像。
扫描电镜的试样制备方法
zhengmin li
18
Polaron SC7620 “Mini” Sputter Coater
Options: CA0762F carbon fibre evaporation attachment
zhengmin li
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Polaron SC7620 “Mini” Sputter Coater Options: CA7615 power supply - to run CA0762F carbon fibre carbon evaporation attachment
zhengmin li
24
Polaron SC7640 Auto / Manual High Resolution Sputter Coater Options: FT7607 FTM stage Quartz crystal
Note: centrally located crystal ensures representative reading
zhengmin li 22
Polaron SC7640 Auto / Manual High Resolution Sputter Coater Options: Water cooled stage
Not generally needed as the SC7640 head produces little or no heat.
zhengmin li
20
Polaron SC7640 Auto / Manual High Resolution Sputter Coater Standard universal stage - height adjustment
Standard stage and FT7607 FTM stage are height adjustable .
扫描电镜的样品制备
3。
1 试样制备技术试样制备技术在电子显微术中占有重要的地位，它直接关系到电子显微图像的观察效果和对图像的正确解释。
如果制备不出适合电镜特定观察条件的试样，即使仪器性能再好也不会得到好的观察效果.和透射电镜相比,扫描电镜试样制备比较简单。
在保持材料原始形状情况下，直接观察和研究试样表面形貌及其它物理效应（特征），是扫描电镜的一个突出优点。
扫描电镜的有关制样技术是以透射电镜、光学显微镜及电子探针X射线显微分析制样技术为基础发展起来的，有些方面还兼具透射电镜制样技术，所用设备也基本相同。
但因扫描电镜有其本身的特点和观察条件,只简单地引用已有的制样方法是不够的.扫描电镜的特点是：①观察试样为不同大小的固体（块状、薄膜、颗粒），并可在真空中直接进行观察。
②试样应具有良好的导电性能,不导电的试样，其表面一般需要蒸涂一层金属导电膜。
③试样表面一般起伏（凹凸）较大。
④观察方式不同,制样方法有明显区别。
⑤试样制备与加速电压、电子束流、扫描速度（方式）等观察条件的选择有密切关系。
上述项目中对试样导电性要求是最重要的条件.在进行扫描电镜观察时，如试样表面不导电或导电性不好，将产生电荷积累和放电，使得入射电子束偏离正常路径，最终造成图像不清晰乃至无法观察和照相。
3。
1。
1 块状试样制备1．导电性材料导电性材料主要是指金属,一些矿物和半导体材料也具有一定的导电性。
