重组人胰岛素研究历史和生产工艺
重组人胰岛素研究历史和生产工艺
胰岛素的功能 • 稳定性 • Ins在弱酸性水溶液中或混悬在中性缓冲液中较稳 定 • 还原剂及多种重金属使Ins失活 • 紫外线、光氧化、超声波会引起Ins变性。 胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯一 同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。 药理作用 治疗糖尿病、消耗性疾病。
重组胰岛素的研究历史
维持血液中INS水平 缩短控制高血糖的时间 减少低血糖发生， 减轻病人多次皮下注射INS的痛苦 INS泵是强化治疗的最佳手段
口服给药：由于采用了包裹的方法来保护胰岛素制 剂，口胰岛素在胃及小肠内不被破坏，在大肠内分 解、释放出来，通过肠黏膜进行吸收。
肺部给药：巨大的肺泡表面积、极薄的肺泡、丰富的 毛细血管网、狭小的气血通路、低酶活性、肺深处较 慢的清除速率等，这些良好的生理环境为蛋白多肽的 吸收提供了有利条件。
2. 反转录酶法：仿照天然合成途径 通过胰岛素原的cDNA合成，表达产物是胰 岛素原，经工具酶切开，除去C-肽得人胰岛 素。
AB链合成人胰岛素
Ins A链
Ins B链
转化大肠杆菌
发酵
纯化
A链
B链
活性胰岛素
二硫键
反转录酶法合成人胰岛素
质粒
PCR
Ins mRNA
反转录 提取质粒 限制性内切酶酶切
Ins cDNA
------胰岛素B链29位赖氨酸侧链通过酰基化连接一个N-16-烷基 酸的14碳游离脂肪酸
●该游离脂肪酸能与白蛋白结合，延缓与胰岛素受体结合，从而延长其半衰
期。
glargine （Lantus®） 安万特公司研制
Insulin Detemir （Levemir ® ） 诺和诺德公司研制
胰岛素肺部吸入制剂--------Exubera
重组人胰岛素和重和生长激素的生产工艺
由于结构和性质的差异，胰岛素和生长激素的分离纯化过程有所不同，
涉及的步骤和技术也有所区别。
重组人胰岛素和重和生长激素生产工艺的优缺点分析
要点一
酵母表达系统
要点二
低成本、高产出
酵母作为宿主细胞具有高表达、易培养、易发酵等优点， 有助于提高胰岛素的生产效率。
通过大规模发酵和分离纯化，可以实现低成本、高产出， 降低治疗费用。
使用哺乳动物细胞作为宿主细胞，能够实现更接近人体 生理状态的糖基化过程，提高生长激素的生物活性。
重组人胰岛素和重和生长激素生产工艺的优缺点分析
更接近人体天然结构
哺乳动物细胞表达的生长激素更接近 人体天然结构，降低了免疫排斥的风 险。
临床效果更佳
由于结构和性质的优化，重组人生长 激素在治疗某些疾病方面具有更好的 临床效果。
重组人胰岛素和重和生长激素生产工艺的异同点
01 02
原料与培养基
胰岛素生产主要使用酵母作为宿主细胞，而生长激素则更倾向于使用哺 乳动物细胞作为宿主。此外，培养基的成分也有所不同，以满足不同细 胞的需求。
蛋白质修饰
胰岛素和生长激素在蛋白质修饰方面存在差异，以适应其特定的生理功 能和药理作用。
03
分离纯化过程
重组人胰岛素和重和生长激素生产工艺的优缺点分析
生产成本高
哺乳动物细胞培养成本较高，导致生长激素的生产成本增加。
生产周期长
哺乳动物细胞生长缓慢，培养周期长，影响了生产效率。
潜在的病毒污染风险
虽然采用了各种病毒消除技术，但仍存在病毒污染的风险。
重组人胰岛素和重和生长激素生产工艺的发展趋势与展望
基因编辑技术应用
通过控制培养条件，如温度、pH、营养物 质等，优化细胞代谢，提高目标蛋白质的产 量。
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究
《基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究》一、引言基因工程技术的发展为生物医药领域带来了革命性的变革，其中重组DNA 技术作为一种能够改变生物体基因组的技术，为生产重组蛋白素（包括重组人胰岛素）提供了可行性。
本文将从深度和广度两个方面来探讨基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究。
