扫描电镜及其制样技术共45页

扫描电镜制样

扫描电子显微镜(SEM)常规样品制备技术SEM常规制样方法（一）——试样的取材、固定、脱水和置换一、实验目的掌握扫描电镜制样过程：从取材、固定、脱水、置换、干燥、喷涂这一过程中样品怎样保持生活状态，从而得出接近生活状态的样品。

二、实验原理不论动物或植物组织，要求取材时操作必须快速，组织表面要清洁，必要时需超声波清洗，原理同TEM取材，但需强调的是SEM观察表面结构，所以应注意表面结构的清洁、完整和电镜下反应真实的形貌。

取材时动作要快、轻、准、大小在1mm-1cm之间，所用的器械要锋利、洁静，避免任何牵拉和挤揉样品表面的损伤，常用的固定剂有2-4%戊二醛和1%锇酸。

三、实验器材样品（动物或植物）、双面刀片、培养皿、l.5ml离心管、牙签、2-4%戊二醛、1%锇酸、0. 1M PBS缓冲液，乙醇、乙酸异戊酯。

四、实验步骤1、取材要求动作轻、迅速、准确，为了保持生活状态，应在固定前清洗掉表面杂质，即，迅速将标本放在PBS缓冲液中冲洗，也可超声波器中超10s-30s，使样品所带的污物除去（如：气管内壁上的粘液、植物叶上的灰尘等）。

2、固定（前固定）经过清洗的样品迅速投入2-4%戊二醛囤定液中，间歇振荡且室温固定约2-4小时即可。

样品固定的目的：使样品细胞的微细结构完整真实地保存下来。

如果样品没有很好地固定，那么样品在脱水时可能变形，破坏了样品的生活状态，也就是说，固定不好的材料，电镜下不能反映真实结构，所以这一步很重要。

3、冲洗0. 1M PH7.2 PBS缓冲液洗：30分钟中间换3-4次，因戊二醛与锇酸反应生成细微的沉淀，所以在后固定之前，用0. IM PBS缓冲液洗去多余的戊二醛之后，样品才可能进入锇酸固定液。

4、后固定：1%四氧化锇后固定1-2小时。

5、冲洗：重蒸水冲洗30分钟中间换3-4次，因四氧化锇与乙醇反应，所以在脱水前充分洗去残留的四氧化锇，样品才能进行脱水。

6、脱水脱水剂为乙醇，室温进行为了减少人工损伤，需要梯度脱水：30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%，每级15-20分钟，如果是动物样品，脱水时间可5-10分钟，脱水要充分完全地进行直到除尽样品中的水份为止，最后100%乙醇要重复2-3次，保证样品绝对无水。

扫描电镜标本制备技术[资料]

扫描电镜标本制备技术扫描电镜Scanningelectronmicroscope，SEM)与透射电镜在观察中获得的超微结构信息各有所长，并互相补充。

透射电镜样品制备技术主要用于观察生物样品内部的二维平面的微细结构，而扫描电镜所收集的主要是电子束照射在样品上所产生的二次电子。

由于扫描电镜景深长，故其图像层次丰富，立体感强，可显示生物样品表面及其断面的三维立体结构。

一、SEM生物样品制备的基本要求及操作程序生物样品与金属、矿物等材料不同，具有质地柔软、容易变形、导电性能差、二次电子发射率低、含水量多(有的含水达80%以上)等特点，因此对热、干燥、电子轰击等十分敏感，所以扫描电镜生物样品的制备有以下基本要求：1.注意表面的清洁，防止污染。

2.样品要干燥，不能变形，尽量保持样品表面的微细结构。

3.导电性能要好，应进行导电处理。

4.二次电子的发射率要高。

5.注意确认和保护样品的观察面。

尽管不同的生物样品可以采用不同的制备方法，但一般情况下除了比较坚硬的组织(骨骼、牙齿、指甲、毛发、贝壳、昆虫及某些植物样品)和需采用某些特殊制备技术者(管道铸型扫描、低电压观察法等)外，均需要经过取材、清洗、固定、脱水、干燥及金属镀膜等基本操作程序。

