扫描电镜制样

扫描电子显微镜(SEM)常规样品制备技术
SEM常规制样方法（一）
——试样的取材、固定、脱水和置换
一、实验目的
掌握扫描电镜制样过程：从取材、固定、脱水、置换、干燥、喷涂这一过程中样品怎样保持生活状态，从而得出接近生活状态的样品。

二、实验原理
不论动物或植物组织，要求取材时操作必须快速，组织表面要清洁，必要时需超声波清洗，原理同TEM取材，但需强调的是SEM观察表面结构，所以应注意表面结构的清洁、完整和电镜下反应真实的形貌。

取材时动作要快、轻、准、大小在1mm-1cm之间，所用的器械要锋利、洁静，避免任何牵拉和挤揉样品表面的损伤，常用的固定剂有2-4%戊二醛和1%锇酸。

三、实验器材
样品（动物或植物）、双面刀片、培养皿、l.5ml离心管、牙签、2-4%戊二醛、1%锇酸、
0. 1M PBS缓冲液，乙醇、乙酸异戊酯。

四、实验步骤
1、取材
要求动作轻、迅速、准确，为了保持生活状态，应在固定前清洗掉表面杂质，即，迅速将标本放在PBS缓冲液中冲洗，也可超声波器中超10s-30s，使样品所带的污物除去（如：气管内壁上的粘液、植物叶上的灰尘等）。

2、固定（前固定）
经过清洗的样品迅速投入2-4%戊二醛囤定液中，间歇振荡且室温固定约2-4小时即可。

样品固定的目的：使样品细胞的微细结构完整真实地保存下来。

如果样品没有很好地固定，那么样品在脱水时可能变形，破坏了样品的生活状态，也就是说，固定不好的材料，电镜下不能反映真实结构，所以这一步很重要。

3、冲洗
0. 1M PH7.2 PBS缓冲液洗：30分钟中间换3-4次，因戊二醛与锇酸反应生成细微的沉淀，所以在后固定之前，用0. IM PBS缓冲液洗去多余的戊二醛之后，样品才可能进入锇酸固定液。

4、后固定：1%四氧化锇后固定1-2小时。

5、冲洗：重蒸水冲洗30分钟中间换3-4次，因四氧化锇与乙醇反应，所以在脱水前充分洗去残留的四氧化锇，样品才能进行脱水。

6、脱水
脱水剂为乙醇，室温进行为了减少人工损伤，需要梯度脱水：30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%，每级15-20分钟，如果是动物样品，脱水时间可5-10分钟，脱水要充分完全地进行直到除尽样品中的水份为止，最后100%乙醇要重复2-3次，保证样品绝对无水。

7、置换：醋酸异戊酯30分钟或者过夜
样品脱水后，放入醋酸异戊酯中。

样品在脱水时，样品中的水份被乙醇脱水剂替代，而乙醇挥发较快易自然干燥，固选用挥发较慢的乙酸异戊酯，既能与CO2溶合，又能与乙醇溶合，作中间媒介液置换。

五、实验结果
要求学生写出实验报告。

SEM常规制样方法（二）
——样品的临界点干燥
一、实验目的
1、掌握样品临界点干燥的目的。

2、掌握临界点干燥的操作和原理。

二、实验原理
我们知道物质有三态：固态、液态和气态。

在体积不变的情况下，它们在温度和压力变更下可以相互转化。

临界状态，就是在体积恒定状态下，调节CO2的温度即32℃至40℃之间的某一个温度下，液体压强在75个bar以上，液体的CO2的表面张力系数为零。

也就是说分子的内聚力等于零，这时物质不能再以液态继续存在，而变成气态，这时气体无论在多大的压强下，都不会变成液体。

临界点干燥器也就是利用了将液体CO2加温到临界状态，使CO2汽化过程中的表面张力受到抑制，而在临界状态时不存在液体表面张力的特性，从而消除了样品在干燥中变形的主要因素，达到尽可能使样品保持生活状态的目的。

