植物过氧化物酶的提取、

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洋葱过氧化物酶实验报告

一、实验目的1. 了解洋葱过氧化物酶的分布情况。

2. 掌握测定洋葱过氧化物酶活性的方法。

3. 分析洋葱过氧化物酶在不同处理条件下的活性变化。

二、实验原理过氧化物酶（POD）是一种广泛存在于植物体内的酶，具有催化过氧化氢（H2O2）分解为水（H2O）和氧气（O2）的功能。

在实验中，通过测定过氧化氢分解速率来间接反映过氧化物酶的活性。

本实验采用TMB法测定洋葱过氧化物酶活性，TMB在过氧化物酶的作用下，会生成蓝色的化合物，通过测定蓝色化合物的吸光度，可以计算出过氧化物酶的活性。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：洋葱、蒸馏水、TMB溶液、过氧化氢溶液、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、冰浴等。

2. 实验仪器：分光光度计、电子天平、研钵、移液器、试管等。

四、实验方法1. 洋葱过氧化物酶提取液的制备：取洋葱鳞片叶，用蒸馏水冲洗干净，剪碎后加入磷酸盐缓冲液（pH 6.0），在冰浴中研磨，制成洋葱过氧化物酶提取液。

2. TMB反应体系的制备：取一定量的TMB溶液和过氧化氢溶液，混合均匀，加入磷酸盐缓冲液（pH 6.0），配制成TMB反应体系。

3. 过氧化物酶活性测定：取一定量的洋葱过氧化物酶提取液，加入TMB反应体系，在特定波长下测定吸光度，根据吸光度变化计算过氧化物酶活性。

五、实验结果与分析1. 洋葱过氧化物酶的分布情况：通过对洋葱不同部位（叶片、鳞片叶、茎）的过氧化物酶活性测定，发现洋葱叶片中过氧化物酶活性最高，其次是鳞片叶和茎。

这表明过氧化物酶在洋葱叶片中分布较为集中，可能与叶片的光合作用、氧化还原反应有关。

2. 不同处理条件下过氧化物酶活性的变化：将洋葱过氧化物酶提取液分别置于不同温度（0℃、25℃、50℃）、不同pH值（pH 4.0、pH 6.0、pH 8.0）条件下处理，测定过氧化物酶活性。

结果显示，在适宜的温度（25℃）和pH值（pH 6.0）条件下，过氧化物酶活性最高。

这表明洋葱过氧化物酶活性受温度和pH值的影响较大。

植物过氧化物酶(POD)提取液

北京雷根生物技术有限公司
植物过氧化物酶(POD)提取液
简介：
过氧化物酶(peroxisome，POD)是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，主要存在于细胞的过氧化物酶体中，以铁卟啉为辅基，可催化过氧化氢，氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。该酶属于细胞木质素合成途径中间的关键酶，研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理，为减少水果石细胞含量提高其品质提供依据。
操作步骤(仅供参考)：
1、取植物组织清洗干净，切碎。 2、加入植物过氧化物酶(POD)提取液，冰浴情况下充分捣碎或研磨。 3、离心，留取上清液。 4、冻存，用于物过氧化物酶(POD)的检测或其他用途。
计算：
组织或植物粗酶液获得率(ml)=上清液体积(ml)/组织或植物质量×100%
注意事项：
1、待测样品中不能含有磷酸酶抑制剂，同时需避免反复冻融。 2、所测样本的值高于标准曲线的上限，应用植物过氧化物酶(POD)提取液稀释样品后重
北京雷根生物技术有限公司
新测定。 3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期：12 个月有效。
相关：
编号 CC0007 CS0001 DC0032 DF0135 NR0001 PS0013 TC1167
名称磷酸缓冲盐溶液(10×PBS,无钙镁) ACK 红细胞裂解液(ACK Lysis Buffer) Masson 三色染色液多聚甲醛溶液(4% PFA) DEPC 处理水(0.1%) RIPA 裂解液(强) 尿素(Urea)检测试剂盒(脲酶波氏比色法)
Leagene 植物过氧化物酶(POD)提取液主要用于裂解植物组织，提取植物样品中的过氧化物酶。该试剂仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

过氧化物酶活性的测定实验报告

一、实验目的了解过氧化物酶（POD）在植物生理学中的重要作用，掌握测定POD活性的方法，并分析不同因素对POD活性的影响。

二、实验原理过氧化物酶是一种广泛存在于植物组织中的酶，能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水（H2O）和氧气（O2）。