(一)取材1.取材前应作好药品及器材的准备，每次取材的品种及数量不宜过多，以免延误时间、影响制样效果。

2.动作要迅速，材料应尽快进入固定液。

3.取材部位要准确。

观察组织细胞表面结构为主的样品，直径最大不宜超过5mm，高度可在3～5mm之间。

观察组织细胞内部结构为主的样品，直径应小于2mm，高度可在3mm左右。

为了提高固定、脱水、干燥及镀膜效果，在满足所需要观察内容的条件下，样品块以尽量小一些为宜。

4.机械损伤要小，解剖器械要锋利，取材动作要轻巧，避免牵拉和钳夹，并做好对观察面的标记。

5.操作应在低温(0～4℃)下进行。

(二)样品情况在样品制备过程中，应注意清除覆盖于样品表面的粘液、分泌物、组织液、血液、细胞碎片、药物反应沉淀物等所造成的污染，否则不仅会掩盖样品表面的微细结构，甚至会得出错误的判断。

扫描电镜样品制备

扫描电镜样品制备扫描电子显微镜生物样品制备技术无论是透射电镜或是扫描电镜，样品均处于电镜镜筒的真空之中。

而大多数的生物样品都是柔软而且含大量水分的。

因此，也和透射电镜的样品一样，在进行扫描电镜观察前，必须对生物样品作相应的处理。

扫描电镜的功能很多，不同的功能对样品的要求不同。

例如二次电子像与背散射电子像和吸收电子像对样品的要求基本相同，而与X射线微区分析对样品的要求相差较远。

我们首先介绍二次电子像的生物样品制备技术。

此外，由于样品的性质不同，其处理方法和程序也有不同。

主要分两大类，一类为含水量少的硬组织，如毛发、牙齿及植物的花粉、孢子、种子等。

此类样品一般含硅质、钙质，角质，砝琅质和纤维素等成份，所以通常只经过表面清洁、装台(粘胶)、导电处理等简单过程即可进行观察。

如要观察其断面或内部结构时，经断裂、解剖或酶消化、蚀刻等再装台、镀膜处理，即可进行观察拍照。

另-类为含水分较多的软组织，如大多数的动植物器官、组织及细菌等均属此类。

对于此类样品，在金属镀膜前，一般都需经过固定、脱水、干燥等处理，如不经处理或处理不当，就会造成样品损伤和变形，出现各种假像，因此对每一处理步骤都应给予重视。

但是，不管是那一类样品的制备，都应达到以下要求：∙尽可能保持样品活体时的形貌和结构，以便如实地反映样品本来面目。

∙在样品的干燥过程尽可能减少样品变形。

∙样品表面应有良好导电性能和二次电子发射率，以防止和减少样品的荷电效应。

样品的前期处理扫描电镜样品的前期处理主要包括表面清洁、固定、漂洗和脱水等过程。

而每一过程的处理方法基本上都是沿用透射电镜样品的处理方法的，所以，这里不一一再作详述。

但是，由于两种电镜观察的要求不同，因此，在处理中也有不同之处：1. 透射电镜主要研究样品的内部结构要求内部结构保存好，因而样品宜尽可能小使固定液能迅时渗入固定。

扫描电镜观察表面形貌，而且为了操作方便选取较大样品。

一般在8～10mm2左右，高度可达5mm。

扫描电镜样品制备生物技术

金属原子 “辉光放电” 不同角度覆盖样品表面
离子溅射原理
优点：
喷镀颗粒较细，不至于掩盖样品的微细结构喷镀均匀二次电子收获量较高
组织导电技术：
原理：金属盐类化合物与生物样品中的蛋白
质、脂类、淀粉等呈化学性结合，使样品表面离子化，或游离出金属分子镶嵌于生物分子之间，使样品表面电阻降低，从而避免了样品充电。可避免样品热损伤。
材料防止挤压，观察面做好标记