这类材料的试样制备最为简单.只要使试样大小不得超过仪器规定（如试样直径最大为φ25mm,最厚不超过20mm等)，然后用双面胶带粘在载物盘，再用导电银浆连通试样与载物盘（以确保导电良好）,等银浆干了（一般用台灯近距离照射10分钟，如果银浆没干透的话，在蒸金抽真空时将会不断挥发出气体，使得抽真空过程变慢）之后就可放到扫描电镜中直接进行观察。
但在制备试样过程中，还应注意：①为减轻仪器污染和保持良好的真空，试样尺寸要尽可能小些。
②切取试样时，要避免因受热引起试样的塑性变形，或在观察面生成氧化层。
扫描电镜制样
扫描电镜常规制样方法方法一：植物叶片单固定扫描电镜制样方法1．取材将叶子切成5-10mm长方形6-10片。
2．固定放入2.5%戊二醛+2%多聚甲醛固定液中进行抽气（样品无气泡产生，全部沉于底部即可），固定12小时以上。
3．脱水用乙醇逐级脱水30%→50%→70%→80%→90%乙醇，每20 分钟更换一次（70%以前放置4°C冰箱内），100%乙醇每20分钟一次，共5次（70%乙醇以后放置室温脱水）。
4.替换将乙醇倒掉，换叔丁醇，每20分钟一次，共5次。
第5次浸过样品即可，放置冰箱冷冻层（-20°C左右）30分钟或过夜。
5.干燥用JFD-310冷冻干燥仪进行干燥。
6.粘台将上下表皮分别粘在具有双面胶带的样品台上。
7.镀膜用JFC-1600离子溅射镀铂金膜厚约10nm。
8.观察并拍照利用JSM-6360LV扫描电子显微镜进行观察并拍照。
注明：此方法适合植物根、茎样品方法二：植物叶片单固定扫描电镜制样方法1..取材将叶子切成5-10mm长方形6-10片。
2预固定放入2.5%戊二醛+2%多聚甲醛固定液中进行抽气（样品无气泡产生，全部沉于底部即可），固定12小时以上。
3．冲洗0.1M磷酸缓冲液进行冲洗3次，每40分钟一次。
4．双固定用1%四氧化锇（OsO4）进行固定2.5-3小时。
5．冲冼0.1M磷酸缓冲液进行冲洗3次，每5分钟一次。
6．脱水7.用乙醇逐级脱水30%→50%→70%→80%→90%乙醇，每20 分钟更换一次（70%以前放置4°C冰箱内），100%乙醇每20分钟一次，共5次（70%乙醇以后放置室温脱水）。
8.替换将乙醇倒掉，换叔丁醇，每20分钟一次，共5次。
第5次浸过样品即可，放置冰箱冷冻层（-20°C左右）30分钟或过夜。
9.干燥用JFD-310冷冻干燥仪进行干燥。
9．粘台将上下表皮分别粘在具有双面胶带的样品台上。
10.镀膜用JFC-1600离子溅射镀铂金膜厚约10nm。
扫描电子显微镜对样品的要求及样品的制备
扫描电子显微镜对样品的要求及样品的制备扫描电子显微镜是一种大型的分析仪器,主要功能是用于固态物质的形貌显微分析和对常规成分的微区分析,广泛应用于化工、材料、医药、生物、矿产、司法等领域.由于其价格昂贵及特殊的工作原理,它对样品制备有着较高的要求,样品的制备好坏,直接影响着样品分析是否成功,为此,本文着重介绍一下扫描电子显微镜应用中有关样品制备的相关知识和技术.1 扫描电子显微镜对样品的要求(1)样品必须是无毒、无放射性的物质,以保证工作人员的人身安全.(2)样品可以是块状、片状、纤维状;也可以是颗粒或粉末状,无论是什么样的样品都不能是有机挥发物和含有水分.如果将含有水分的样品放在镜筒内能产生三种严重不良后果:一是当真空达不到要求强行通高压时,其产生的水蒸汽遭遇高能电子流产生电离而放电引起束流大幅度波动,使所成的像模糊,或根本不能成像;二是造成镜筒污染;三是损坏灯丝,当高能电压通过灯丝时,温度高达2000Ο,碰到水蒸汽而氧化变质或熔断,因此,应先烘干样品中的水分.(3)无论是块状样品,还是粉末颗粒状样品,其化学、物理性质要稳定,在高真空中的电子束照射下,都要能保持成分稳定和形态不变.