大脑中动脉缺血再灌注大鼠脑组织PAR

大脑中动脉缺血再灌注大鼠脑组织PAR拟1表达与炎症反应的关系（作者：_________ 单位：___________ 邮编：___________ ）作者：周青珍，王华梅，吴家幕【摘要】目的：研究脑缺血再灌注（CIR）后脑组织中蛋白酶激活受体拟1（PAR拟1）的表达及其与炎症反应的关系。

方法:40只雄性SD大鼠线栓法建立大脑中动脉栓塞（MCAO模型，再灌注后于3、6、12 h及1、2、3、7 d取脑，免疫组化法和脑组织匀浆法检测PAR 拟1、超氧化物歧化酶（SOD和丙二醛（MDA的含量。

结果：缺血再灌注后脑组织PAR拟1表达增加（P V 0.01 ）, MDA含量增多（P V 0.01 ）, SOD舌性降低（P v0.01 ）; PAR拟1表达与MDA含量正相关（r1=0.844,P v 0.05 ），与SOD含量负相关（r2=-0.901,P v 0.01 ）。

结论:CIR后PAR11 1表达增多可加重脑组织炎性反应。

【关键词】大脑中动脉；栓塞；蛋白酶激活受体拟1Abstract: Objective To inv estigate the correlati on betwee n protease 拟activated receptor 拟1（PAR 拟1） expression and inflammatory reaction of brain tissue after cerebral ischemiareperfusion(CIR).Methods Fourty SDrats were randomly dividedinto eight groups:sham group,CIR3 h,CIR6 h,CIR12 h,CIR1 d,CIR2 d, CIR3 d,a nd CIR7 d group( n=5).To establish middle cerebral artery occlusion(MCAO) model with Longa' methods.At the indicated timepoint,the rat was sacrificed and its brain was removed.PAR 扌以 1 wasdetected with immunohistochemistry,SOD and MDA contents in brain homogenate were measured.Results Compared with sham group,PAR 拟1 expressi on was in creased obviously (P v 0.01 ) .Con te nts of MDA were in creased with the time of CIR prolonged ( P v0.01 ) ,and there was positive correlation between PAR 拟1 expression and MDA content(r1=0.844,P v 0.05 ) ,but SODactivity was decreased ( P v 0.01 ) ,and negatively correlated with PAR 勘：1 expression(r2=-0.901,P v 0.01 ) . Con clusi on In creased PAR)； 1 expression may aggravate in flammatory reacti on of brain tissue in rats after CIR with MCAO.Key words: Middle cerebral artery;Occlusi on ;Protease 拟, activated receptor 拟1近年来研究发现中性粒细胞的聚集、黏附和浸润，以及炎性因子的大量产生是缺血再灌注损伤的重要因素［2］。

脑缺血再灌注(cerebral ischemia reperfusio n,CIR )后中性粒细胞在凝血酶作用下趋化于缺血组织周围，通过激活蛋白酶激活受体-1 ( protease拟activated receptor 拟■〔‘PAR扌以1）导致细胞内Ca2+升高，刺激小胶质细胞的活化和增生［3］,促进炎症因子表达，活化的白细胞释放自由基，引起脑缺血后脑组织损害。

本实验通过建立大脑中动脉栓塞（Middle cerebral artery occlusion,MCAO ）模型，了解CIR 后脑组织中PAR拟1表达与代表自由基水平的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD 和丙二醛（malondialdehyde，MDA 之间的相关性，以探讨PAR头1在CIR后脑组织炎症反应中的作用。

1材料和方法1.1实验动物与分组健康雄性SD大鼠40只，体重270〜320 g（南京青龙山实验动物养殖中心提供），随机分为8组：假手术组，缺血再灌注3、6、12 h 及1、2、3、7 d 组（n=5）。

1.2脑缺血再灌注模型的制备选用日本产钓鱼尼龙线，直径0.2 mm每段长4 cm,头端烧成杵状备用。

参照Zea Longa报道的线栓法［1］建立大鼠大脑中动脉栓塞MCAOI型。

术后2 h,外拉尼龙线，使其球端回至颈外动脉残端，恢复大脑中动脉供血，实现再灌注，于上述不同时间点断头取脑；假手术组除插入尼龙线15 mm外，余步骤同手术组，术后24 h断头取脑。

1.3免疫组化染色在相应时间点，大鼠深度麻醉后，打开腹腔，由左心耳灌注生理盐水100 mL再用4%甲醛内固定后断头取脑。

标本置中性福尔马林中固定、包埋。

按下述步骤行PAR以1免疫组化染色：切片、微波修复抗原、3%过氧化氢抑制、兔血清封闭、加一抗（山羊抗小鼠多克隆抗体，美国Santa Cruz公司）、4 C过夜、加生物素二抗（兔抗山羊IgG）、加SABC DAB显色，苏木素复染。

1.4脑组织匀浆制备及SOD MDA含量测定将左侧脑组织称重后置于玻璃匀浆管内，0.9%的生理盐水作为匀浆介质（是脑组织的9倍），充分磨碎使脑组织匀浆化，离心15 min, 取上清液，即为10%面组织匀浆。

SOD MDA含量测定严格按试剂盒说明书进行。

1.5 结果分析高倍镜下随机选取左侧海马皮质相邻而不重叠的4个视野区，用图像分析软件计算PA戌以1阳性表达细胞数。

用SPSS11.0软件进行方差分析，所得PA^1. 1、SOD MDA值用均数士标准差（x 士s）表示，P V 0.05有统计学意义。

2结果2.1 PAR拟1表达和SOD MDA含量与假手术组相比，CIR 3 h后PAR拟1表达明显增多，3 d时达高峰（P v0.01 ）; SOD活性显著降低（P v0.01 ）,且随时间变化延长而逐步降低，3 d时最为明显；MDA含量开始升高（P v0.01 ）, 3 d 达高峰（见表1）。

2.2相关性分析PAR拟1阳性表达细胞数与脑组织匀浆SOD含量呈负相关关系（r2=-0.901,P v 0.01 ）,但与MDA含量呈正相关关系（r1=0.844,Pv 0.05 ）（见表1）。

表1 PAR拟1表达与SOD MDA含量变化注：*P V 0.01 ；3讨论脑缺血再灌注后，缺血以及缺血激活的内皮细胞可导致中性粒细胞聚集、黏附和浸润，黏附的白细胞可释放大量氧自由基和蛋白水解酶［4］。

自由基对脑组织的损害集中表现为0H对细胞器生物膜中不饱和脂肪酸的丙烯双键进行攻击，使之结构破坏，流动性降低，通透性增加，甚至完全裂解，最终导致细胞内脂质过氧化，引起细胞凋亡。

膜脂质降解产生的主要代谢产物MDA常用来反应细胞膜脂质过氧化程度，通过测量MDA的量可间接反映氧自由基水平；SOD舌性代表内源性氧自由基清除活力，脑缺血继发损伤后，一系列自由基反应可直接损伤DNA酶蛋白，从而使SOD的活性减弱或消失，SOD合成和再生减少。

本实验发现，CIR后MDA含量随再灌注时间的延长进行性升高，而SOD舌性随再灌注时间的延长逐渐降低，提示脑组织中有大量自由基产生，内源性氧自由基清除活力下降。

研究表明，凝血酶的细胞外效应在脑组织缺血损伤中起重要作用，其细胞外效应由凝血酶受体(thrombin recptor,TR) 介导［5］。

PAR。

：1是TR之一，在脑组织中分布广泛，对凝血酶的介导作用最强［6］。

脑缺血再灌注后，脑组织产生大量凝血酶，通过栓系配体模式［6］激活PAR拟1,引起PARU. 1表达增多，对脑细胞产生直接的毒性效应，并通过受体途径激活神经元和神经胶质细胞，使之产生并释放大量的细胞因子及毒性物质而损伤血脑屏障［7］。

有报道［8］认为：凝血酶是重要的前炎症因子，可上调肿瘤坏死因子(TNF拟a)、细胞间粘附分子（ICAM拟1）、白介素拟1 （IL拟1）等炎性因子表达，促进白细胞浸润及活化。

CIR后，中性粒细胞在凝血酶作用下趋化于缺血组织周围，凝血酶通过激活PAR拟1导致细胞内Ca2+升高，刺激小胶质细胞的活化和增生［3］，促进炎症因子表达，活化的白细胞释放自由基，导致SOD 舌力降低、MD冰平升高。

本研究发现，CIR后PAR 拟1表达随再灌注时间延长也逐渐增多，3 d时达高峰；对PAR臥1 阳性表达细胞数和MDA 含量进行相关性分析，发现二者呈正相关关系；而SOD含量与PAR）； 1阳性表达细胞数呈负相关关系，且三者达高峰时间均在CIR 后3d，这与临床上脑梗死后病情危重时间点一致，说明PAR）： 1表达增高可加重CIR后脑组织炎症反应。

Rhauhman［9］等研究表明，凝血酶通过激活核转录因子NF拟K B 促进许多细胞因子的表达。

NF拟K B是一种共用的核转录因子，在IL拟1、TNF拟a、ICAM拟.1等的启动子上都存在它的结合位点。

CIR 后PAR拟,1表达增加，凝血酶通过PAR1：!, 1激活NF拟K B后进入细胞核结合于TNF拟a、ICAM拟1、IL拟.1等炎症因子的靶基因位点，诱导其表达，介导了炎症反应的发生。

提示脑梗死后及时进行抗凝血酶治疗，有可能抑制PAR头1的高表达，减少氧自由基的生成，从而减轻脑组织炎性反应和脑组织损伤。

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