（二）样品清洁漂洗
一般：生理盐水、5％碳酸钠或与固定液相应的缓冲液大量粘液：预固定，再用蛋白水解酶表面形态复杂、皱折凹陷多，不易清洗的样品：低频超声波观察组织、细胞内部结构（如血管等）：灌流清洗后再取材
（三）样品的固定
目的：保持生物样品的微细结构和外部形貌。
扫描电子显微镜样品制备技术
SEM结构
扫描电子显微镜原理
一、常规扫描电镜样品制备技术
样品表面必须清洁样品要干燥而不失原形样品要有良好的导电性能注意辨认和保护观察面
（一）取材要点
材料大小适宜
观察表面结构：直径＜5mm，高度3～5mm 观察内部结构：直径＜2mm，高度3mm± 满足观察内容条件下，样品块尽量小。
原因：表面张力目的：消除表面张力
方法：空气干燥法冷冻真空干燥法临界点干燥法
临界点干燥法
原理：临界状态下表面张力为零处理液： CO2
临界温度（31.1℃）临界压力（73个大气压）
操作程序：
取材→双固定→丙酮脱水→中间液（醋酸异戊酯）置换脱水剂→液态CO2置换中间液→加热气化（温度40℃，压力 95~100kg/cm2，3~5分钟） →缓慢放气取样→喷镀→观察。
分辨率为 25 Å （SEM 60 Å ） 4．复型膜由铂、碳粒子组成，可长期保存。

扫描电镜细菌制样方法

细菌样品前处理取液体或固体培养基中培养20h左右、旺盛生长的菌体。

(1)收集菌体:①液体培养基中的菌体,可取培养液8000rpm离心3~5min,弃上清,倒入2.5%戊二醛固定液;②固体培养基上的菌体,可在菌落表面滴几滴戊二醛固定液,轻刮菌落(注意不要刮下培养基)。

将菌液吸入小离心管,离心后换入新鲜戊二醛固定。

(2)固定,脱水按常规方法。

2.5%戊二醛,2~4h→磷酸缓冲液清洗3次→1%锇酸4~6h→缓冲液清洗3次→乙醇梯度脱水,30%,50%,70%,85%,95%各一次,100%乙醇2次,15~20min/次→乙酸异戊酯置换2次,20min/次(注意:每步均需离心,8000rpm,3~5min,弃上清,倒入下一种试剂,滴管来回吸几下,打散菌块)。

(3)临界点干燥: 普通定性滤纸裁成35mm×18mm的纸条,将长边35mm平均分成3份,对折成小纸包,用订书钉将一端订牢,成小口袋状。

将离心浓缩后的菌液滴入小纸包,立即用钉书器将另一端钉牢。

放入临界点干燥器样品室,进行CO2临界点干燥。

一般每次可同时处理10~20种不同菌样(注意,需用液态CO2置换2~3次)。

(4)离子溅射金:沿两端书钉剪开滤纸包,将干燥后粉末状纯菌体倒入平皿,轻摇尽量分散菌体。

碳导电胶带一面粘在1/4盖玻片上,另一面倒扣轻压在菌体粉末上,翻正后用镊子或牙签将菌体轻轻刮薄铺平。

离子溅射金后,即可进行扫描电镜观察。

细菌样品特殊制备方法；1，固体培养基中的菌体用镊子夹一小块盖玻片，轻轻放在旺盛生长的菌体上，粘附一定的细菌。

然后用双面胶将此盖玻片贴在棕色瓶瓶盖内壁，在棕色瓶内加入适量1%锇酸，盖上含有样品的瓶盖，熏蒸固定2h以上。

然后用双面胶将盖玻片粘在样品台上，喷金，进行扫描电镜观察。

2，液体培养基中的菌体取一定的培养液，8000rpm离心3~5min，弃上清液，加入2.5%戊二醛固定2h，pH 7.2磷酸盐缓冲液清洗，然后加入蒸馏水稀释，充分混合后用滴管取混合液一滴于小块盖玻片上，吸附2min，用滤纸吸去多余溶液。

