扫描电镜制样方法-研究生
扫描电镜SEM制样步骤
扫描电镜S E M制样步骤-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN扫描电镜观察制样步骤固定：1、用灭菌镊子挑出少量的的样品（碳粒/碳毡）,放入 5ml 的离心管中,2、加入2.5%戊二醛, 加量为淹没碳粒/碳毡样品为宜,室温固定1小时3、置于 4℃冰箱中固定12小时。
冲洗：用 0.2mol pH 7.4的磷酸缓冲溶液冲洗 3 次，每次 10 分钟。
每次冲洗时先用注射器缓慢吸走上一步骤的冲洗液。
Or 离心脱水：分别用浓度为30%， 50%，75%，90%, 95%, 100% v/v 的乙醇进行脱水，每次10分钟，干燥：将样品放在离心管里，置入干燥器中干燥 12 小时。
粘样：用双面胶将样品观察面向上粘贴在扫描电镜铜板上预处理好的样品放入干净离心管中待检。
SEM上机测样--测定条件参数设置分子克隆实验指南第三版，1568页：25度下0.1mol/L磷酸钾缓冲液的配制；先配0.1mol/L K2HPO4，0.1mol/L KH2PO4配PH7.4，100ml磷酸钾缓冲液需：0.1mol/L K2HPO4，80.2ml0.1mol/L KH2PO4，19.8ml混合即是，不用酸碱调PH。
参考文献：DOI:?10.1021/es902165yMicrobial fuel cell?based on Klebsiella pneumoniae biofilmSelecting?anode-respiring bacteria based on?anode?potential: phylogenetic, electrochemical, and?microscopic?characterizationA severe reduction in the cytochrome C content of?Geobacter sulfurreducens?eliminates its capacity for extracellular electron transfer2。
场发射扫描电镜的样品制备和操作步骤
场发射扫描电镜的样品制备和操作步骤场发射扫描电镜（Field Emission Scanning Electron Microscopy）是一种高分辨率的电子显微镜技术，可用于观察和分析各种材料的表面形貌和微观结构。
为了获得清晰的显微图像，样品制备和操作步骤非常重要。
一、样品制备1. 样品的选择：场发射扫描电镜适用于不同种类的材料，如金属、陶瓷、聚合物等。
选择合适的样品很关键，它应具备研究对象的特性，并且能够承受电子束的辐照。
2. 样品的固定：为了保持样品的形状和结构不变，通常需要将其进行固定。
对于固态材料，可以使用金属夹片或导电胶进行固定。
对于液态材料，可以将其冷冻或凝胶化，以保持其形状。
3. 样品的切割和打磨：有时候，需要将样品切割成适当的尺寸，以便放入样品架中。
这可以通过使用金刚石切割机、电解或机械研磨仪器等设备来完成。
4. 样品的真空处理：在将样品放入场发射扫描电镜前，通常需要将其进行真空处理。
这可以通过将样品放入真空干燥器中、在低压下进行加热或冷冻干燥来完成。
真空处理有助于去除空气中的水分和气体，以减小背景干扰。
二、操作步骤1. 打开电镜系统：在开始操作前，需要将场发射扫描电镜系统打开并进行预热。
预热时间通常需要几十分钟，以保证系统内部达到稳定的工作温度。
2. 放置样品：将样品放置在样品架上，并确保其良好接触。
对于粉末状样品，可以使用导电胶将其固定在样品支架上。