二、基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的原理在基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究中，首先需要获取重组人胰岛素的基因序列，然后以质粒或病毒为载体将其转染至大肠杆菌的体内，经过培养和发酵，大肠杆菌体内合成重组人胰岛素，并通过纯化后得到最终的产品。
三、基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究进展1. 基因克隆技术的应用基因克隆技术的应用是基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的关键技术之一。
利用限制酶切剪切 DNA，然后重组连接，将重组的DNA 导入质粒内，再将质粒导入大肠杆菌细胞内，实现外源基因的表达。
2. 基因工程大肠杆菌的选择为了高效地生产重组人胰岛素，研究者需要筛选高产重组蛋白素的大肠杆菌菌株，并进行相关的改造以提高其产量。
3. 发酵工艺的优化发酵工艺的优化对于提高重组人胰岛素的产量至关重要。
包括对培养基成分、厌氧发酵条件、发酵时间等因素的优化。
四、基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的意义基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素具有重要的生物医药意义。
大肠杆菌是一种广泛存在于自然界中的细菌，其发酵生产成本低、抗污染能力强，适用于大规模工业化生产。
另重组人胰岛素与天然胰岛素具有相同的生物活性，可以作为治疗糖尿病的药物，在临床上有着重要的应用前景。
五、个人观点和理解基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究是基因工程技术的一个重要应用方向，其有着较高的生产效率和较低的成本，为生物医药领域带来了巨大的潜力和机遇。
但是，需要注意的是，基因工程技术在应用过程中也存在一些伦理和社会问题，例如生物安全性、环境影响等方面，需要引起足够的重视。
重组人胰岛素的制备流程
重组人胰岛素的制备流程胰岛素是一种重要的蛋白质激素，对于调节血糖水平起着至关重要的作用。
重组人胰岛素是通过基因工程技术制备的人工合成胰岛素，它与人体自然产生的胰岛素具有相同的结构和生物活性。
下面将介绍一种常用的重组人胰岛素制备流程。
制备重组人胰岛素的第一步是获得胰岛素基因的DNA序列。
这可以通过两种途径来实现。
一种是从人体中分离出胰岛细胞，然后提取其中的RNA，通过逆转录酶将RNA转录成DNA，从而获得胰岛素基因的DNA序列。
另一种方法是从人体细胞库中筛选出含有胰岛素基因的细胞，然后从这些细胞中提取DNA。
这两种方法都需要进行PCR扩增，以增加目标基因的数量。
接下来，将获得的胰岛素基因插入到表达载体中。
表达载体是一种能够在细胞中稳定复制的DNA分子，它可以携带外源基因并使其在细胞中表达。
常用的表达载体有质粒和病毒。
将胰岛素基因与表达载体进行连接，形成重组胰岛素基因载体。
然后，将重组胰岛素基因载体导入到宿主细胞中。
常用的宿主细胞有大肠杆菌和酵母等。
将重组胰岛素基因载体转化到宿主细胞中后，利用宿主细胞的复制和转录机制，使重组胰岛素基因在细胞内得以表达。
接着，利用细胞培养技术进行大规模的培养和表达。
将转化了重组胰岛素基因的宿主细胞培养在培养基中，通过控制培养条件和添加适当的诱导剂，促使细胞大量表达重组胰岛素。
培养时间一般为数天至数周，取决于细胞的生长速度和表达量。
在细胞培养过程中，重组胰岛素会以包括细胞内溶胞液和培养基在内的形式存在。
为了提取和纯化重组胰岛素，需要经过细胞破碎、离心、过滤等步骤，以去除细胞碎片和其他杂质。
然后，通过离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等技术，对重组胰岛素进行纯化。
对纯化后的重组胰岛素进行结构和活性的分析。
利用质谱、核磁共振等技术，确定重组胰岛素的分子质量和结构特征。
同时，通过生物活性测定，验证重组胰岛素与天然胰岛素的功能等效性。