扫描电镜SEM和透射电镜TEM样品制备技术

手柄
凹槽 21
PP2000T冷冻样品制备室
各种样品台
样品支架安装在转移装置上（旁边是插入液氮装置，背景是控制器）
样品插入冷冻剂
2
S E M 制样技术
样品取样不含水或含水少样品种类含水多清洗导电不导电固定脱水干燥
镀金 SEM观察并照相
3
SEM的制样准则 • 尽可能保持样品本来的形貌和结构 • 在样品的干燥过程尽可能减少样品变形 • 样品表面应有良好导电性能和二次电子发射率
4
微胶囊化产品的超微结构
表面结构的观察：
在SEM样品台上贴上双面胶，将少许微胶囊化产品的粉末撒于双面胶上，吹去多余的粉末，然后喷金，采用SEM进行观察。加速电压为 15kV。
内部结构的观察：
撒少许微胶囊化DHA和EPA产品在贴了双面胶的样品台上，稍稍压实，使一部分粉末陷入双面胶的胶基中。用刀片刮去表面的粉末，然后轻刮双面胶的表面，立即喷金，然后用SEM进行观察，加速电压为15kV。
9
• 临界点干燥（Critical-point drying, CPD）
31.3℃ 72.8 atm
在31.3℃以下， CO2以液态形式存在，在临界温度31.3℃以上，CO2以气态形式存在，在任何压力下都不能使CO2液化。在临界温度下，使CO2气体液化所需的最小压力Pc为临界压力。
10
低温（5～10℃）时，将样品加到液体CO2中，液体CO2 取代有机溶剂，当温度升高到 31.3℃，液体CO2转化成CO2 气体，从加压池中把CO2气体放出，由于在临界态气液不分，当液体CO2转化成CO2气体时，样品干燥未经过两相界 SPI # 13200-AB临界点干燥机面。