(4)表面受到污染的样品,要在不破坏样品表面结构的前提下,进行适当清洗、烘干.(5)无论是样品的表面,还是样品新断开的断口或断面,一般不需要进行处理,以保持其原始的结构状态.(6)对磁性样品要预先去磁,以免观察时电子束受到磁场的影响.(7)粉末样品要适量,不易过多;块状样品大小要适合仪器专用样品底座的尺寸,不能过大.一般小的样品座Φ3～5mm,大的样品座为Φ30～50mm,以分别用来放置不同大小的样品,样品的高度一般限制在5～10mm左右.2 样品的制备技术2.1 块状样品的制备对于块状导电样品,基本上不需要进行什么制备,只要其大小适合电镜样品底座尺寸大小,即可直接用导电胶带把样品黏结在样品底座上,放到扫描电镜中观察,为防止假象的存在,在放试样前应先将试样用丙酮或酒精等进行清洗,必要时用超声波清洗器进行清洗.对于块状的非导电样品或导电性较差的样品,要先进行镀膜处理,否则,样品的表面会在高强度电子束作用下产生电荷堆积,影响入射电子束斑和样品发射的二次电子运动轨迹,使图像质量下降,因此这类样品要在观察前进行喷镀导电层的处理,在材料表面形成一层导电膜,避免样品表面的电荷积累,提高图象质量,并可防止样品的热损伤。
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Techniques of Scanning Electron Microscope 一、扫描电镜的基本结构与成像原理 二、扫描电镜的特点 三、扫描电镜的生物样品制备技术 （一）样品的常规制备方法 （二）特殊样品的制备方法
扫描电镜技术
扫描电镜（Scanning Electron Microscope，SEM） 是继光镜和透射电镜之后发展起来的一种 电镜，用于观察物质表面及断面的三维形 貌 结 构 和 进 行 微 区 成 分 分 析 。
样品制备简单。 可结合元素分析。
三、扫描电镜生物样品制备技术
（一）样品的常规制备方法
取材 → 清洗 → 固定 → 清洗 →脱水 →干燥 → 金属镀膜 → SEM观察
1、取样
取样部位要准确。 取样大小要适当：常为≤1cm3。 取样操作要轻巧快捷：取样要快，严防对
样品的挤压损伤，以使样品更近于活体状态。
（2）干燥的方法
4）临界点干燥法
① 临界点干燥的原理（图3-2）
图3-2 临界点干燥原理图
临界点干燥的原理之小结
临界状态的条件：密闭容器中的液体加热达到一定 的温度（临界温度）。 临界状态的特性：气、液密度相等，相界消失；液 体变成气体，液体的表面张力消失为零；无论施加 多大的压力，气体不会变成液体。 临界点干燥：利用临界状态下液体表面张力被消除 的特性，使样品中的液体气化而最后完全干燥。
图1-1 扫描电镜工作原理图
（３）电子偏转系统（扫描系统）
组成：扫描发生器、 扫描线圈。 作用：使镜筒和显 像管内的电子束分 别进行同步光栅状 扫描，最后在显像 管的荧光屏上显示 出完整图象。
图1-1 扫描电镜工作原理图
2次电子成像原理
∵ 二次电子产率主要取决于电 子束的入射角，而入射角又主 要取决于样品的倾斜程度。 ∴ 样品的倾斜角效应是影响图 象反差的主要因素。 ∴ SEM图象的反差主要是由样 品表面的凹凸状态决定的，越 是凸出的部位产生二次电子的 数量越多，图象越明亮，反之 则较暗。
图1-2 样品倾斜对二次电子产率的影响
2、影响图象形成的因素
样品的基底部应切割平整（以便于样品 粘贴），观察面应作好识别标记。
2、清洗