对于固态样品，可以使用金属夹片固定在样品架上。
3. 调整显微镜参数：通过调整电子束能量、聚焦、工作距离等参数，来优化扫描电子显微镜的成像质量。
这些参数的选择取决于样品的特性和所需的分辨率。
4. 开始观察：一切准备就绪后，可以开始观察样品。
通过控制电子束的扫描和探测系统，可以获得样品的表面形貌和微观结构的信息。
在观察过程中，要注意避免样品表面的污染和损坏。
5. 数据分析：场发射扫描电镜获得的图像可以进一步进行数据分析。
可以通过对图像进行增强、测量尺寸和形状、进行结构分析等手段，来得到更详细的样品信息。
扫描电镜样品制备
扫描电镜样品制备扫描电子显微镜生物样品制备技术无论是透射电镜或是扫描电镜，样品均处于电镜镜筒的真空之中。
而大多数的生物样品都是柔软而且含大量水分的。
因此，也和透射电镜的样品一样，在进行扫描电镜观察前，必须对生物样品作相应的处理。
扫描电镜的功能很多，不同的功能对样品的要求不同。
例如二次电子像与背散射电子像和吸收电子像对样品的要求基本相同，而与X射线微区分析对样品的要求相差较远。
我们首先介绍二次电子像的生物样品制备技术。
此外，由于样品的性质不同，其处理方法和程序也有不同。
主要分两大类，一类为含水量少的硬组织，如毛发、牙齿及植物的花粉、孢子、种子等。
此类样品一般含硅质、钙质，角质，砝琅质和纤维素等成份，所以通常只经过表面清洁、装台(粘胶)、导电处理等简单过程即可进行观察。
如要观察其断面或内部结构时，经断裂、解剖或酶消化、蚀刻等再装台、镀膜处理，即可进行观察拍照。
另-类为含水分较多的软组织，如大多数的动植物器官、组织及细菌等均属此类。
对于此类样品，在金属镀膜前，一般都需经过固定、脱水、干燥等处理，如不经处理或处理不当，就会造成样品损伤和变形，出现各种假像，因此对每一处理步骤都应给予重视。
但是，不管是那一类样品的制备，都应达到以下要求：∙尽可能保持样品活体时的形貌和结构，以便如实地反映样品本来面目。
∙在样品的干燥过程尽可能减少样品变形。
∙样品表面应有良好导电性能和二次电子发射率，以防止和减少样品的荷电效应。
样品的前期处理扫描电镜样品的前期处理主要包括表面清洁、固定、漂洗和脱水等过程。
而每一过程的处理方法基本上都是沿用透射电镜样品的处理方法的，所以，这里不一一再作详述。
但是，由于两种电镜观察的要求不同，因此，在处理中也有不同之处：1. 透射电镜主要研究样品的内部结构要求内部结构保存好，因而样品宜尽可能小使固定液能迅时渗入固定。
扫描电镜观察表面形貌，而且为了操作方便选取较大样品。
一般在8～10mm2左右，高度可达5mm。
11.第六章 扫描电镜样品制备技术
（2）、冷冻干燥法：本方法是将新鲜的样品或经固 定、脱水的样品迅速冷冻后，放入真空环境中，使 玻璃态的冰直接升华跑掉，最终样品干燥。在样品 的干燥过程中不存在液体的挥发，也就消除了液体 表面张力的作用了，从理论上讲可以最大程度的保 存样品的原始形貌。但是本法的干燥速度太慢，有 人做过试验一块0.5平方毫米生物样品，在－80度中 干燥需要24小时。，如果样品块再大一些干燥需要 的时间会更长。所以本法在扫描样品制备时也不常 用。 （3）、莰烯低真空干燥法：莰烯是一种具有樟脑味， 无色透明的结晶。能溶于醚、环己烷、氯仿和丙酮 中，它在室温下为固态，遇空气很易升华，升华的 速度与温度成正比。
D.样品筐的底部和顶部要盖一层滤纸，防止样品 的污染。 E.严格控制操作温度和压力，严守操作规程。 F.保证所用二氧化碳的纯度，不纯会使干燥失败。
5、粘托
