扫描电镜制样

扫描电子显微镜(SEM)常规样品制备技术

SEM常规制样方法（一）

——试样的取材、固定、脱水和置换

一、实验目的

掌握扫描电镜制样过程：从取材、固定、脱水、置换、干燥、喷涂这一过程中样品怎样保持生活状态，从而得出接近生活状态的样品。

二、实验原理

不论动物或植物组织，要求取材时操作必须快速，组织表面要清洁，必要时需超声波清洗，原理同TEM取材，但需强调的是SEM观察表面结构，所以应注意表面结构的清洁、完整和电镜下反应真实的形貌。取材时动作要快、轻、准、大小在1mm-1cm之间，所用的器械要锋利、洁静，避免任何牵拉和挤揉样品表面的损伤，常用的固定剂有2-4%戊二醛和1%锇酸。

三、实验器材

样品（动物或植物）、双面刀片、培养皿、l.5ml离心管、牙签、2-4%戊二醛、1%锇酸、

0. 1M PBS缓冲液，乙醇、乙酸异戊酯。

四、实验步骤

1、取材

要求动作轻、迅速、准确，为了保持生活状态，应在固定前清洗掉表面杂质，即，迅速将标本放在PBS缓冲液中冲洗，也可超声波器中超10s-30s，使样品所带的污物除去（如：气管内壁上的粘液、植物叶上的灰尘等）。

2、固定（前固定）

经过清洗的样品迅速投入2-4%戊二醛囤定液中，间歇振荡且室温固定约2-4小时即可。

样品固定的目的：使样品细胞的微细结构完整真实地保存下来。如果样品没有很好地固定，那么样品在脱水时可能变形，破坏了样品的生活状态，也就是说，固定不好的材料，电镜下不能反映真实结构，所以这一步很重要。

3、冲洗

0. 1M PH7.2 PBS缓冲液洗：30分钟中间换3-4次，因戊二醛与锇酸反应生成细微的沉淀，所以在后固定之前，用0. IM PBS缓冲液洗去多余的戊二醛之后，样品才可能进入锇酸固定液。

4、后固定：1%四氧化锇后固定1-2小时。

5、冲洗：重蒸水冲洗30分钟中间换3-4次，因四氧化锇与乙醇反应，所以在脱水前充分洗去残留的四氧化锇，样品才能进行脱水。

6、脱水

脱水剂为乙醇，室温进行为了减少人工损伤，需要梯度脱水：30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%，每级15-20分钟，如果是动物样品，脱水时间可5-10分钟，脱水要充分完全地进行直到除尽样品中的水份为止，最后100%乙醇要重复2-3次，保证样品绝对无水。

7、置换：醋酸异戊酯30分钟或者过夜

样品脱水后，放入醋酸异戊酯中。样品在脱水时，样品中的水份被乙醇脱水剂替代，而乙醇挥发较快易自然干燥，固选用挥发较慢的乙酸异戊酯，既能与CO2溶合，又能与乙醇溶合，作中间媒介液置换。

五、实验结果

要求学生写出实验报告。

SEM常规制样方法（二）

——样品的临界点干燥

一、实验目的

1、掌握样品临界点干燥的目的。

2、掌握临界点干燥的操作和原理。

二、实验原理

我们知道物质有三态：固态、液态和气态。在体积不变的情况下，它们在温度和压力变更下可以相互转化。临界状态，就是在体积恒定状态下，调节CO2的温度即32℃至40℃之间的某一个温度下，液体压强在75个bar以上，液体的CO2的表面张力系数为零。也就是说分子的内聚力等于零，这时物质不能再以液态继续存在，而变成气态，这时气体无论在多大的压强下，都不会变成液体。临界点干燥器也就是利用了将液体CO2加温到临界状态，使CO2汽化过程中的表面张力受到抑制，而在临界状态时不存在液体表面张力的特性，从而消除了样品在干燥中变形的主要因素，达到尽可能使样品保持生活状态的目的。