（1）清洗的目的： 充分暴露样品观察面的表面特征。 （2）清洗液的选择 常规洗液——生理盐水、PBS等缓冲液； 特殊洗液——低浓度的蛋白水解酶或乙醇等，用于表面覆 盖着大量蛋白或脂类黏液的样品（如胃、肠黏膜及乳腺组织 等）的初级清洗。 （3）清洗的方法 浸泡清洗。 震荡清洗：一些粘着杂质多而紧密的样品（如胃、肠黏膜 等），可利用震荡器进行震荡清洗。 离心清洗：游离细胞、微生物及其它微小生物样品的清洗。 （4）清洗的要求 样品要清洗干净：换液数次，可在解剖镜下检查，直至干净， 以充分暴露表面特征。
③ 临界点干燥器的主要结构（图3-3 ）
图3-3 HCP-2型临界点干燥器
④ 临界点干燥的操作程序
取样
固定
脱水
醋酸异戊酯
(15~30 min或过夜）
样品入室 ( 0~10℃ )
注入液体CO2
(0~10℃)
置换
气化
放气取样
( 35~40℃ ) (30 min)
(15~20℃) (35~40℃) (10~20 min) (5~10 min)
图3-4
临界点干燥过程
6、粘样（样品的粘贴）
（1）目的：将样品粘牢在样品台上。 （2）粘样材料 双面胶带：用于粘贴基底部平整或颗粒 状的样品。 导电胶：是银粉拌在低电阻树脂内制成的 糊状物，用于粘贴基底部不平 整的样品。
7、金属镀膜
在样品表面喷镀一层厚约3~30nm的金属薄膜。 （1）镀膜的目的 ① 提高样品表面的导电性。 ② 提高二次电子发射率。 ③ 减少电子束对样品的损伤。 （2）镀膜材料的选择 金、铂、金/铂合金、铂/钯合金。 （3）镀膜的方法 目前常用离子溅射法镀膜。
7、金属镀膜
1）离子溅射法
① 离子溅射仪的主要结构
② 离子溅射镀膜的原理 辉光放电 → 离子溅射 → 漫散射镀膜 ③ 镀膜厚度的控制： 溅射时间的选择
图3-6 离子溅射仪及原理图
8、电镜观察
（二）特殊样品的常规制备方法
1、游离细胞的制样方法 （1）将盖玻片洗净灭菌，样品面做标记； （2）将盖玻片垂直浸入热溶的2~5%明胶后即刻垂 直取出，用滤纸吸去边缘多余的明胶； （3）将盖玻片的样品面朝上平放在滤纸上，于 37℃干燥箱烘干后备用； （4）在盖玻片样品面上滴1~2滴细胞悬浮液，静置 20min左右，用滤纸吸去表面残存的悬浮液。 （5）用2%戊二醛固定30min，PBS清洗3次。 （6）常规方法脱水、临界点干燥、粘样和镀膜。
一、扫描电镜的基本结构 与成像原理
1、 SEM基本结构及其作用
（１）电子光学系统
电子枪：阴极、阳极、栅极。
阴极—通电加热后产生电子束。 阳极—加速电子束。 栅极—控制和会聚电子束流 。
电磁透镜： 会聚电子束，形
成直径5~10纳米的电子束（即电 子探针），照射于样品上 。
图1-1 扫描电镜工作原理图
（２）检测系统
①二次电子的来源及作用 在样品表面以下几纳米到几十纳米的区 域，被入射电子（初级电子、一次电子） 所激发出来的样品原子中的外层电子， 称谓二次电子（次级电子）。 SEM通常是由二次电子所形成的图象来 显示生物样品的表面形貌。
（２）检测系统
② 二次电子检测系统 的组成及作用 组成：检测器（二次 电子探头）、光电倍 增管、视频放大器。 作用：对二次电子进 行收集、放大和处理， 以调制显像管栅极电 压并成象。
SEM样品的常规制备方法
小
结
1、SEM样品的常规制备步骤 取材 →清洗 → 固定 → 清洗 → 脱水 → 中间液替代脱水剂 → 临界点干燥 → 粘样 → （金属）镀膜 → SEM观察
2、SEM样品制备的基本要求与原则 （1）样品观察面要处理干净，以充分暴露表 面特征； （2）保护样品观察面，以保持原状不变形； （3）样品要彻底干燥，以保护镜筒的高真空 和样品的形态结构； （4）样品要作导电处理，以减少充放电效应 和提高二次电子发射率。
