植物过氧化物酶的提取、

仪器药品

操作步骤 取出贮于冷处备用的粗酶液。 取光径1cm比色杯2只，于1只中加入反应混合液3ml， KH2PO4 1ml，作为校零对照，另1只中加入反应混合 液3ml，上述酶液0.1ml用提取液稀释到1.0ml（因酶活 性过OD值会过大），立即开启秒表记录时间，于分光 光度计上测量吸光度值，每隔1分钟读数一次，读数于 波长470nm下进行。 以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以 △A470/min· mg蛋白质（或鲜重g）表示之。蛋白质含 量测定参阅实验二。
三、植物过氧化物酶活性的测定（比色法）
原理

过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。在有过 氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶 褐色物质，可用分光光度计测量生成物的含量。 分光光度计 离心机 秒表 天平 研钵 磁力搅拌器 愈创木酚 30%过氧化氢 20mmol/L KH2PO4 100mmol/L 磷酸缓冲液， pH6.0（见附表2） 反应混合液
实验材料（以下内容任选一组或二组即可） 新种子和储藏2—3年陈种子。 发芽不同天数的绿豆幼苗同一部位材料。 相同发芽天数的绿豆幼苗的不同部位材料。 其他材料。 实验器具和药品 仪器：电泳仪，电泳槽，注射筒及针头，微量注射器， 离心机。 药品：三羟甲基氨基甲烷（Tris），四甲基乙二胺 （TEMED），丙烯酰胺（Acr），甲叉双丙烯酰胺 （Bir），甘氨酸，过硫酸铵，蔗糖，溴酚蓝，联苯胺， 过氧化氢。
实验步骤 取粗酶液，加入等体积的50％的蔗糖溶液，电泳前可在冰箱中保存。

电泳槽的安装：封口胶封底和两侧，每侧用2个长尾夹夹住，防止 漏胶。 聚丙烯酰胺凝胶系统的配制 配胶：A∶B∶C∶H2O=1∶2∶0.2∶4.8 ，每块胶需胶液20ml（需 要溶液A=2.5ml,B=5.0ml,C=0.5ml,H2O=12ml）。配胶后将胶液做 好的夹层玻璃板倾斜30°，并立即将胶液缓缓灌入夹层中，随后将 玻板平放，再插入样品梳至梳齿3/4高度，待胶凝固后，小心拔出 梳子，并切记取出玻板底部的胶条。
实验结果



记录实验的操作程序，检查是否和原设计 相符合？ 将各胶柱中酶带条数、宽度、着色深浅和 移动距离填入表中。 选择比较组分凝胶中着色最深的酶带或特 殊酶带（即该组分特有酶带），计算酶带 的相对迁移率Rf值。






加样和电泳 样品（1）：胚芽酶液、溴酚蓝、50%蔗糖各0.05毫升； 样品（2）：胚芽酶液0.1毫升、溴酚蓝、50%蔗糖各0.05毫升； 样品（3）：胚轴酶液、溴酚蓝、50%蔗糖各0.05毫升； 样品（4）：胚轴酶液0.1毫升、溴酚蓝、50%蔗糖各0.05毫升； 上、下电泳槽加电极缓冲液后在低于15℃气温中，恒压160V（每 板电流约10mA）进行电泳，当溴酚蓝迁至离凝胶下 端0.5—1厘米 时停上电泳。电泳时间2—3小时。 用长针头注射器注水法自凝胶板上取出凝胶，凝胶要完整，不能断 裂。 染色：将完整的凝胶置于大号培养皿中，加入染色液，浸泡整块凝 胶，室温下染色15—20分钟，呈现酶带后取出凝胶，用脱色液分3 次脱去背景颜色，然后用水漂洗。 带型清楚的胶应作摄影记录或作扫描测定，胶凉干后还作永久保存。
植物过氧化物酶的提取、 活性测定及同工酶的凝胶电泳分析
综合性、设计性实验 广州大学生命科学学院生物工程专业适用
2010年9月
一、植物过氧化物酶的提取
目的要求 学习制备植物过氧化物酶粗酶液的原理和方法 为后续实验提供酶液。 器材与仪器 电子天平； 冰冻高速离心机； 可见光分光光度计； 电动玻璃匀浆机等。 试剂 20mM KH2PO4， 100mM PBS：取0.2M 的Na2HPO4 12.3ml与0.2M的 NaH2PO4 87.7ml混合。加入100ml水稀释即成。
操作方法
取绿豆胚芽、下胚轴和胚根各1g剪碎。 置入冰浴研钵中（加入少量石英砂），加 入预冷的20mM KH2PO4 2ml进行冰浴研 磨提取。 匀浆液离心4500rpm 10min。 上清液为酶粗提液，用提取液定容到10ml 供测定。

二、蛋白质浓度的测定──考马斯亮蓝染色法
目的要求
以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在电脑 上绘制标准曲线。
未知样品蛋白质浓度测定 测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在 标准曲线的直线范围内。 根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于 标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度 （μg/ml）。 注意事项 如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5－20min 内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。 测定中，蛋白－染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁 上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完 后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
四、植物过氧化物同工酶电泳技术
实验原理 同工酶（isozymes）是指作用于底物相似或完全相同的 酶的不同分子形式，即催化同一种反应而结构不同的一 族酶。它们是受遗传体系决定的酶的不同分子形式。利 用凝胶电泳技术（PAGE）可以将它们分开，用专一的 作用底物和特殊染料，把需要分析的酶染色，在胶柱上 呈现同工酶谱。 实验目的 通过实验掌握植物同工酶实验技术，了解植物同工酶分 析在遗传学研究中的意义。 着重掌握过氧化物酶的提取，电泳与染色技术和分析方 法。
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学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue） 法测定蛋白质浓度的原理和方法。
试剂
考马斯亮蓝试剂； 标准和待测蛋白质溶液
器材

试管及试管架， 移液管（0.1ml及5ml），UV－ 2000型分光光度计。
操作方法：取6支试管，按下表制定标准曲线。
试管编号 0.1mg/ml 标准蛋白溶液/ml 0.15mol/L NaCl/ml 每管中蛋白质浓度μ g/ml 考马斯亮蓝 G250 溶液 A595nm 0 0 1.0 0 1 0.2 0.8 20 2 0.4 0.6 40 5ml 3 0.6 0.4 60 4 0.8 0.2 80 5 1.0 0 100