扫描电镜样品制备

扫描电镜样品制备扫描电子显微镜生物样品制备技术无论是透射电镜或是扫描电镜，样品均处于电镜镜筒的真空之中。

而大多数的生物样品都是柔软而且含大量水分的。

因此，也和透射电镜的样品一样，在进行扫描电镜观察前，必须对生物样品作相应的处理。

扫描电镜的功能很多，不同的功能对样品的要求不同。

例如二次电子像与背散射电子像和吸收电子像对样品的要求基本相同，而与X射线微区分析对样品的要求相差较远。

我们首先介绍二次电子像的生物样品制备技术。

此外，由于样品的性质不同，其处理方法和程序也有不同。

主要分两大类，一类为含水量少的硬组织，如毛发、牙齿及植物的花粉、孢子、种子等。

此类样品一般含硅质、钙质，角质，砝琅质和纤维素等成份，所以通常只经过表面清洁、装台(粘胶)、导电处理等简单过程即可进行观察。

如要观察其断面或内部结构时，经断裂、解剖或酶消化、蚀刻等再装台、镀膜处理，即可进行观察拍照。

另-类为含水分较多的软组织，如大多数的动植物器官、组织及细菌等均属此类。

对于此类样品，在金属镀膜前，一般都需经过固定、脱水、干燥等处理，如不经处理或处理不当，就会造成样品损伤和变形，出现各种假像，因此对每一处理步骤都应给予重视。

但是，不管是那一类样品的制备，都应达到以下要求：∙尽可能保持样品活体时的形貌和结构，以便如实地反映样品本来面目。

∙在样品的干燥过程尽可能减少样品变形。

∙样品表面应有良好导电性能和二次电子发射率，以防止和减少样品的荷电效应。

样品的前期处理扫描电镜样品的前期处理主要包括表面清洁、固定、漂洗和脱水等过程。

而每一过程的处理方法基本上都是沿用透射电镜样品的处理方法的，所以，这里不一一再作详述。

但是，由于两种电镜观察的要求不同，因此，在处理中也有不同之处：1. 透射电镜主要研究样品的内部结构要求内部结构保存好，因而样品宜尽可能小使固定液能迅时渗入固定。

扫描电镜观察表面形貌，而且为了操作方便选取较大样品。

一般在8～10mm2左右，高度可达5mm。

第六章扫描电子显微镜的样品制备技术

在冷冻干燥过程中，样品中的水分直接由冰态升华为气态，样品也不受表面张力的影响。但这种方法也有不足之处，如：样品中的水分易形成冰晶而破坏超微结构。因此需要大量的冷冻剂和较好的真空装置，使造价提高。再加上所需冷冻时间过长，更限制了这种方法的使用。所以，尽管用这种方法能较好地保存样品中的水溶性和脂溶性物质，但是使用仍不普遍。有下面两种方法：
第六章扫描电子显微镜的
样品制备技术
6.1 SEM样品制备的基本要求
SEM对样品基本要求：
基本性质：干净、干燥、导电、不发光、不发热、磁性弱。
大小：直径最大不宜超过10 mm，高度在3-5 mm之间，在满足观察的情况下，样品尽量小为宜。
对试样的要求试样可以是块状或粉末颗粒，试样大小要适合仪器专用样品座的尺寸，不能过大。样品座尺寸各仪器不尽相同，一般小的样品座为 Φ 3 ～ 5mm ，大的样品座为 Φ 30 ～ 50mm ，以分别用来放置不同大小的试样，样品的高度也有一定的限制，一般在 5 ～ 10mm 左右。
表面受到污染的试样，要在不破坏试样表面结构的前提下进行适当清洗，然后干燥。
新断开的断口或断面，一般不需要进行处理，以免破坏断口或表面的结构状态。有些试样的表面、断口需要进行适当的侵蚀，才能暴露某些结构细节，则在侵蚀后应将表面或断口清洗干净，然后烘干。
要求在真空中能保持稳定，含有水分的试样应先干燥除去水分。
对磁性试样要预先去磁，以免观察时电子束受到磁场的影响。
要求导电，不导电的观察前进行导电处理。
6.1.2块状试样的制备
块状试样扫描电镜的试样制备是比较简便的。对于块状导电材料，除了大小要适合仪器样品座尺寸外，基本上不需要进行什么制备，用导电胶把试样粘结在样品座上，即可放在扫描电镜中观察。对于块状的非导电或导电性较差的材料，要先进行镀膜处理，在材料表面形成一层导电膜。以避免电荷积累，影响图象质量。并可防止试样的热损伤。

电镜样品的制备最新课件

电镜样品的制备最新
取材 2.清洗液的类型与选择：蒸馏水、生理盐水、加酶清洗液等
清洗 ➢ 选择原则：清洗液的pH值、渗透压、温度应该尽量接近样品材料的生理值，以免样品因环境突变而产生形变。
固定 ➢ 选择方法：
脱水 ✓植物材料：蒸馏水洗净尘埃；
✓动物材料：等渗生理盐水、5%碳酸钠或缓冲液洗去黏液等；
第一节扫描电镜样品的常规制备技术
菌类和组培细胞
粘样或滴样
熏蒸固定
干燥
取清材洗
冷冻
断裂
固清洗脱定水
干粘镀镜燥样膜检
管道铸型
花粉、种子及孢子类样品
电镜样品的制备最新
腔形器官
取材一、取材即：获取观察材料。
遵循五字原则：准、轻、小、净、浓
清洗
1.迅速准确：取材动作要快，部位要准确。
固定
取材三、固定方法
清洗 1.单固定：只用一种固定剂（通常戊二醛）固定的方法。
固定
2.熏蒸固定：固体培养基培养的菌丝类样品。用锇酸蒸汽熏蒸固定0.5~1小时。
脱水 3.双固定：戊二醛(1~3h)—锇酸(0.5~1h)
干燥 4.冷冻固定：液氮超低温快速冷冻可保存样品的生活状态。
粘样 5.不固定：干种子、花粉、孢子类样品。
霉菌切割菌落
戊二醛固定
常规固定脱水干燥粘样镀膜
常规脱水干燥
杆菌10μm
球菌电10镜μ样m品的制备最酵新母菌5 μm
曲霉20 μm
电镜样品的制备最新
第二节特殊要求的扫描制样技术
——组织细胞的内部结构观察法
内部结构剖出法
切断法：多孔组织简易剖出法掰开法：实质性组织
拉断法：纤维组织