重组人胰岛素的制备流程主要包括获得胰岛素基因序列、构建重组胰岛素基因载体、转化宿主细胞、大规模培养和表达、纯化和结构活性分析等步骤。
重组人胰岛素制备工艺
重组人胰岛素制备工艺引言胰岛素是一种由胰腺β细胞分泌的激素，它参与调节葡萄糖代谢，维持血糖水平稳定。
然而，对于许多糖尿病患者，体内胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗使得血糖控制成为难题。
为了解决这一问题，重组人胰岛素制备工艺应运而生。
本文将详细介绍重组人胰岛素的制备工艺，以及如何通过优化制备工艺提高其产量和质量。
关键词介绍1、重组人胰岛素：是指利用基因工程技术，通过细胞培养或微生物发酵生产的胰岛素。
它具有与天然人胰岛素相同的结构和功能，因此在临床上有广泛的应用。
2、制备：是指通过一系列工艺步骤，从原料中提取或制造出所需物质的过程。
在重组人胰岛素制备中，主要包括基因工程操作、细胞培养、发酵、分离和精制等步骤。
3、工艺：是指实现制备过程的一系列具体方法和操作规程。
工艺的选择和优化直接影响到产品的产量和质量。
重组人胰岛素制备工艺1、酵母菌的筛选：选用适合生产重组人胰岛素的酵母菌种，对其进行筛选和改良，以提高发酵过程中的产量。
2、基因工程操作：将人胰岛素基因插入到酵母菌的染色体或质粒中，确保基因正确表达。
3、发酵：在适宜的营养条件下，利用筛选得到的酵母菌进行发酵生产。
4、分离和精制：通过一系列物理、化学和生物学方法，将重组人胰岛素从发酵液中分离出来，并进行精制和纯化，以得到高纯度的产品。
制备工艺优化1、通过现代实验设计方法和技术，如响应面法和均匀设计法，筛选最佳工艺条件，以提高重组人胰岛素的产量和质量。
2、通过基因工程技术改良酵母菌，增强其生产重组人胰岛素的能力，提高产量。
3、采用先进的分离和精制技术，如高效液相色谱和超滤膜过滤等，进一步提纯产品，提高产品质量。
4、结合计算机模拟技术和实验验证，模拟工艺过程，指导实际生产，优化制备工艺。
重组人胰岛素制备工艺在糖尿病治疗中具有重要意义，本文详细介绍了其制备过程及优化方法。
通过合理选择工艺条件和基因工程改良，可以有效提高重组人胰岛素的产量和质量。
随着科学技术的发展，相信未来制备工艺将进一步优化，为糖尿病患者提供更好的治疗选择。
重组人胰岛素生产工艺流程
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在进行重组人胰岛素的生产之前，需要进行一系列的准备工作。
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究
参考内容
引言
人胰岛素是一种重要的生物药物，对于治疗糖尿病具有显著效果。传统上，人 胰岛素的生产主要通过从人身体中提取胰岛素原，然后进行化学合成和结构改 造。然而，这种方法不仅成本高昂，而且生产周期长，难以满足市场需求。近 年来，随着生物技术的发展，利用重组大肠杆菌生产人胰岛素的方法逐渐得到 广泛应用。本次演示将详细介绍利用重组大肠杆菌生产人胰岛素的方法和相关 技术。
展望未来，基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究有望为糖尿病治疗 提供更加安全、有效的药物。随着科学技术的不断进步和研究的深入，我们相 信未来能够在提高产量、降低成本、优化质量等方面取得更大的突破。加强与 其他领域（如纳米技术、生物信息学等）的跨学科合作，将为该领域的研究和 应用提供更为广阔的前景。
生产流程
利用重组大肠杆菌生产人胰岛素的生产流程包括以下几个步骤：
1、细胞悬浮：将大肠杆菌接种到发酵罐中的无菌培养基中，在适宜的温度和 湿度条件下进行培养。培养过程中需监测细菌生长情况，以确保细菌处于最佳 生长状态。
2、发酵：当细菌生长到一定密度时，向发酵罐中加入适量的诱导剂，以诱导 细菌表达人胰岛素基因。发酵过程中需控制温度、湿度、氧气浓度等参数，以 确保细菌正常表达胰岛素基因。
一、背景介绍
基因工程技术是一种利用微生物或细胞体系生产人类所需蛋白质的技术。在过 去几十年中，基因工程技术得到了广泛应用，并在制药、生物能源、环境保护 等领域发挥了重要作用。重组人胰岛素是一种利用基因工程技术生产的胰岛素， 它与人体产生的胰岛素具有相似的结构和功能。然而，重组人胰岛素的生产过 程比较复杂，需要经过多个步骤，因此生产成本较高。