在实验中，通过测定在一定时间内POD分解H2O2产生氧气的量，来评价POD的活性。

反应方程式如下：2H2O2 → 2H2O + O2本实验采用愈创木酚法测定POD活性。

愈创木酚在POD催化下被氧化，生成对苯醌，进而与氯化铁形成紫色络合物，通过测定紫色络合物的吸光度变化来反映POD的活性。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 植物叶片（如马铃薯、菠菜等）- 过氧化氢（H2O2）- 愈创木酚- 氯化铁- 磷酸氢二钠（Na2HPO4）- 磷酸氢钠（NaH2PO4）- pH计- 离心机- 分光光度计- 研钵- 试管- 移液器- 电子天平2. 实验试剂：- 0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.0）- 0.1 M H2O2溶液- 0.5 M愈创木酚溶液- 0.1 M氯化铁溶液四、实验步骤1. 酶液提取：将植物叶片洗净、剪碎，加入预冷的磷酸盐缓冲液，在研钵中研磨成匀浆。

将匀浆液转移至离心管中，4℃、12,000 rpm离心10分钟，取上清液即为酶液。

2. 测定酶活性：取5支试管，编号为1-5，分别加入以下试剂：- 空白组：0.1 M磷酸盐缓冲液1.0 mL、0.1 M H2O2溶液1.0 mL、0.5 M愈创木酚溶液1.0 mL- 实验组：0.1 M磷酸盐缓冲液1.0 mL、0.1 M H2O2溶液1.0 mL、0.5 M愈创木酚溶液1.0 mL、酶液0.1 mL将各试管混匀，置于37℃恒温水浴中保温5分钟。

取出试管，立即放入冰浴中终止反应。

使用分光光度计在波长560 nm处测定各试管吸光度。

3. 计算酶活性：以空白组吸光度为基准，计算各实验组吸光度变化值（ΔA）。

根据下列公式计算酶活性：酶活性（U/g·min）= ΔA × 0.05 × 10^3 / 酶液浓度五、结果与分析1. 不同植物叶片POD活性比较：实验结果显示，不同植物叶片的POD活性存在差异。

过氧化物酶、过氧化氢酶活性测定方法及试剂配制

过氧化物酶（POD ）活性测定【实验原理】过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中，在有H 202存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚，可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。

【实验试剂】愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）、反应混合液[100mmol/L 磷酸缓冲液（Ph6.0）50mL ，加入愈创木酚28uL,加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液溶解冷却后，加入30%过氧化氢19uL ，混合均匀保存在冰箱中]【方法步骤】（1）、粗酶液的提取称取小麦叶片0.25g ，加20mmol/LKH2PO4 2.5mL ，于研钵中研成匀浆，以4000r/min 离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO4 2.5mL 提取一次，全并两次上清液，所得的即为粗酶提取液(酶活性过高，稀释10倍)。

（2）、酶活性的测定取试管3只，于一只中加入反应混合液3mL ，KH2PO41mL ，作为校零对照，另外三只中加入反应混合液3mL ，稀释后的酶液1mL （如表1），立即开启秒表，于分光光度计470nm 波长下测量OD 值，每隔1min 读数一次（4min ）。

以每分钟表示酶活性大小，将每分钟OD 值增加0.01定义为一个活力单位。

表1 紫外吸收法测定POD 酶活性配置表4.结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以 ΔA 470 /[min · g （鲜重） ]表示之。

也可以用每 min内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示。

POD 总活性[u/g(FW)]=式中：POD 总活性以酶单位每克鲜重表示。

其中 △470=ACK-AE比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。

ACK ——照光对照管的吸光度。

AE ——样品管的吸光度。

Vt ——样品液总体积，mL 。

[指南]过氧化物酶pod的测定

过氧化物酶活性的测定愈创木酚法目的意义过氧化物酶是植物体内重要的呼吸酶类，其活性高低与酚类物质代谢、物抗性密切相关。

通过实验掌握提取POD和测定其活性的方法及其原理。

过氧化物酶催化H202氧化酚类，生成醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的产物。

本实验以愈创木酚为底物，过氧化物酶催化H202将愈创木酚氧化生成茶褐色产物，此产物在470nm波长处有最大吸收峰，故可通过测定470nm波长下的吸光度变化得知过氧化物酶的活性。

三、材料、设备和试剂1．材料马铃薯或小麦芽、未成熟的苹果、新鲜茶叶等。

2．设备 721型分光光度计、离心机、秒表(或手表)、天平、研钵、磁力搅拌器。

3．试剂愈创木酚、30％过氧化氢、20mmol/L KH2PO4、100mmol/L磷酸缓冲液(pH6．0)。

反应混合液配制取100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)50ml于烧杯中，加入愈创木酚28µl，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚完全溶解，待溶液冷却后，加入30％过氧化氢19µl 以，混合均匀，保存于冰箱中。

三、操作方法1．酶液制备称取植物材料1g，加入20mmol/L KH2PO4溶液5m1，于研钵中研磨成匀浆，在33000r/min 下离心10min，上清液转入25m1容量瓶中，残渣再用5ml KH2PO4溶液提取一次，合并两次上清液，定容，混匀，贮于冷凉处备用。

2．比色测定取光径1cm比色杯2只，于1只中加入已混匀的反应混合液3m1，KH2PO4溶液1ml，作为参比液；另一只中加入反应混合液3ml，酶液1m1(如酶活性过高可稀释之)，立即记时并置于分光光度计中。

在470nm下测定光密度，每隔1min读数一次，连续测30min，每次测定前重新用对照校准。

若气温较低，应适当提高室温，以37℃为最适宜。

四、实验结果1．以时间为横坐标，光密度为纵坐标作图。

反应前期过氧化氢酶活性随反应时间直线上升，升到最大值后，其相关曲线出现转折点，转折出现的早晚取决于温度。

一种过氧化物酶的提取方法

一种过氧化物酶的提取方法介绍如下:
过氧化物酶是一种重要的水解酶，在生物医药、食品工业等领域有着广泛的应用价值。

下面我们来介绍一种可行的过氧化物酶的提取方法：
提取方法：
1.准备新鲜植物、肝脏或其他组织或细胞培养物。

2.将组织或细胞用生理盐水洗净，然后切成小块。

3.加入适量的冰冷酒精，浸泡3-4小时，使细胞破裂可释放出过氧化物酶。

4.轻轻搅拌，然后过滤去除细胞残渣，得到纯化的过氧化物酶。

5.使用离子交换色谱和凝胶过滤等色谱方法，对提取得到的酶进行纯化。

6.通过测定酶活性，确定其纯度和酶活性。

7.最后，将得到的纯化酶溶液进行减压冷冻干燥或冻干，存放于低温处备用。

此提取方法的优点在于，具有简单易行、操作方便、纯度较高等特点，同时可以获得良好的酶活性和稳定性。

然而，在实际操作的过程中，还需要注意控制提取温度、时间和酒精浓度等因素，以使提取效果更加理想。

此外，还可以使用其他提取方法，比如超声波辅助提取、酸碱法提取、酶学法提取等，每种方法都有其各自的适用范围和优缺点，需要根据具体情况进行选择。

大豆过氧化物酶的提取与分离纯化研究

2018年8月m i tJournal of Green Science and Technology第16期大豆过氧化物酶的提取与分离纯化研究刘力(武汉华测检测技术有限公司食品实验室，湖北武汉430223)摘要：利用超声辅助法提取大豆过氧化物酶（P O D酶），对大豆不同部位P O D酶含量进行了比较，采用硫酸铵一丙酮沉淀法对P O D酶进行了分离纯化，结果得到的大豆胚芽P O D酶的比活力是豆壳P O D酶的2. 61倍，较豆壳而言大豆胚芽为P O D酶提取的最佳原料。

经硫酸铵沉淀、丙酮沉淀和硫酸锌除杂后，大豆P O D 酶活力为13765.00U/m L,蛋白质浓度为3. 11m g/m L,酶的比活力为4432. 52U/m g,R z值 1. 59,且纯化倍数达38. 30。

同时，经S D S—P A G E电泳分析后，可推断出该大豆P O D酶的分子量大约在65〜95k b之间，且只出现了一个条带，可看出纯化效果较好。

关键词：过氧化物酶;提取；分离纯化中图分类号：Q814文献标识码：A文章编号=1674-9944(2018)16-0256-041引言大豆过氧化物酶（POD)是从豆壳或大豆胚芽中提取的一种活性很高的过氧化物酶，是由单一肽链和卟琳构成的血红素蛋白，脱辅基蛋白分子需与血红素结合能构成全酶[1]。

分子量为37000D,300多个氨基酸残基组成，等电点为3.9,是酸性蛋白质[2]。

大豆POD酶由两个结构域组成，中间是血红素辅基，Kamal[3]等推出由 77%的螺旋、16%的|3 —折叠和p—转角及其它结构组成其结构域。

大豆过氧化物酶和辣根过氧化物酶的结构及作用机理有许多相似之处，都属于植物过氧化物酶超家族的D I类酶[4]。

它们具有相似的三维折叠模式，氨基酸序列有57%的同源性，两者都含有1个色氨酸，2个Ca2+，4个二硫键和8个多糖。

现在，对辣根过氧化物酶的研究较成熟，大豆过氧化物酶的研究甚少。

植物抗坏血酸过氧化物酶的作用机制、酶学及分子特性

植物抗坏血酸过氧化物酶的作用机制、酶学及分子特性一、本文概述植物抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate Peroxidase，AP）是一种在植物细胞内广泛存在的关键酶，其在植物抗氧化防御系统中发挥着至关重要的作用。

本文旨在全面探讨植物抗坏血酸过氧化物酶的作用机制、酶学特性以及分子特性，以期为深入理解植物抗氧化防御系统的运行规律，以及提高植物抗逆性和农业生产力提供理论基础。

我们将详细介绍抗坏血酸过氧化物酶的生化功能，包括其催化抗坏血酸清除活性氧的能力及其在细胞氧化还原稳态中的作用。

接着，我们将深入探讨抗坏血酸过氧化物酶的酶学性质，如酶的动力学特性、抑制剂和激活剂的影响等。

我们将对抗坏血酸过氧化物酶的分子特性进行阐述，包括其基因结构、表达调控以及蛋白质结构等方面的研究。

通过本文的综述，我们期望能够为植物生物学、农业生物技术以及植物抗逆性研究等领域提供有益的参考和启示。

二、植物抗坏血酸过氧化物酶的作用机制植物抗坏血酸过氧化物酶（AP）是一种关键的抗氧化酶，主要作用是清除植物细胞中的过氧化氢（H2O2），以防止氧化应激对细胞造成的损伤。

AP的作用机制主要涉及到酶的催化活性以及其与底物的相互作用。

在AP的催化过程中，抗坏血酸（AsA）作为还原剂，将H2O2还原为水（H2O），而自身则被氧化为单脱氢抗坏血酸（DHA）。

这个过程可以表示为：2AsA + H2O2 → 2DHA + 2H2O。

DHA随后通过抗坏血酸再生系统被还原回AsA，从而维持了AP的催化循环。

AP的作用机制还涉及到其在细胞内的定位。

在植物细胞中，AP 主要分布在叶绿体、细胞质和线粒体等细胞器中。

这些细胞器中的AP通过特定的信号肽序列被定位到相应的位置，从而实现了对特定区域H2O2的高效清除。

AP的活性还受到多种因素的调节，包括光照、温度、pH值以及底物和抑制剂的浓度等。

光照和温度可以影响AP的稳定性和活性，而pH值则可以影响AP与底物的结合能力。

过氧化物酶

综合性实验
植物体内过氧化物酶活性测定及同工酶电泳
过氧化物酶活性测定
一、原理
1. 过氧化物酶[perox idase, POD] ：广泛存在于各种动物、植物和微生物体内。催化由过氧化氢参与的各种还原剂的氧化反应: RH2+ H2O2→2H2O + R 2. POD 分子结构特点：POD 是一种由单一肽链与卟啉构成的血红素蛋白, 脱辅基蛋白分子须与血红素结合才构成全酶。
3. POD的主要生理功能： ◆ 参与活性氧代谢过程； ◆ 参与木质素和木栓质的合成； ◆ 参与生长素的降解。
二、实验材料与试剂 1.材料：玉米幼苗
2.试剂： 0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）；0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH7.0）愈创木酚； H2O2
三、实验步骤
1. 提取酶液：取样品1.0g，加入2ml的0.05mol/L pH5.5的磷酸缓冲液，冰浴研磨，10000rpm，4℃离心后取上清，即为粗酶液。 2. 酶活性测定：采用愈创木酚比色法测定，对照为煮沸5分钟的粗酶液，反应体系包括：0.05mol/L pH5.5的磷酸缓冲液2.9ml；0.05 mol/L愈创木酚1ml; 2%H202 1ml；粗酶液0.1 ml，反应1分钟后，立刻在470nm下，测定OD值。以每分钟在470nm处吸光度的变化0.01为一个酶活单位。 3. 计算酶活性：选取OD值变化较均匀的一段数据，代入公式计算；以每分钟OD值变化0.01作为1个过氧化物酶活力单位（U）。
二、材料、仪器设备及试剂
1.材料：玉米幼苗
2.仪器设备：稳流稳压电泳仪；冷冻离心机及离心管； pH试纸； 3.试剂：（1)分离胶缓冲液（pH8.9）：1mol/L HCl 48ml，Tris36.6g， TEMED0.23ml，加水定容至100ml。 (2)分离胶贮液：30g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，加水溶解并定容至100ml，过滤后使用。 (3)过硫酸铵溶液：过硫酸铵0.2g，加水定容至100ml制胶时现配现用）。 (4)浓缩胶缓冲液：1mol/L HCl48ml＋Tris5.98g＋TEMED0.46ml，调pH6.7，并定容至 100ml。 (5)浓缩胶贮备液：丙烯酰胺10g，甲叉双丙烯酰胺2.5g,加水定容到100ml，使用前过滤。 (6)电极缓冲液：Tris 6.0g，Gly 28.8g，用水定容至1000ml（pH8.3），用前稀释10倍。 (7)四甲基乙二胺（TEMED）。 (8)0.1％的溴酚蓝水溶液。 (9)联苯胺染色母液：联苯胺1g＋冰醋酸18ml＋H2O2ml溶解贮于棕色瓶中。

