重组人工胰岛素

重组人工胰岛素

胡霞

一、概念

1、概念：重组DNA技术生产的由51个氨基酸残基组成的蛋白质，宿主细胞为大肠杆菌。按干燥品计算，每1mg含重组人胰岛素不得少于27.5单位。重组人胰岛素中残余宿主DNA和宿主细胞蛋白质为与生产过程相关的、潜在的特异性杂质，必须在生产过程中严格控制，其限度应符合有关规定。

2、形状

该品为白色或类白色的结晶性粉末。

该品在水、乙醇和乙醚中几乎不溶，在稀盐酸和稀氢氧化钠溶液中易溶。3、物化性

分子量：5807.57022

分子式：C

257H

383

N

65

O

77

S

6

水溶性：2.0: 2 mg/mL

储存条件：2-8°C

二、工艺流程

1重组人工胰岛素的生产原理

通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hI。酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少(1～50 mg／L)，产量低。因此，虽然rhI投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的表达策略I2 J，尤其是对E．CO一尻表达系统的研究更是越来越深入，用E．coli系统表达hPI的策略也越来越多。另一方面，在胰岛素的基因工程生产中，下游处理非常复杂，复杂的下游处理极大地降低了胰岛素的最终收率。本研究围绕着提高重组目的蛋白表达量，简化下游处理过程等方面进行探索，建立了一套经过优化的高效完整的基因工程E．coli发酵表达(His)6一Arg—Arg一人胰岛素原[(His)6一Arg—Arg—human proinsulin，PPh—PI]，后加工成hI的制备工艺。

2重组人工胰岛素的生产工艺流程

2.1菌种的制备

2.1.1目的基因的提取

既从人的DNA中提取胰岛素基因，可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离。主要有如下4种方法：

（1）鸟枪法：用一大堆限制性核酸内切酶对附近基因进行剪切，再提取所需要的。至于如何筛选，用DNA分子杂交，即DNA探针

（2）人工合成法：根据转录蛋白或者mRNA推导出基因序列，然后人工合成，没有内含子。

（3）从基因文库中提取：也就是事先已经提取完毕的拿来用

（4）PCR扩增技术：用于大量生产该段基因片段，用于商业化运作。

2.1.2提取质粒

使用细胞工程,培养大肠杆菌，从大肠杆菌的细胞质中提取质粒

质粒为环状。碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA 可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。

2.1.3基因重组将

取出目的基因与质粒，先利用同种限制性内切酶将质粒切开，再使用DNA 连接酶将目的基因与质粒“缝合”，形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒。

2.1.4将质粒送回大肠杆菌

再大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质，如CaCl2,这使细胞会吸收外源基因，此时将重组的质粒也放入培养液中，大肠杆菌便会将重组质粒吸收。

将大肠杆菌用氯化钙处理，以增大大肠杆菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒能够进入受体细胞，此时的细胞处于感受态（理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态）。

2.2胰岛素的产生和精制（即菌种的发酵培养）

重组人工胰岛素的工业生产制备和深加工技术在如今已经是炉火纯青。有近百年的发酵工程为基础，结合现在的基因工程技术的产物，在菌种制备后的发酵培养过程更是可靠和安全的。

发酵培养流程见下图表：

对从菌种库中取出的菌种进行活化及初步扩大培养

在种子罐中对菌种进行进一步的扩大培养，至菌种到对数生长期

分两阶段进行控制，第一阶段主要通过控制溶氧和补加甘油使菌

体达到富集的目的，第二阶段通过补加甲醇使菌体进行高密度表

达目的产物，HPLC 检测目的产物含量

目的产物存在于发酵液上清中，此步骤主要控制目的产物收率

通过两步柱层析，分别去除发酵上清液中的色素和杂蛋白

利用紫外检测仪控制目的产物收率，主要试剂为乙醇与异丙醇

调节PH 值，使P1沉淀，再经离心干燥，得中间体I 固体

控温进行转肽反应，主要试剂为DMSO 与1,4-丁二醇

再通过柱层析进行提纯，主要试剂为异丙醇

调节PH 值，使P2沉淀，再经离心干燥，得中间体II 固体

通过控制湿度与温度进行脱帽反应，得到终产物胰岛素

主要试剂为丙酮，产品为半固体

Tris-HCl 和异丙醇

对胰岛素成品进行一次结晶和水洗

对水洗后的胰岛素进行过滤除菌后冻干，即得胰岛素成品

制得的胰岛素经过深加工，可以得到片剂，注射剂和肺部吸入制剂等。 3药物检测

这种重组人工胰岛素的检测重点应该是

① 测定生物活性

② 效价测定

③ 控制产品中杂质潜在有害物质

④ 保证产品安全性和有效性

三、问题与展望

胰岛素在糖尿病治疗中具有无可替代的作用和地位，但因注射给药让许多患者产生畏惧心理，使其作用发挥受到限制。

为了减少不便和疼痛，医药界正在全力以赴投入研究，开发更新的胰岛素剂型及给药方式。目前有关新式胰岛素产品的研究方向，可归纳为3类:

1.新的给药方式，例如:口服、吸入;

2.改变药物代谢机制;

3.改进注射手段，让使用者无痛;

这是国际国内胰岛素类药物研究发展的前沿和趋势。

3.1非注射型胰岛素

让胰岛素和其他药物一样成为非注射型药品，通过口服、鼻吸等途径进入人体而免除注射，需要研究解决制剂吸收的问题。由于胰岛素本身的疗效和安全性已经非常确定，而改变的是给药途径，因此吸收程度和速度是需要解决的首要问题。

3.2口服胰岛素

胰岛素本身为蛋白质，口服后会被胃肠道降解破坏，所以常规胰岛素不能口服。口服给药受到胃酸、蛋白分解酶、大分子吸收、肝脏首过效应等影响，因此，口服胰岛素的研究方向主要在以下几方面: