植物蛋白质的提取和含量测定
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植物蛋白质的提取和含量测定
一、实验目的
掌握大豆蛋白的提取及制备大豆蛋白
丙酮干粉的方法。
二、实验原理
1. 大豆蛋白主要是酸性蛋白，pI 4.5-5.0，能溶于碱溶液
本实验先利用稀碱提取大豆蛋白，再利用丙酮结合等电点溶解度最低 原理沉淀蛋白。 2. Folin-酚法测定蛋白质含量 酚试剂由两部分组成，试剂A为双缩脲试剂，可与肽链发生显色反应， 试剂B中的磷钼酸和磷钨酸在OH-条件下不稳定，易被酚类化合物还 原显蓝色，因蛋白质中含Tyr被还原成蓝色，颜色深浅与浓度成正比，
量剩余上清液的体积，加入等体积预冷丙酮，先用6mol/L的HCl调pH
至6.0，再用1mol/L的HCl小心调pH至4.5-5.0，于4000r/min离心15min， (留取沉淀物)，并用少量丙酮反复(至少两次)搅拌洗涤（在离心管中进行）， 加入丙酮后一定将沉淀搅拌充分，使沉淀脱水。得到白色粉末状的大豆蛋白粉， 用干净的滤纸吸干、平铺在表面皿上，放入40度烘箱干燥，待整个实验结束 后，再称重并计算产率（即3克大豆干粉中蛋白含量）。
每次使用前，将50ml（1）与1ml（2）混合，即为试剂甲。
四、实验试剂
7. Folin—酚试剂乙 （用前稀释一倍）
在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO4•2H2O）,25克钼 酸钠（Na2MoO4•2H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸， 100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结
五、实验步骤
（一）蛋白提取
1.称取3克大豆干粉，加入0.2%NaOH 30毫升。（先加入调成糊状，再用 少量多次地慢慢地加入（边加边搅拌），室温下搅拌抽提10min，于 4000r/min离心7min ,小心留取上清液，弃脂层和沉淀，如上清液有漂浮物， 再经过滤； 2. 留出上清液2毫升稀释50倍做含量测定（第二步） 3.制干粉：
束时，加入150克 硫 酸 锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，
开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈 绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕
色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当
稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。
可用比色法测定。
三、实验器材
1.分光光度计（500nm），比色皿 2.计算纸（9 cm×9 cm）
3.离心机 （离心管100ml 、50ml）
4.组织捣碎机 5.精密pH试纸pH 0.5-5.0; pH 4.5-7.0
四、实验试剂
1.大豆干粉 2. 0.2%NaOH 3. 丙酮 （预冷） 4. 6M HCl，1M HCl 5 标准 BSA（0.5 mg/ml） 6. Folin—酚试剂甲（用前组分一: 组分二 = 50:1） （1） 1克 Na2CO3和0.2克 NaOH溶解于50毫升蒸馏水中。 （2） 0.5克硫酸铜（CuSO4•5H2O）溶解100毫升 1%酒石酸钾钠 （KNaC4H4O6•4H2O）中。
五、实验步骤
（二）蛋白含量测定
1. 制作标准曲线 按照下表操作，以A500nm为纵坐标，以蛋白含量为横坐标建立标曲。 2. 测定提取第2步稀释后样品的蛋白浓度 按上表中样品列操作，根据A500nm查找含量，并计算原始浓度。
试管 试剂 ml 标准 BSA 蒸馏水 Folin—酚试剂甲 Folin—酚试剂乙 A500nm 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 各 4ml 混匀后静置 10min 各 0.5ml 混匀后静置 30min 0.000 0.5ml 0.1(稀释 50 倍后) 0.4 4ml 1 2 3 4 5 6 样 品
பைடு நூலகம்
一、实验目的
掌握大豆蛋白的提取及制备大豆蛋白
丙酮干粉的方法。
二、实验原理
1. 大豆蛋白主要是酸性蛋白，pI 4.5-5.0，能溶于碱溶液
本实验先利用稀碱提取大豆蛋白，再利用丙酮结合等电点溶解度最低 原理沉淀蛋白。 2. Folin-酚法测定蛋白质含量 酚试剂由两部分组成，试剂A为双缩脲试剂，可与肽链发生显色反应， 试剂B中的磷钼酸和磷钨酸在OH-条件下不稳定，易被酚类化合物还 原显蓝色，因蛋白质中含Tyr被还原成蓝色，颜色深浅与浓度成正比，
量剩余上清液的体积，加入等体积预冷丙酮，先用6mol/L的HCl调pH
至6.0，再用1mol/L的HCl小心调pH至4.5-5.0，于4000r/min离心15min， (留取沉淀物)，并用少量丙酮反复(至少两次)搅拌洗涤（在离心管中进行）， 加入丙酮后一定将沉淀搅拌充分，使沉淀脱水。得到白色粉末状的大豆蛋白粉， 用干净的滤纸吸干、平铺在表面皿上，放入40度烘箱干燥，待整个实验结束 后，再称重并计算产率（即3克大豆干粉中蛋白含量）。
每次使用前，将50ml（1）与1ml（2）混合，即为试剂甲。
四、实验试剂
7. Folin—酚试剂乙 （用前稀释一倍）
在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO4•2H2O）,25克钼 酸钠（Na2MoO4•2H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸， 100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结
五、实验步骤
（一）蛋白提取
1.称取3克大豆干粉，加入0.2%NaOH 30毫升。（先加入调成糊状，再用 少量多次地慢慢地加入（边加边搅拌），室温下搅拌抽提10min，于 4000r/min离心7min ,小心留取上清液，弃脂层和沉淀，如上清液有漂浮物， 再经过滤； 2. 留出上清液2毫升稀释50倍做含量测定（第二步） 3.制干粉：
束时，加入150克 硫 酸 锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，
开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈 绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕
色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当
稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。
可用比色法测定。
三、实验器材
1.分光光度计（500nm），比色皿 2.计算纸（9 cm×9 cm）
3.离心机 （离心管100ml 、50ml）
4.组织捣碎机 5.精密pH试纸pH 0.5-5.0; pH 4.5-7.0
四、实验试剂
1.大豆干粉 2. 0.2%NaOH 3. 丙酮 （预冷） 4. 6M HCl，1M HCl 5 标准 BSA（0.5 mg/ml） 6. Folin—酚试剂甲（用前组分一: 组分二 = 50:1） （1） 1克 Na2CO3和0.2克 NaOH溶解于50毫升蒸馏水中。 （2） 0.5克硫酸铜（CuSO4•5H2O）溶解100毫升 1%酒石酸钾钠 （KNaC4H4O6•4H2O）中。
五、实验步骤
（二）蛋白含量测定
1. 制作标准曲线 按照下表操作，以A500nm为纵坐标，以蛋白含量为横坐标建立标曲。 2. 测定提取第2步稀释后样品的蛋白浓度 按上表中样品列操作，根据A500nm查找含量，并计算原始浓度。
试管 试剂 ml 标准 BSA 蒸馏水 Folin—酚试剂甲 Folin—酚试剂乙 A500nm 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 各 4ml 混匀后静置 10min 各 0.5ml 混匀后静置 30min 0.000 0.5ml 0.1(稀释 50 倍后) 0.4 4ml 1 2 3 4 5 6 样 品
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