植物中SOD的分离提取及性质

详细描述
首先，将植物中的SOD进行分离和纯化，然后使用凝胶色谱法进行分子量测定。这种方法利用分子大小不同的蛋白质在凝胶色谱柱中的扩散速度不同，从而分离出不同大小的蛋白质分子。最后，通过与标准分子量的比
较，可以测定出植物中SOD的分子量。
植物中SOD的等电点测定
要中SOD的等电点。
在环保领域的应用
空气净化
SOD具有清除活性氧和自由基的功能，可以用于空气净化。将SOD添加到空气净化器或空调系统中，可以有效地去除空气中的有害物质，保护人体健康。
水质净化
SOD同样可以用于水质净化。将SOD添加到水处理系统中，可以有效地去除水中的有害物质，提高水质。同时， SOD的抗氧化作用还能够抑制水体中有机物和重金属的氧化反应，减少水体污染。
在农业领域的应用
植物育种
SOD在植物育种中具有重要的作用。它能够提高植物的抗逆性，使植物在不良环境下仍能正常生长。通过转基因技术将SOD基因导入植物中，可以培育出具有更强抗逆性的新品种。
农药与肥料
SOD在农药和肥料中也有重要的应用价值。将SOD与其他物质结合制成的新型农药和肥料，能够更有效地提高植物的抗逆性和产量，同时减少对环境的污染。
植物中sod的分离提取及性质
汇报人：文小库
2023-11-13
CONTENTS
• 引言 • SOD概述 • 植物中SOD的分离提取方法 • 植物中SOD的性质研究 • 植物中SOD的应用研究 • 研究展望与挑战 • 参考文献
01
引言
研究背景和意义
植物中SOD（超氧化物歧化酶）的分离提取及性质研究具有重要的理论和实践意义。
要点二
详细描述
等电聚焦电泳法是一种根据蛋白质等电点进行分离的方法。在电场的作用下，不同等电点的蛋白质会聚焦在不同的pH值区域，从而可以根据聚焦位置确定蛋白质的等电点。通过这种方法，可以测定出植物中SOD 的等电点。

植物过氧化物酶的提取、

蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法。
试剂
考马斯亮蓝试剂；标准和待测蛋白质溶液
器材

试管及试管架，移液管（0.1ml及5ml），UV－ 2000型分光光度计。
操作方法：取6支试管，按下表制定标准曲线。
试管编号 0.1mg/ml 标准蛋白溶液/ml 0.15mol/L NaCl/ml 每管中蛋白质浓度μ g/ml 考马斯亮蓝 G250 溶液 A595nm 0 0 1.0 0 1 0.2 0.8 20 2 0.4 0.6 40 5ml 3 0.6 0.4 60 4 0.8 0.2 80 5 1.0 0 100
四、植物过氧化物同工酶电泳技术
实验原理同工酶（isozymes）是指作用于底物相似或完全相同的酶的不同分子形式，即催化同一种反应而结构不同的一族酶。它们是受遗传体系决定的酶的不同分子形式。利用凝胶电泳技术（PAGE）可以将它们分开，用专一的作用底物和特殊染料，把需要分析的酶染色，在胶柱上呈现同工酶谱。实验目的通过实验掌握植物同工酶实验技术，了解植物同工酶分析在遗传学研究中的意义。着重掌握过氧化物酶的提取，电泳与染色技术和分析方法。
2010年9月
一、植物过氧化物酶的提取
目的要求学习制备植物过氧化物酶粗酶液的原理和方法为后续实验提供酶液。器材与仪器电子天平；冰冻高速离心机；可见光分光光度计；电动玻璃匀浆机等。试剂 20mM KH2PO4， 100mM PBS：取0.2M 的Na2HPO4 12.3ml与0.2M的 NaH2PO4 87.7ml混合。加入100ml水稀释即成。
三、植物过氧化物酶活性的测定（比色法）
原理

植物体内过氧化物酶活性的测定

以每分钟光密度（OD470nm）变化0.01为1个过氧化物酶活力单位，即：
w:大麦苗鲜重 t：反应时间 D：稀释倍数，即提取的总酶液为反应系统内酶液的倍数

附注�� 酶的提取纯化需在低温下进行。思考题测定酶的活力要注意控制哪些条件？
（1）保持待测材料的酶活；（2）测定时注意控制反应时间；
操作步骤

1．酶液提取：称取0.5g白菜叶片于研钵中 →加入2ml磷酸缓冲溶液→研成匀浆→转入 10ml刻度试管中→再加3ml磷酸缓冲溶液冲洗研钵→转入10ml刻度试管中→以KH2PO4 溶液定容 →再转入离心管中→4000r/min 4℃下离心15min →倾出上清液至刻度试管中→4℃下保存。
实验二
植物体内过氧化物酶活性的测定
实验目的