三、实验器材

液体CO2、样品笼、镊子、滤纸。临界点干燥仪。

四、操作步聚

一．装入样品；顺时针旋紧样品室盖；

二．开总电源

三．冷却样品室

1．按Cooling，开始冷却；从室温降至10℃，大约7.5分钟；

2．保持温度在10℃以下；

四．注入CO2

1．开CO2气瓶总阀；

2．按Medium in，注入CO2;

3．液体CO2充满样品室，至玻璃窗上沿；

4．再按Medium in，CO2入口阀关闭；

5．可按Stirrer（磁力搅拌棒），使液体更好地交换（对特别娇嫩的样品，不能使用Stirrer）；五．置换

1．静置0. 5h-1h，等待液体CO2与脱水剂（乙醇或乙酸异戊酯）分层和置换；

2．关Stirrer：

3．按Medium Out，从样品室底部放出混合液至样品仍能被CO2覆盖为止；

4．再按Medium Out，排气阀关闭；

5．重复以上步骤四和五，视样品状态至少2次以上，使脱水剂完全被CO2取代；

六．充CO2

1．按Medium in，充入CO2至玻璃窗上沿以下2-3mm;

2．再按Medium in，CO2入口阀关闭；

七．样品的干燥

1．核实所有的阀已关：Medium in，Medium Out，Gas Out必须关闭；

2．关Cooling;

3．开Heating;

4．温度和压力上升，到达CO2的临界点(31℃，73.8bar)，气液界面消失，大约15分钟达到预设温度40℃，恒温；

八，放气：核实Metering Valve关闭

1．开Gas Out;

2．仔细逆时针开Metering Valve，调节指示漂浮在流量计中部，缓慢放出气体；

3．随压力下降，重调Metering Valve;

九，干燥

1．约1小时后，压力降至0，关Heating，停止加热；

2．到达大气压后，关Gas Out，顺时针关闭Metering Valve;

3．打开样品室，取出已干燥的样品；

十．关机

1．关CO2气瓶总阀；

2．按Medium In，使气体从连接管放出：

3．再按Medium In，CO2入口阀关闭；

4．关总电源：

5．用乙醇清洁样品室：

6．盖样品室盖．

注：临界点干燥仪为高压仪器，使用时须认真遵守操作规程，注意安全．

五、实验结果。

要求学生写出实验报告。

SEM常规制样方法（三）

离子溅射仪——样品表面喷金

一、实验目的

1、掌握离子溅射的原理。

2、掌握离子溅射的操作方法。

二、实验原理

生物样品经过干燥后，表面不导电，导热性能也很差，这样电子束打在样品表面就会产生电荷的积累，屏幕上出现放电亮线，影响图象的清晰度，甚至无法成象，生物等非导体样品往往是由一些低原子序数的元素所组成的，它们的二次电子发射率很低，图象如同阴雨黄昏的景色，缺乏层次，清晰度也差，高倍图象质量极差，且高倍率下，经电子束轰击，生物样品很易增温、起泡、龟裂、穿孔、升华和分解，无法较长时间在高倍下观察，为此需要将整个样品的表面喷镀一层薄薄导电金属，所以生物样品粘在样品台上必须进行喷镀，保持良好的导电性能，提高样品表面二次电子的发射率，提高信噪比，使图象清晰。此外由于金属电热性能好，所以可防止样品的热损伤。

离子溅射法是利用电子轰击将金属原子打出来（溅射）进行镀膜的办法，溅射的金属制成阴极靶，样品放在阳极上。在真空达到( 10-1-10-2)时，两极通电时就产生辉光放电，气体电离产生的阳离子，在负电场加速下轰击金靶，使金属原子溅射出来，在正电场的加速下飞向样品，由于样品上各部分都带正电，因此不论凹凸部位或孔洞各处，都具有同等的吸附金原子的机会，也就达到了无死区的很均匀的连续金属镀膜。

三、实验器材

样品台、镊子、导电胶带。离子镀膜仪。

四、操作步骤

1、将干燥好的样品粘贴在样品台上。

2、接通离子溅射仪的电源。

3、打开顶盖上的进气旋钮，使罩内进入空气。

4、取下顶盖，将样品台放入样品架上，并盖好顶盖。