② 临界干燥液的选择——置换液与中间液
置换液：在临界点干燥器内起临界干燥 作用的液体称为置换液(表2)。 某些液体的临界特性 名 称 水 乙醇 氟里昂 374 243 28.9 临界温度(℃) 38 临界压力(kg/cm2) 218.5 63 表2
液体CO2 31.5 72.8
中间液：醋酸异戊酯
图1-4
血细胞充放电效应图例
二、扫描电镜的特点
（一） 图 谱
（二）扫描电镜的特点
观察表面形貌。 图象景深大，富有立体感。 放大范围广，分辨率较高：放大倍数为数
10倍~数10万倍；分辨率取决于电子探针的直 径，一般为5~10 nm。 可观察块状样品： 0.5~10cm3。
5、干燥
（1）干燥的目的 彻底去除样品中的脱水剂，使样品干 燥，以保护镜筒高真空和样品不变形。
（2）干燥的方法
1）空气干燥法 2）真空干燥法 3）冷冻干燥法 4）临界点干燥法
（2）干燥的方法
1）空气干燥法 方法：把样品放在空气中，让其中的脱水 剂自然挥发掉，以达到干燥的目的。 特点：脱水剂存在的低表面张力，仍使许 多样品发生变形或收缩，故本法是 在缺乏其他条件下不得已采用的干 燥方法。
4、脱水
（1）脱水的目的 用低表面张力且易挥发的有机溶剂（乙 醇、丙酮等）取代组织细胞中的游离水，使 样品在后续干燥处理时的表面张力减少。
表1 几种液体的表面张力 单位：达因/cm 水
70.61 (20℃）
液 体 乙醇 丙酮 表面张力 16.49（20℃） 2 1.16（40℃）
（2）脱水的方法 PBS清洗3次，5~10min/ 次→ 乙醇梯度脱水到 纯乙醇，5~30min/级。 （3）脱水的要求 脱水要彻底； 严防发生空气干燥：在换液过程中，要始终保 持样品润湿，以免因表面张力变化而造成样品 的皱缩、塌陷或变形。
复习题
1、扫描电镜的特点 2、临界点干燥的原理 3、金属镀膜的目的 4、 SEM样品的常规制备步骤 5、 SEM样品制备的基本要求与原则
（2）干燥的方法
2）真空干燥法 方法：在真空的条件下使样品中的脱水剂 挥发掉。 特点：效果与空气干燥时相同，仅是干燥 的速度较快。
（2）干燥的方法
3）冷冻干燥法
图3-1 冷冻干燥法技术流程
特点：在干燥过程中由于不形成液-气界面， 所以由表面张力引起的样品变形和损 伤大为减少，因此干燥效果较好。 缺点：冷冻过程有可能形成冰晶损伤。
（2）原子序数效应 原子序数效应：样品内原子序数不同的元 素，在图象上也会形成一定的亮度差异， 这种现象称为原子序数效应。 对策：观察生物样品时，在样品表面喷镀 一层原子序数高的金属膜，可提高图象质 量。
2、影响图象形成的因素
（3）充放电效应
充电：当初级电子轰击干燥的生物 样品表面时，会因其导电性能差而 发生电荷积累的充电现象，并对随 后到来的初级电子产生排斥，使电 子散开，且导致二次电子发射轨迹 偏斜或杂乱。 放电：轰击区内电子堆积，与邻近 区域间产生电位差，则可产生放电 打火现象。 充放电效应：上述充、放电状况造 成图象忽明忽暗或模糊不清等现象， 称为充放电效应。 对策：采用金属镀膜、导电胶粘贴 样品等导电处理，可减少充放电效 应的影响。
3、固定
（1）固定的目的 保留样品的微细结构和外部形貌，使其更近于生活状 态。 使组织硬化，以增强样品在随后的干燥过程中耐受表 面张力变化的能力。 提高样品对镜筒内高真空和电子束轰击的耐受力。 （2）常用的固定剂 戊二醛：常用浓度为1~4%。 锇酸：一般用1~2%浓度。 （3）固定的方法 先用戊二醛固定1至几小时或更长，经缓冲液充分清 洗后，再用锇酸固定30~60分钟。