学习和掌握过氧化物酶(POD)活性测定的原理及方法。
背景知识

线粒体通过呼吸作用，一方面为细胞各项活动提供能量，另一方面也可通过呼吸链电子传递途径产生超氧阴离子，并通过链式反应形成对机体有损伤作用的活性氧。活性氧（reactive oxygen species，ROS）是超氧阴 –）、过氧化氢（H O ）、羟自由基离子（O2· 2 2 （· OH）和单线态氧（1O2）等几种分子的总称， –和H O 是所有活性氧的源头。其中O2· 2 2 生物体内产生的活性氧若得不到及时清除，就会在细胞中积累，引起细胞凋亡。
操作步骤

2. 取试管2只、1只加入3ml反应混合液， 1m120mmol/lKH2PO4液作为对照；另1中加入3ml 反应混合液，1ml酶液(若活性高则稀释之)，混匀后倒入比色皿中，于分光光度计上测定吸光度值，每隔30s读数一次，波长为470nm，至吸光值变化极微小后停止。

植物过氧化物酶提取及电泳

菜心的花和叶的过氧化物酶的提取、活性测定及同工酶的凝胶电泳分析广州大学生命科学学院洪韬文生物工程1121114200044摘要：本实验分两部分，1：过氧化物酶的提取，:用考马斯亮蓝试剂进行酶液蛋白质浓度的测定，根据标准曲线的方程式，计算出样品的蛋白质含量；2：:通过过氧化物酶活性的测定（愈创木酚氧化比色法），测出的OD值计算出酶活性数值，接着对同工酶的凝胶电泳分析，使它在胶柱上呈现同工酶谱，得出最终实验结果，通过数据记录和拍照记录最终结果。

关键字：过氧化物酶蛋白质OD值同工酶凝胶电泳前言：本实验是在完成基础生物化学实验以后，学生综合运用已经学过的生物化学实验理论和已经掌握的生物化学实验技术进行的一项综合性设计性实验，也是对学生实验动手能力的一次较全面的检验。

POD是一种由单一肽链与卟啉构成的血红素蛋白，脱辅基蛋白分子需与血红素结合才构成全酶。

参与植物POD血红素的合成部位可能象动物一样是在线粒体上。

POD 是一种氧化还原酶，它是由微生物或植物所产生的一类氧化还原酶，POD广泛存在于植物体内，是一种活性较高的一种酶，它与植物的呼吸，光合作用以及生长起着很大的作用。

材料和方法：材料：菜叶，菜花方法：1.植物POD的提取分别称取菜心的花和叶各1~2克，然后剪碎，分别放入研钵，向研钵中加入少许石英砂和3ml KH2PO4，快速研磨，后分别加入离心管中进行离心，离心条件为8500rpm，时间为15分钟。

离心完毕后取上清液，并定容至10ml（刻度试管），***此液即为POD提取液，取5ml冷冻保存，作为电泳的POD样品。

2.蛋白浓度的测定—考马斯亮蓝法标准曲线的制定制作标准曲线回归方程：Y(含量)=aX(OD595值) + b，得出相关系数R2。

3.样品蛋白浓度的测定根据标准曲线的方程式，计算出样品的蛋白质含量。

4.过氧化物酶活性的测定（愈创木酚氧化比色法）备好酶液，将分光光度计调到470nm，取光径1厘米的比色杯2只，向对照杯加反应混合液2.0 ml，KH2PO4 0.5ml，校零点。

植物体内过氧化物酶活性的测定

植物体内过氧化物酶活性的测定一、目的过氧化物酶普遍存在于植物组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能有一定关系，它在代谢中调控 IAA 水平，并可作为一种活性氧防御物质，消除机体内产生的 H2O2的毒害作用。

故在科研上常加以测定。

二、原理在过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶竭色 4 －邻甲氧基苯酚，在470nm 波长处测定生成物的吸光度（ A ）值，即可求出该酶活性。

三、材料、仪器设备及试剂1. 材料：植物叶片2. 仪器设备：分光光度计；离心机；离心管；研钵；移液管；移液管架；试管；试管架；洗耳球。

3. 试剂及配制：0.1mol·L－1磷酸缓冲液（ pH7 ）。

反应液（100ml 0.1mol · L－1磷酸缓冲液（ pH6 ）中加入 0.5ml 愈创木酚、 1ml 30 ﹪ H 2 O 2，充分摇匀）。

四、实验步骤1. 酶液提取称取植物叶片 1g ，剪碎置于已冷冻过的研钵中，加入少量石英砂，分两次加入总量为 10mlpH7磷酸缓冲液，研磨成匀浆后，倒入离心管中，在 8000 r / min 离心 15min ，上清液即为粗酶提取液，倒入小试管低温下放置备用。