样品干燥后，需要用胶粘物质将干燥的样品粘 到样品托上。 1）、粘托时所选用的胶粘物质应具备以下条件： （1）、有一定的粘度，在室温下易干燥。 （2）、具有较低的电阻率，导电性能好，颗粒细。 （3）、干燥后收缩率小，胶膜平滑。 （4）、化学性质稳定，受电子束轰击不分解。
1）、取材的方法
动物和植物组织的取材：方法与超薄切片的取材 基本相同，只是因为扫描电镜主要是观察组织的游离 表面形态结构，因此在取材时一定要保护好所需要的 游离表面的部位，不能造成任何损伤；另外所取样品 块可稍大一些，一般观察面大小可在长X宽大约为 3X5毫米（可根据样品的性质变化取材的大小）。 离体培养的细胞取材：可在接种时把处理好的盖 玻片放在培养瓶内，让细胞长在盖片上，把带有细胞 的盖片直接进行制样处理。 细菌的取材：平板和斜面培养的，可用牙签取菌 落涂到干净的盖片上，进行制样。 悬液培养的细胞或细菌要离心收集细胞或细菌， 然后再进行制样。
扫描电镜细菌制样方法
细菌样品前处理取液体或固体培养基中培养20h左右、旺盛生长的菌体。
（1)收集菌体:①液体培养基中的菌体，可取培养液8000rpm离心3～5min，弃上清,倒入2。
5％戊二醛固定液;②固体培养基上的菌体，可在菌落表面滴几滴戊二醛固定液,轻刮菌落（注意不要刮下培养基)。
将菌液吸入小离心管，离心后换入新鲜戊二醛固定。
(2）固定，脱水按常规方法。
2.5%戊二醛,2～4h→磷酸缓冲液清洗3次→1%锇酸4～6h →缓冲液清洗3次→乙醇梯度脱水，30％,50％,70%,85％，95％各一次,100％乙醇2次,15～20min/次→乙酸异戊酯置换2次,20min/次（注意：每步均需离心,8000rpm，3～5min，弃上清，倒入下一种试剂，滴管来回吸几下,打散菌块）。
（3）临界点干燥：普通定性滤纸裁成35mm×18mm的纸条,将长边35mm平均分成3份，对折成小纸包,用订书钉将一端订牢,成小口袋状.将离心浓缩后的菌液滴入小纸包,立即用钉书器将另一端钉牢。
放入临界点干燥器样品室,进行CO2临界点干燥。
一般每次可同时处理10~20种不同菌样(注意，需用液态CO2置换2～3次）。
(4）离子溅射金：沿两端书钉剪开滤纸包，将干燥后粉末状纯菌体倒入平皿，轻摇尽量分散菌体。
碳导电胶带一面粘在1/4盖玻片上，另一面倒扣轻压在菌体粉末上,翻正后用镊子或牙签将菌体轻轻刮薄铺平。
离子溅射金后,即可进行扫描电镜观察。
细菌样品特殊制备方法；1，固体培养基中的菌体用镊子夹一小块盖玻片，轻轻放在旺盛生长的菌体上，粘附一定的细菌.然后用双面胶将此盖玻片贴在棕色瓶瓶盖内壁，在棕色瓶内加入适量1％锇酸，盖上含有样品的瓶盖,熏蒸固定2h以上。
然后用双面胶将盖玻片粘在样品台上，喷金,进行扫描电镜观察。
2，液体培养基中的菌体取一定的培养液，8000rpm离心3~5min,弃上清液，加入2.5％戊二醛固定2h,pH 7。
2磷酸盐缓冲液清洗，然后加入蒸馏水稀释，充分混合后用滴管取混合液一滴于小块盖玻片上，吸附2min，用滤纸吸去多余溶液。
扫描电镜细胞样品制备步骤
扫描电镜细胞样品制备步骤嘿，咱今儿就来讲讲扫描电镜细胞样品制备那些事儿哈！
你想想看，细胞那么小的玩意儿，咱要想好好观察研究它们，可得下一番功夫呢！就像咱要给一个小娃娃打扮得漂漂亮亮去参加重要活动一样。
首先呢，得把细胞好好地收集起来。
这就好比去果园摘果子，得小心翼翼地把果子从树上摘下来，不能弄伤了它们。
咱得用合适的方法把细胞从它们生长的地方轻轻地取出来，可不能太粗鲁啦！
然后呢，就是给细胞洗个澡啦！把它们身上那些不需要的杂质啥的都洗掉，让它们干干净净的。
这就像是咱自己洗澡一样，把身上的脏东西都洗掉，清清爽爽的。