扫描电镜样品制备技术

1）、取材的方法
动物和植物组织的取材：方法与超薄切片的取材基本相同，只是因为扫描电镜主要是观察组织的游离表面形态结构，因此在取材时一定要保护好所需要的游离表面的部位，不能造成任何损伤；另外所取样品块可稍大一些，一般观察面大小可在长X宽大约为 3X5毫米（可根据样品的性质变化取材的大小）。离体培养的细胞取材：可在接种时把处理好的盖玻片放在培养瓶内，让细胞长在盖片上，把带有细胞的盖片直接进行制样处理。细菌的取材：平板和斜面培养的，可用牙签取菌落涂到干净的盖片上，进行制样。悬液培养的细胞或细菌要离心收集细胞或细菌，然后再进行制样。
3、应能产生丰富的二次电子。可以导电的物质很多，并非都能用作扫描电镜生物样品的导电处理。目前常用于扫描生物样品制备导电处理的物质有黄金、铂金及铂—钯合金和铂—铱合金。只有这些金属对生物样品导电处理后，才能产生丰富的二次电。 4、样品能耐高真空和耐电子束的轰击。如果样品制作的不合乎要求，当电子束在表面扫描时，会产生电荷的积累，造成观察图像亮的地方很亮，黑的部位很黑，样品的结构细节看不清楚，严重时会造成样品的损伤。生物医学样品为了满足扫描电镜的观察要求，必须严格按照制作程序制作，含水的和不含水的样品制作方法是不同。
组织表面的污物粘附牢固的样品，不能单纯用这种方法进行清洗。（3）、超声波清洗法。对那些表面污物较多、形态结构复杂的样品，采取一般方法很难清洗干净时，可用本法进行清洗。但是所选用的频率和功率一定要合适，否则，会损伤样品。一般情况下功率用 20～25瓦；频率用5000～25000Hz,清洗0.5～15分钟就可以。（4）、水解蛋白酶清洗法。对组织表面粘附的蛋白类物污，可用适当浓度的相应的水解蛋白酶水溶液清洗。但使用的浓度和清洗的时间要严格掌握。除上述几种方法外，有时还可以选用吐温－20 生理盐水溶液清洗。生物扫描样品的清洗很重要，样品制作时必须认真对待。

扫描电镜的样品制备

扫描电镜的样品制备3.1 试样制备技术试样制备技术在电子显微术中占有重要的地位，它直接关系到电子显微图像的观察效果和对图像的正确解释。

如果制备不出适合电镜特定观察条件的试样，即使仪器性能再好也不会得到好的观察效果。

和透射电镜相比，扫描电镜试样制备比较简单。

在保持材料原始形状情况下，直接观察和研究试样表面形貌及其它物理效应（特征），是扫描电镜的一个突出优点。

扫描电镜的有关制样技术是以透射电镜、光学显微镜及电子探针X射线显微分析制样技术为基础发展起来的，有些方面还兼具透射电镜制样技术，所用设备也基本相同。

但因扫描电镜有其本身的特点和观察条件，只简单地引用已有的制样方法是不够的。

扫描电镜的特点是：①观察试样为不同大小的固体（块状、薄膜、颗粒），并可在真空中直接进行观察。

②试样应具有良好的导电性能，不导电的试样，其表面一般需要蒸涂一层金属导电膜。

③试样表面一般起伏（凹凸）较大。

④观察方式不同，制样方法有明显区别。

⑤试样制备与加速电压、电子束流、扫描速度（方式）等观察条件的选择有密切关系。

上述项目中对试样导电性要求是最重要的条件。

在进行扫描电镜观察时，如试样表面不导电或导电性不好，将产生电荷积累和放电，使得入射电子束偏离正常路径，最终造成图像不清晰乃至无法观察和照相。

3.1.1 块状试样制备1．导电性材料导电性材料主要是指金属，一些矿物和半导体材料也具有一定的导电性。

这类材料的试样制备最为简单。

只要使试样大小不得超过仪器规定（如试样直径最大为φ25mm，最厚不超过20mm等），然后用双面胶带粘在载物盘，再用导电银浆连通试样与载物盘（以确保导电良好），等银浆干了（一般用台灯近距离照射10分钟，如果银浆没干透的话，在蒸金抽真空时将会不断挥发出气体，使得抽真空过程变慢）之后就可放到扫描电镜中直接进行观察。

但在制备试样过程中，还应注意：①为减轻仪器污染和保持良好的真空，试样尺寸要尽可能小些。

②切取试样时，要避免因受热引起试样的塑性变形，或在观察面生成氧化层。

扫描电镜制样技巧

2.陶瓷样品清洁：
陶瓷在烧结时有正反面之分，拿出来时一定注意不要将反面拿来观察。陶瓷样品在预烧处理时会加上一定的粘结剂，如要观察陶瓷的结晶颗粒，也需要用一定量的酸或碱将所要观察的陶瓷面浸泡，做热腐蚀处理，将粘结剂溶蚀掉，才能观察到陶瓷的晶粒。水泥等块状样品也是一样的道理。
超细陶瓷的制样
• 陶瓷表面与样品座铜柱之间用导电胶连接
水泥或陶瓷自然断面样品之间用导电胶连接
大块不导电或纤维样品多为粉末状，制备样品时应该保证粉料与样品台粘劳（特别要控制样品的量，保证样品不重叠），否则样品在真空中飞起污染电镜。另外粉末状样品容易团聚，制备过程应该尽量使其分散。目前常用的分散方法有：干法、湿法
• 常用的方法是取0· g左右的粉末放在一 5 块玻璃板上,藉多次的四分法达到约0· g 01 左右,将粉末样品置于样品台上,滴几滴分散液,用刮勺或玻璃棒进行揉研,使样品分散,待液体挥发后观测,这种传统的制样方法存在着许多缺点:
• (1)如果揉研过程不适当,颗粒不但达不到分散, 反而会团聚。 • (2)若颗粒较脆时,导致颗粒粉碎,测量结果失真. • (3)对于扫描电镜,常用的挥发性液体有松节油、甘油、液体石蜡等带粘滞性液体,在使用此类液体时,对揉研分散过程起润滑作用,颗粒能较牢地粘结在样品台上,但成像清晰度较差.
• 溶液均匀法 • 细粉末的分散好坏是决定测量结果准确性的重要因素。当粉末粒子为0·5~4μm和细微粉末粒子小于0·5μm时,其表面活性很大,常常是以互相粘附的二次粒子状态存在。若用直接撒粉法往往聚集在一起,造成测定结果的假象,使测定偏粗。
粉末样品平整的铺在碳导电胶上
2.湿法
湿法适用于亚微米或纳米级粉料，此类粉料的分散是个难题，常用超声分散法。超声分散液有酒精、蒸馏水、洗洁精、六偏磷酸钠、丙酮、苯等，还有粘滞性的物质，如液体石蜡、钟表油、松节油等，还有能形成固体膜的物质，如醋酸、酯火棉胶溶剂、“C－N”共晶溶液等。针对不同的样品自行选择，以样品不溶于该溶液并能达到分散为目的。在使用蒸馏水和挥发性的分散介质时，用量多少不影响微粒的成像，视场也比较清晰，但它不能将样品牢固的固定在样品台上，容易造成颗粒脱落。而粘滞性的分散介质，用量必须合适，用量多了会发生粒子由于相互碰撞而团聚在一起。同时油膜对光有吸收作用，会影响视场的清晰度。对于极性极强而易于团聚的超细颗粒，往往需要在分散剂中加入一定的分散助剂。分散时间不小于30分钟。样品的分散程度取决于样品的特性、分散浓度和超声时间。