2. 酶活性测定吸取反应液 3ml 于试管中，加入酶提取液 0.02ml（视酶活性可增减加入量），迅速摇匀后倒入光径 1cm 的比色杯中，以未加酶液之反应液为空白对照，在 470nm 波长处，以时间扫描方式，测定 3min 内吸光度值变化，取线性变化部分，计算每分钟吸光度变化值（△ A 470 ）。

五、酶活性计算按下式计算酶的相对活性△ A 470 ×酶提取液总量（ml）酶活性（△A470·g－1Fw·min－1） = ————————————————————样品鲜重（g）×测定时酶液用量（ml）。

过氧化物酶活性的测定

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植物生理学实验报告
实验题目：过氧化物酶活性的测定
姓名
班级
四、数据分析
△A470的值太小可能是由于叶片放置过久导致过氧化物酶活性丧失。

五、思考题
1）过氧化物酶在植物体内的主要作用是什么？
答：它与光合作用、呼吸作用及生长素的氧化等都有关系。

在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。

一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。

这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加，所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。

（2）比色时为什么要在3min 内完成。

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答：因为这个反应的速度很快，在一定时间里反应物就被消耗光。

植物过氧化氢酶(CAT)提取液

植物过氧化氢酶(CAT)提取液产品：过氧化氢酶(Catalase ，CAT)又称触酶，是一类以铁卟啉为辅基的结合酶，由四个相同亚单位组成的四聚体酶，共含4分子的亚铁血红素作为辅基，分子量约为24KD 。

CAT 能将细胞代谢产生的毒性物质过氧化氢迅速清除，可与GSH-Px 共同保护巯基酶、膜蛋白、过氧化氢解离。

Leagene 植物过氧化氢酶(CAT)提取液主要用于裂解植物组织，提取植物样品中的过氧化物酶。

该试剂仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

组成：自备材料：1、蒸馏水2、离心管或试管3、匀浆器或研钵4、低温离心机操作步骤(仅供参考)：1、取正常或逆境下的新鲜植物组织(或动物组织)，清洗干净，擦干，切碎，迅速称取。

2、按植物组织：植物过氧化氢酶(CAT)提取液比例，加入预冷的植物过氧化氢酶(CAT)提取液，冰浴情况下充分捣碎或研磨。

3、转移至15ml 离心管, 用植物过氧化氢酶(CAT)提取液冲洗研钵或匀浆器，合并冲洗液至该离心管，补加植物过氧化氢酶(CAT)提取液至。

4、混匀，4℃冰箱中静置10min ，转移离心管上部的清液至新的离心管。

5、离心30min ，留取上清液，上清液即为过氧化氢酶粗提液。

6、4℃保存备用，用于CAT 的检测)的检测或其他用途。

计算：组织或植物粗酶液获得率(%)=上清液体积(ml)/组织或植物质量×100% 编号名称 CS0387 Storage 植物过氧化氢酶(CAT)提取液 500ml 4℃ 使用说明书 1份注意事项：1、待测样品中不能含有磷酸酶抑制剂，同时需避免反复冻融。

2、所测样本的值高于标准曲线的上限，应用植物过氧化氢酶(CAT)提取液稀释样品后重新测定。

3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期：12个月有效。

相关：编号名称CC0007 磷酸缓冲盐溶液(10×PBS,无钙镁)CS0001 ACK红细胞裂解液(ACK Lysis Buffer)DC0032 Masson三色染色液DF0135 多聚甲醛溶液(4% PFA)NR0001 DEPC处理水(0.1%)PS0013 RIPA裂解液(强)TC1167 尿素(Urea)检测试剂盒(脲酶波氏比色法)。

过氧化物酶同工酶的分离提取

和活性)低温保存； 8．上清液缓慢加入2倍体积-30℃预冷的丙酮。4℃放置2h。13000g离心
20min，沉淀。沉淀用 5ml 0.05 M PBS回溶（测含量和活性）低温保存.
本实验以菠菜叶片（或苜蓿种子）为材料，低速离心去除细胞碎片，上清用丙酮或硫酸铵沉淀得过氧化物酶同工酶粗品。
实验材料与器材
（一）材料：菠菜叶片（或苜蓿种子）（二）器材：研钵、超声波粉碎仪、
高速冷冻离心机、酸Байду номын сангаас计
实验试剂
1．丙酮
2．提取缓冲液[pH5.5 0.05M PBS 1L ，需磷酸氢二钠（含12个水）0.1433g、磷酸二氢钠（含2个水）0.7178g]。
过氧化物酶同工酶的分离提取
制作人：王瑞刚
内蒙古农业大学生物化学与分子生物学实验教学中心
实验原理实验材料与器材实验试剂实验步骤
实验原理
过氧化物酶是植物提内普遍存在、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测定这种酶的活性，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
实验步骤
1．精确称取10g左右植物样品（若是苜蓿种子，提前用水溶胀好，） +20ml提取缓冲液匀浆；
2．超声裂解5min； 3．13000g离心20min； 4．取清液（量体积），沉淀弃去（清液少许低温保存测定酶活和含量）； 5．沿烧杯壁缓慢加入等体积-30℃预冷的丙酮，4℃放置1h； 7．13000g离心20min，沉淀用3 ml 0.05 M PBS回溶(留作实验二测含量

第二章实验十一植物中过氧化物酶活性的测定

酶活力测定：
• 打开光度计，预热15分钟左右，并做好比色前的准备工作。
• 在光径为1cm的比色杯内，依次加入2mL 0.1mol/L 的醋酸缓冲液和1ml 0.25%愈创木酚溶液（以上溶液可预先放在25~30℃的水浴中）， 0.2 mL（根据反应情况调整）酶液（用加热煮沸 5 min 的酶液为对照），最后加入 0.1mL 0.75% 的过氧化氢溶液（开始计时）。
• 迅速颠倒混匀并立即把比色杯插入比色架，盖上盖子，每隔 1 min 记录一次在470nm处的吸光度值，共记录5次。
四、计算
以每分钟光密度变化（以每分钟 OD 470 nm变化 0.01 为 1 个活力单位）表示酶活性大小
五、注意事项
酶提取需要在低温下进行；测定酶活力时要保持待测酶液的酶活；测定酶活力时时注意控制反应时间。
➢ 线粒体：超氧阴离子O·-2，是体内O·-2的主要来源； O·-2在线粒体中再生成H2O2和·OH。
➢ 过氧化酶体：FAD将从脂肪酸等底物获得的电子交给O2生成H2O2和羟自由基·OH。
➢ 胞浆需氧脱氢酶（如黄嘌呤氧化酶等）也可催化生成O·-2。
➢ 细菌感染、组织缺氧等病理过程，环境、药物等外源因素也可导致细胞产生活性氧类。
红棕色的物质可用分光光度计在 470nm处测定其消光值，即可求出该酶的活性。
二、实验材料、主要仪器和试剂
酶提取缓冲液：20 mmol/L硼酸缓冲液（pH 8.8），内含5mmol/L亚硫酸氢钠（临用前加）
0.1 mol/L 醋酸缓冲液（pH 5.4） 0.25% 愈创木酚（溶于50%乙醇中）溶液
（临用前配） 0.75% 过氧化氢溶液（临用前配）
三、操作步骤
酶液提取：取植物样品0.5 g（表面水分吸干），剪碎置于研钵中，加入5mL预冷的酶提取液，研磨成匀浆（冰浴），转入离心管，再用2mL提取液冲洗研钵，一并转入10mL离心管，平衡后于10000转/ 分钟离心20分钟（低温）。将上清液倒入刻度试管或量筒，定容至10mL，插入冰浴待测。

过氧化物酶同工酶的提取、分离

④溶液的pH值：影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，
反之越快； ⑤电场强度：
电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快； ⑥离子强度：
离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快； ⑦电渗现象：
电场中，液体相对于固体支持物的相对移动； ⑧支持物筛孔大小：
孔径小，电泳速度慢，反之则快。
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4、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。
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(1)聚丙烯胺凝胶的生成：
聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成。在具有自由基时，Acr和Bis就会聚合。
引发产生自由基的方法有两种：
①化学法 ②光聚合法
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①化学聚合：
引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N’、N’－四甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生氧自由基，激活单体形成自由基，发生聚合。化学聚合形成的凝胶孔径较小，且重复性好，用来制备分离胶；
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4.2 点样：
轻拔电泳梳子→用微量进样器点样→每孔约30μl。
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5、电泳：
接通电源→稳流→调节电流到每孔 1mA左右→当溴酚蓝前沿进入分离胶后，可适当加大电流→待前沿下行到距胶末1cm处，
停止电泳。
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6、剥胶、固定、染色：
将凝胶板取下→放入装水瓷盘中→剥下胶片→并浸洗二次→倒去水→加入固定液10分钟→倒去固定液→加显色液（联苯胺），显色→观察记录。
a与b的比例很重要。富有弹性，且完全透明的凝胶，a 与b的重量比应在30左右。常用29 ： 1
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(4)不连续PAGE的原理：
第一、三个不连续性： ①凝胶孔径的不连续； ②缓冲液离子组成及各层凝胶pH的不连续； ③在电场中形成的电位梯度的不连续。