三、实验器材
液体CO2、样品笼、镊子、滤纸。

临界点干燥仪。

四、操作步聚
一．装入样品；顺时针旋紧样品室盖；
二．开总电源
三．冷却样品室
1．按Cooling，开始冷却；从室温降至10℃，大约7.5分钟；
2．保持温度在10℃以下；
四．注入CO2
1．开CO2气瓶总阀；
2．按Medium in，注入CO2;
3．液体CO2充满样品室，至玻璃窗上沿；
4．再按Medium in，CO2入口阀关闭；
5．可按Stirrer（磁力搅拌棒），使液体更好地交换（对特别娇嫩的样品，不能使用Stirrer）；五．置换
1．静置0. 5h-1h，等待液体CO2与脱水剂（乙醇或乙酸异戊酯）分层和置换；
2．关Stirrer：
3．按Medium Out，从样品室底部放出混合液至样品仍能被CO2覆盖为止；
4．再按Medium Out，排气阀关闭；
5．重复以上步骤四和五，视样品状态至少2次以上，使脱水剂完全被CO2取代；
六．充CO2
1．按Medium in，充入CO2至玻璃窗上沿以下2-3mm;
2．再按Medium in，CO2入口阀关闭；
七．样品的干燥
1．核实所有的阀已关：Medium in，Medium Out，Gas Out必须关闭；
2．关Cooling;
3．开Heating;
4．温度和压力上升，到达CO2的临界点(31℃，73.8bar)，气液界面消失，大约15分钟达到预设温度40℃，恒温；
八，放气：核实Metering Valve关闭
1．开Gas Out;
2．仔细逆时针开Metering Valve，调节指示漂浮在流量计中部，缓慢放出气体；
3．随压力下降，重调Metering Valve;
九，干燥
1．约1小时后，压力降至0，关Heating，停止加热；
2．到达大气压后，关Gas Out，顺时针关闭Metering Valve;
3．打开样品室，取出已干燥的样品；
十．关机
1．关CO2气瓶总阀；
2．按Medium In，使气体从连接管放出：
3．再按Medium In，CO2入口阀关闭；
4．关总电源：
5．用乙醇清洁样品室：
6．盖样品室盖．
注：临界点干燥仪为高压仪器，使用时须认真遵守操作规程，注意安全．
五、实验结果。

要求学生写出实验报告。

SEM常规制样方法（三）
离子溅射仪——样品表面喷金
一、实验目的
1、掌握离子溅射的原理。

2、掌握离子溅射的操作方法。

二、实验原理
生物样品经过干燥后，表面不导电，导热性能也很差，这样电子束打在样品表面就会产生电荷的积累，屏幕上出现放电亮线，影响图象的清晰度，甚至无法成象，生物等非导体样品往往是由一些低原子序数的元素所组成的，它们的二次电子发射率很低，图象如同阴雨黄昏的景色，缺乏层次，清晰度也差，高倍图象质量极差，且高倍率下，经电子束轰击，生物样品很易增温、起泡、龟裂、穿孔、升华和分解，无法较长时间在高倍下观察，为此需要将整个样品的表面喷镀一层薄薄导电金属，所以生物样品粘在样品台上必须进行喷镀，保持良好的导电性能，提高样品表面二次电子的发射率，提高信噪比，使图象清晰。

此外由于金属电热性能好，所以可防止样品的热损伤。

离子溅射法是利用电子轰击将金属原子打出来（溅射）进行镀膜的办法，溅射的金属制成阴极靶，样品放在阳极上。

在真空达到( 10-1-10-2)时，两极通电时就产生辉光放电，气体电离产生的阳离子，在负电场加速下轰击金靶，使金属原子溅射出来，在正电场的加速下飞向样品，由于样品上各部分都带正电，因此不论凹凸部位或孔洞各处，都具有同等的吸附金原子的机会，也就达到了无死区的很均匀的连续金属镀膜。

三、实验器材
样品台、镊子、导电胶带。

离子镀膜仪。

四、操作步骤
1、将干燥好的样品粘贴在样品台上。

2、接通离子溅射仪的电源。

3、打开顶盖上的进气旋钮，使罩内进入空气。

4、取下顶盖，将样品台放入样品架上，并盖好顶盖。

5、转动样品台[SPECLEN STAGE]，向上／向下[UP/DOWN]旋钮，使样品台和金靶的距
离为30mm为宜。

6、旋转电源[POWER]开关[ON]到旋转泵开关[RP]的位置，再旋转抽气旋钮[VACUUM VALAE]开关[CLOSE]到开[OPEN]，开始建立真空。

7、当真空针指示0.1托时，调电源旋钮从低真空开关[RP]到高压[HV]的位置，再调高压控制旋钮到“8”的位置。

调节针控阀[PRESSURE CONTROL]使离子流达到8mA，旋转溅射定时旋钮到1分钟。

再回调到6 mA位置，喷涂1分钟。

此过程中可看到罩内发出兰紫色的光，还可看到样品台上逐渐镀上黄色的金属层。

说明样品表面已经镀了一层金属。

8、溅射完毕后，定时器自动复原，然后按上述步骤反程序操作，关闭高压、打开钟罩，取出样品，关闭钟罩，回抽……关闭机械泵(RP)开关，切断仪器电源。

五、实验结果：要求学生写实验报告。