3、收集：发酵结束后，收集细菌培养液并进行过滤，以去除其中的杂质和细 胞残骸。
重组人胰岛素的制备及生物学特性分析
重组人胰岛素的制备及生物学特性分析随着现代生物技术的发展，重组蛋白的制备技术越来越成熟，其中重组人胰岛素是一种应用非常广泛的重组蛋白。
本文将从重组人胰岛素的制备流程和生物学特性两个方面来探讨这一主题。
一、重组人胰岛素的制备流程1. 基因克隆重组人胰岛素的制备首先需要进行基因克隆。
胰岛素基因序列已经被多次确定，是由A链和B链两个多肽链组成的，其中A链由21个氨基酸组成，B链由30个氨基酸组成。
这两条基因在人的胰岛β细胞中均被表达，然后通过转录和翻译合成成分别为84个和30个氨基酸残基的前蛋白，再经由胰岛细胞内的酶的加工而形成两肽链胰岛素。
由于A链和B链之间存在两个二硫键，因此在基因克隆时需要将这两条基因串联起来并插入到适当的宿主细胞中。
2. 宿主细胞的选取重组人胰岛素的制备过程需要选择合适的宿主细胞。
常用的宿主细胞有大肠杆菌、腺病毒、哺乳动物细胞等。
制备过程中需要考虑到宿主细胞的易培养性、表达效率、翻译后修饰等因素。
3. 表达和纯化构建好质粒并选择好宿主细胞后，就需要使用适当的诱导剂刺激宿主细胞对胰岛素基因进行表达，接着进行纯化、离子交换和高效液相等步骤进行胰岛素的分离纯化。
这一部分的操作涉及到分子生物学、蛋白质化学等多个学科领域。
二、重组人胰岛素的生物学特性1. 作用机制胰岛素是一种影响葡萄糖代谢的激素，它可以促进葡萄糖进入细胞内以供能量消耗。
若胰岛素水平下降，会导致高血糖，甚至糖尿病等疾病的出现。
重组人胰岛素在体内能够发挥与天然胰岛素完全相同的作用，并且不会引发免疫反应，是治疗糖尿病等疾病的重要药物。
2. 生物学性质对于重组人胰岛素的生物学性质需要进行全面、客观的评价。
首先，作为一种重组蛋白，重组人胰岛素在体内不会引起免疫反应，因此可以安全应用于糖尿病等疾病的治疗；其次，重组人胰岛素的药效作用与天然胰岛素完全相同，可以达到相同的降血糖效果；此外，重组人胰岛素的半衰期较短，需要分次注射才能保持足够的药效。
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究一、概述基因工程是一种革命性的生物技术，它允许科学家在分子水平上对生物体进行精确的操控和改造。
自从20世纪70年代基因工程技术诞生以来，它已广泛应用于医药、农业、工业等领域，为解决人类面临的诸多挑战提供了新的途径。
利用基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素是基因工程在医药领域的一个重要应用。
重组人胰岛素是一种通过基因工程技术生产的人胰岛素类似物，具有与天然人胰岛素相似的生物活性。
它主要用于治疗糖尿病等代谢性疾病，具有广阔的市场前景和重要的社会价值。
与传统的动物源胰岛素相比，重组人胰岛素具有纯度高、稳定性好、免疫原性低等优点，因此备受关注。
在大肠杆菌中发酵生产重组人胰岛素的过程涉及多个关键步骤，包括基因克隆、表达载体的构建、宿主细胞的选择、发酵条件的优化等。
通过这些步骤，可以实现重组人胰岛素的高效表达和分泌，从而生产出符合治疗要求的胰岛素产品。
本文旨在探讨基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究进展、技术原理、工艺优化以及未来的发展趋势。
通过深入了解这一领域的研究现状，可以为重组人胰岛素的生产提供理论支持和实践指导，进一步推动基因工程技术在医药领域的应用和发展。
1. 重组人胰岛素的重要性和应用背景重组人胰岛素，作为一种生物技术产品，在医学领域具有极其重要的地位。
它是通过基因工程技术，将人类胰岛素基因插入到大肠杆菌等微生物体内，使其能够生产与人体胰岛素功能相似的胰岛素。
这种胰岛素在治疗糖尿病方面发挥着至关重要的作用。
糖尿病是一种全球性的健康问题，影响着数以亿计的人口。
根据国际糖尿病联盟（IDF）的数据，全球约有62亿成年人患有糖尿病，预计到2045年这一数字将增至7亿。
糖尿病的治疗需要长期使用胰岛素，而重组人胰岛素因其与人体胰岛素的高度相似性，成为糖尿病治疗的首选药物。