接下来，就是固定啦！这可重要得很呢！就好像给细胞穿上了一件坚固的铠甲，让它们能保持住自己的形态，不会东倒西歪的。
不然等会儿咱观察的时候，它们都变形了，那可咋整呀！
再之后，就是脱水啦！把细胞里面多余的水分都去掉，就像咱把湿漉漉的衣服晾干一样。
这一步可得仔细着点儿，不能让细胞受损哦！
接着呢，是干燥啦！让细胞处在一个干燥舒适的环境里，这样它们才能好好地被我们观察呀！
再往下，就是镀膜啦！这就好像给细胞披上了一层神秘的外衣，让它们在电镜下能更好地显现出来。
最后，就可以把制备好的细胞样品放到扫描电镜里面去观察啦！哇塞，你能想象到吗，通过电镜看到细胞的那一刻，就好像打开了一个微观世界的大门，里面有着无数的奥秘等着我们去探索呢！
你说这是不是很神奇呀？咱通过这一步步的操作，就能看到细胞的各种奇妙之处啦！所以呀，可别小瞧了这扫描电镜细胞样品制备的步骤哦，每一步都马虎不得呢！咱得像对待宝贝一样精心地去处理这些细胞，这样才能得到最准确、最有价值的观察结果呀！这可不是闹着玩的事儿呢！大家可得认真对待哟！。
扫描电子显微镜的样品制备一些技术
2.样品室内压力达不到要求： （1）注入液态二氧化碳量过少：可能会使样品位于二氧 化碳的气液面交界处，样品受到液体二氧化碳表面张力的 作用，尽管比水的表面张力小的多，但仍会影响样品的精 细结构。 （2）样品室密闭不良：这可能是因为垫圈老化，有裂纹， 或垫圈下有异物等。 3.注入液体二氧化碳困难：主要因为样品室的温度高，没有 事先降温。夏季室温高于30度时更易造成注入困难。降温 的办法有两种：一是用少许液体二氧化碳充盈2-3次，再 放掉气体的二氧化碳；二是用控温钮调制低于室温10度。
脱水处理：对保证金属镀膜装置和电镜的镜筒真空度和防止 样品在高真空状态下的龟裂和变形等有重要的作用。采用不 同浓度的乙醇或丙酮梯度脱水逐步的除去样品中的水分。
6.2.2 样品的干燥：
1. 自然干燥法：把样品暴露在空气中直接干燥，只适用于表 面比较坚硬或含水分较少的生物样品。如：昆虫、骨骼、牙 齿、毛发、种子、果壳、花粉、植物标本，以及微小材料如 细菌等。具体做法是：先将样品固定，并系列脱水到100％， 在大气中让脱水剂自然挥发即可，但注意环境要干燥。因为 脱水剂的表面张力系数比水小所以样品在脱水剂中不会过多 变形而影响其结构。
6.1.4常规生物样品制备技术
制备过程如下： ①取材 根据需要，切取适当大小的样品。专门的SEM备有 灵活可动，范围较大的样品台，样品可大些。装在透射电 镜上的扫描附件，活动范围较小，样品直径应在3～4mm左 右。 ②漂洗 用缓冲液把组织表面洗净，否则会影响正常形态， 但以快速和轻巧为宜，尽量保护器官或组织的表面结构， 使其不致因不慎的操作造成人为损伤。 ③固定 用2.5～5％戊二醛/缓冲液在室温或4摄氏度下前固定。 具体时间可根据样品的需要而定，一般单细胞10-30分钟， 较大的或较硬的样品可达1-2h或更长时间。 ④漂洗 用缓冲液洗3次，洗去未结合的戊二醛。 ⑤重固定 1％锇酸/缓冲液4摄氏度下后固定10～60min。有 时为了提高样品的反差和固定效果，可以综合固定液，如 随意选用戊二醛、多聚甲醛、锇酸等按照不同的比例混合 使用。
扫描电镜的样品制备
扫描电镜的样品制备
扫描电镜（Scanning Electron Microscope，SEM）是一种高分辨率的显微镜，对于复杂的样品结构、微观形态和表面形貌的分析非常有用。
然而，要获得良好的扫描电镜显像效果，样品的制备至关重要。
下面将介绍几种常用的扫描电镜样品制备技术。
1. 金属喷涂法