扫描电镜制样技术

• 锇酸浸透性慢不强，较长时间处理，会破坏生物样品精细结构。需根据样品情况，灵活掌握锇酸处理样品时间。
直接观察法
直接观察法
• 特点：简便、快捷，损伤较少，比较常
用。
• 1．固体样品直接观察法：含水成
分少，本身比较干燥且又有一定的导电能力的固体样品。 • 如：骨骼、牙齿、矿石、土壤、干果、竹木以及植物的干标本等。 • 直接用普通胶水或双面胶带等将样品粘到样品台上，省略喷涂就可用扫描电镜观察。
离子溅射法和真空喷镀法比较
附：导电染色
• 导电染色------将极细的金属颗粒植入生物样品中，以增强样品导电性的电子染色过程。
• 要求：染液既不污染组织、又能完好保存组织的精细结构，并且使样品有良好的导电性。 • 特点：经导电染色样品，释放较多的二次电子，加强图像的亮度和反差。 • 常用导电染液：缓冲液／固定液配制而成，同时具有固定作用。
3．注入液体二氧化碳困难：
• 样品室温度高，没有事先降温。 • 降温办法： • 一是用少许液体二氧化碳充盈2—3 次，再放掉气化的二氧化碳； • 二是用控温钮调至低于当时室温 10℃。
冷冻干燥
• 样品中的水分直接由冰态升华为气态，样品也不受表面张力的影响。优点：保存水溶性和脂溶性物质。不足：样品中的水分易形成冰晶而破坏超微结构。
游离细胞的观察法
• 关键：如何把样品粘在样品台？
• 1．滤纸吸附法： • 用1％戊二醛／缓冲液固定---1 000g 10min离心---去上清---细胞浓悬液滴在一小片滤纸上---系列乙醇脱水---临界点干燥---喷涂----观察。 • 优缺点：简便易行，图像中容易混杂滤纸纤维。
2．金属片法 • 与第一种方法类似； • 只是将细胞浓悬液滴在有微孔的金属片上(微孔直径4 µm)； • 进行一系列操作。 • 优点：可以减少污染

扫描电镜样品制备显微镜课件

电子显微镜
电子显微镜可以用于对制备好的样品进行高倍率观察和分析。通过电子显微镜可以更加清晰地看到样品表面的微观结构，并且可以对不同区域进行成分分析和晶体结构分析等。
02
扫描电镜原理与操作
工作原理简述
电子光学系统
利用电子枪发射的电子束，经过电磁透镜聚焦后，扫描样品表面并接收散射电子，形成放大的图
指导学生记录实验数据，包括样品的形貌、结构等信息，并进行分析和讨论。
实验结果讨论与分享
实验结果展示
要求学生将实验结果进行展示，包括样品的形貌、结构等信息，以便其他同学互相学习和交流。
问题讨论与解答
针对学生在实验过程中遇到的问题进行讨论和解答，加深学生对实验原理和方法的理解和掌握。
电化学抛光
通过电解抛光液去除金属表面的微观不平整和氧化物，获得镜面效果。
非金属样品处理方法
清洗
使用去离子水、乙醇或其他溶剂清洗非金属样品表面，去除污渍
和油脂。
干燥
采用自然干燥、热风干燥或冷冻干燥等方法，确保非金属样品表
面干燥无水分。
镀导电层
对非导电性非金属样品表面镀导电层，提高扫描电镜成像质量。
元素分析
通过电子显微镜配备的能谱仪，对样品进行元素成分分析。
晶体结构鉴定
利用电子衍射技术，鉴定样品的晶体结构和相组成。
原子力显微镜辅助操作技术
纳米级操作
利用原子力显微镜的纳米级操作能力，对样品进行精确制备。
力学性能测试
通过原子力显微镜的力学测试功能，研究样品的力学性能。
表面形貌表征
利用原子力显微镜观察样品的表面形貌和粗糙度。
开机校准
启动扫描电镜系统，进行光路校准和像散校正，确保图像质量。