金属喷涂法是扫描电镜样品制备的经典方法。
该方法使用金属喷涂仪将金属颗粒喷在样品表面，使其形成一层均匀、导电性良好的金属膜，以便在扫描电镜中观察样品的表面结构。
该方法适用于非导电样品，如细胞、生物组织、聚合物等。
2. 离子切割法
离子切割法利用离子切割机将样品切割成纤细的薄片，以便于在扫描电镜中观察。
这种方法适用于非常薄的样品，如材料薄片、芯片等。
它可以提供非常高分辨率的图像，并且可以通过纵向切割获得样品的三维结构。
3. 冷冻切片法
冷冻切片法是一种用于生物样品的扫描电镜制备方法。
该方法使用超低温技术将样品冻结，并使用超薄刀片切割成极薄的切片，通常为50~200纳米。
这可以保留样品的水感性和原始形态，并使其在扫描电镜中观察更加清晰。
4. 化学蚀刻法
化学蚀刻法是用于金属样品的扫描电镜制备方法。
该方法使用酸或碱对样品表面进行蚀刻，以去除不需要观察的材料，形成清晰的样品结构。
该方法适用于金属薄膜、晶体和合金等金属材料。
总之，良好的扫描电镜样品制备是获得高品质扫描电镜图像的关键。
每种样品都有其独特的制备方法，为了获得最好的结果，在选择合适的制备方法时需要谨慎选择。
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2.镊子镊住铜网或微栅在超声溶液中捞一下，将铜网或 微栅再粘到样品座上
3.将铜网或微栅置于干净的滤纸上，将超声分散溶液 用滴管滴在铜网或光栅上
4.用吸管将样品直接滴在样品台或导电胶上
五. 喷镀物质的选择
常用的喷镀物质有：碳棒、金、铬、铂、 银、铜等 能谱分析时，尽可能选择样品不含有的元 素来做镀层，如测试AuAg矿，不能喷金， 测试方解石，不能喷碳
优缺点：关键在于导电胶涂敷要均匀, 平整,尽可能薄一些,否则会造成视场起 伏或颗粒下陷于胶体内,造成立体失真
使用导电液需要一定的技巧，特 别是一些粉末样品，要在导电液 干到合适程度时撒粉末，太早则 会淹没样品，太干则起不到固定 的作用。对固体样品和大颗粒粉 末可起到较好的固定作用.
湿法分散后粉末样品固定
影响定量分析结果不确定性的因素
二、样品的清洁处理 样品表面常常附着灰尘、硅酸盐或油污，特别是经过 切割或敲碎的样品，粘有大量浸染物和碎片，可用洗耳 球吹拂或者将样品放入盛有酒精或丙酮的容器，超声清 洁至少10 min，若溶液仍污浊，还要更新溶液重复超声。 1.金属材料样品清洁 陈旧的金属材料表面多有锈斑或浸染物覆盖 利用蘸有丙酮的AC纸（醋酸纤维素膜）紧压表面，待 其干透后把AC纸剥下 将样品放入丙酮中超声清洗 粘油污的元器件可用酒精或丙酮擦洗后超声
表面无油污和复盖物（如从器械上拆卸下来的元件， 一定要将油污清洗干净；如地质类的薄片，需将盖 玻片去除，并将其表面的粘胶用酒精不断反复洗 净）。 表面平整光滑，如成分不均一者，分析结果只能是 代表测试点小于１平方微米的结果；做微区分析时 是微区区域范围的平均值。
另外有一种成分衬度像：也叫背散射电子像，如果样品 是由二种以上的物质相组成，则可以获得成分衬度像。 背散射电子像既可以用来显示形貌衬度，也可以用来显 示成分衬度。成分衬度是由试样微区的原子序数或化学 成分的差异所形成的。
有一定高度的样品，特别是要观察样品的断面时， 一定要用样品夹持台将其固定，最好能保证直立 状态，以保证样品在成像过程中不产生晃动。一 些不规则的样品可自制专用样品夹持台，利用螺 钉从几个方向固定样品。这和断面样品的固定一 样。
四、粉末样品
颗粒或细纤维样品多为粉末状，制备样品时应该保证 粉料与样品台粘劳（特别要控制样品的量，保证样品不 重叠），否则没有粘劳的样品在电子枪的冲击下飞溅污 染电镜腔体。另外粉末状样品容易团聚，制备过程应该 尽量使其分散。目前常用的分散方法有：干法、湿法
在实际中有应用价值的是，例如在陶瓷中掺入Ag，如想了 解Ag的分布情况，将陶瓷磨平抛光后进行Ag面或线扫描分 析，根据面分布情况或线曲线结果可知其在面或线上的分 布情况，非常直观。
元素含量的线扫描
做能谱分析时，如样品是粉末，则微米级粉末直接粘在 导电胶上，纳米级粉末样品需压成片状、块状
对样品中Na以后的元素进行半定量分析，对样品的要求 是：
一、能谱样品制样要求 扫描电镜能谱分析，能对样品进行微区化 学分析，对于表面平整光滑的样品测试精 度能达到半定量分析要求，而轻元素（Ｂ、 Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｆ）仅能定性，即确定有无 该元素与否，而对于不平整的样品，则测 试精度较差，有些人将球状或不规则的样 品，试图对其进行线、面扫描，以期了解 成分的轻微变化，这种研究方法没有实际 意义。
4.不导电样品可从样品表面粘一个导电胶带或电导液延申至 样品座上表面，在样品表面与样品台之间形成导体。
5.断面样品的安装
6.其他注意事项
2.如是薄膜或陶瓷等平整样品，则可用牙签蘸碳导 电液在样品表面画十字架，导电效果会得到提高。
3.导电液、导电胶同时使用来固定样品
4.对于一些球状样品，需要照大倍数照 片，一定要用导电液将其固定好，并充 分干燥后测试。
1、干法 干法适用于安装数微米级的大颗粒，制备步骤为“撒、刮、 吹”三项。
直接撒粉法 将粉末直接撒在清洁光亮的样品台、导电截片上或 导电胶、导电液上 把试样台水平轻轻晃动几下,使试样分布平整、均匀 用吸耳球吹，观察样品分布情况，如需照 小倍数照片，最好在样品台一角撒较密集 的样品 用电热风吹干或用电子枪吹掉没有粘劳的粉末 优缺点：制样方法简单,但均匀性差, 适应于一般要求粗颗粒样品的观察
橡胶是粘弹性物质,又是绝缘体，既会产生弹性，又极 易产生荷电现象，要进行扫描电镜分析，其样品的前 处理非常关键。
三、固体样品的安装步骤 1.将导电双面胶带（碳或铜）粘在样品台面上
2.剥去面纸，露出胶面
3.把样品直接粘到胶带上，粘结时要确保 底面与胶面贴实，为此要求样品贴面保持 平整，不平整可以事先用砂纸磨平，并将 底部的粉末擦净。也可以用导电液抹在样 品座上，然后将样品沾上会更牢固些。
导电性特差的物质或样品表面粗糙样品（如高分子 材料）：喷金效果好
半导体：喷碳、金都可以 照相倍数大于50K：建议喷碳或铬，金粒度大于50K时可见
购买铜网时注意使用要求
谢谢！ 请提宝贵意见
扫描电镜制样方法
朱文凤
桂林理工大学材料学院
2015-11-27
1.能谱样品的制样方法 2.样品的清洁处理 3.固体样品的安装 4.粉末样品的固定 5.喷镀物质的选择
测试须知： 1. 磁性粉末物质不能测试（块状强磁性需 消磁后方能测试） 2.液体不能测试（如液体中含粒状物，干 燥后或用铜网捞出晾干后方可测试） 3.有毒物质（测试完毕需自行带走样品处 理） 4.所有样品最好能在100度下干燥1-3小时 或在白炽灯下照射3小时以上或自然风干 半天（特别是用导电液一定要干燥）
2.陶瓷样品清洁 陶瓷在烧结时有正反面之分，拿出来时注意不要将反面 拿来观察
3.生物样品处理 针对观察目的不同对样品进行处理
4．镀膜样品处理 由于镀膜样品容易脱落，在制样过程中要特别注意裁截 方式，如镀件较小往往可以直接观察，如样品较大用剪 刀裁剪的话，应尽量观察样品的中心部位。
5.橡胶样品的制样