重组人胰岛素的应用背景源于对胰岛素需求的不断增长。
在重组人胰岛素出现之前，糖尿病患者主要依赖从猪或牛体内提取的胰岛素进行治疗。
重组人类胰岛素制备工艺研究
重组人类胰岛素制备工艺研究人类胰岛素是治疗糖尿病的重要药物，自20世纪初被发现以来就一直受到广泛的关注。
随着现代生物技术的发展，利用重组DNA技术生产人类胰岛素已成为最主要、最经济的方法。
本文将就重组人类胰岛素制备工艺进行探讨。
一、重组人类胰岛素是什么人类胰岛素是由胰岛细胞产生的多肽激素，主要调节葡萄糖在体内的代谢。
结构上，它包括两个多肽链，A链和B链，它们由21个和30个氨基酸组成，而这些氨基酸的顺序是非常特定的。
重组人类胰岛素是通过将人类胰岛素的DNA序列插入到细菌或酵母等生物的DNA中，利用这些生物基因表达和生产人类胰岛素的蛋白质，达到生产大量纯度极高的人类胰岛素的目的。
这是一种完全体外合成人类胰岛素方法。
二、生产重组人类胰岛素的主要工艺流程生产重组人类胰岛素的主要工艺流程包括基因克隆、重组体表达、糖链修饰、纯化和结构鉴定等步骤。
1. 基因克隆生产重组人类胰岛素的第一步是从人类胰岛素基因库中选取A、B链基因、基因交链片段、启动子、终止子和选择反抗性基因等。
然后，在体外进行重组，使这些片段组合在一起，形成完整的胰岛素基因。
接下来，将这个基因克隆到表达载体上，以便细胞可以识别和表达它。
2. 重组体表达一旦重组表达载体被构建，便可以将其转化到大肠杆菌等生物中。
接着，这些生物被培养在液体培养基或固体培养基中，以促进基因表达和胰岛素蛋白合成。
重组人类胰岛素的产生需要大量的细胞培养，通常使用发酵罐、生物反应器和其他相关设备。
3. 糖链修饰胰岛素的生物活性取决于胰岛素蛋白中的糖链修饰。
然而，大肠杆菌在自然生态中并不会进行糖基化修饰，获取的表达产品如此也是裸露的蛋白链体，无法发挥生物活性。
为了获得具有生物活性的重组人类胰岛素，需要对其进行糖链修饰。
这个过程需要进行歧化和酶法处理，以检查和修改粘附到胰岛素蛋白上的糖基。
糖链修饰的最终产品可以具有各种形式的糖基链。
4. 纯化重组人类胰岛素是在细胞内产生的，因此需要进行后期精细纯化。
大肠杆菌生产制备重组人胰岛素工艺
1.提取目的基因:既从人的DNA中提取胰岛素基因,可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离.2.提取质粒:使用细胞工程,培养大肠杆菌,从大肠杆菌的细胞质中提取质粒,质粒为环状DNA.3.基因重组:取出目的基因与质粒,先利用同种限制性内切酶将质粒切开,再使用DNA连接酶将目的基因与质粒"缝合",形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒.4.将质粒送回大肠杆菌:再大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质,如CaCl2,这使细胞会吸收外源基因.此时将重组的质粒也放入培养液中,大肠杆菌便会将重组质粒吸收.5.胰岛素的产生:再大肠杆菌内,质粒通过表达转录与翻译后,便产生出胰岛素蛋白质.通过大肠杆菌的大量繁衍,便可大量生产出胰岛素!〖学习要求〗知道DNA的粗提取与鉴定的原理；掌握并能分析DNA粗提取的技术方法和要求；学会DNA分子的鉴定方法【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论，完成下列问题，并初步巩固。
一、基础知识【活动1】阅读教材P54“基础知识”，讨论并回答下列问题：1．（记忆）提取生物大分子的基本思路是利用它们的理化性质的不同进行分离。
2．（记忆）DNA的溶解性特点：DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精而蛋白质溶于酒精。
【思考1】据图5－1分析：DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度有何特点？在0.14mol/L时溶解度最小；要使DNA溶解，需要使用什么浓度？较高浓度，可使DNA溶解；要使DNA析出，又需要使用什么浓度？0.14mol/L可使DNA析出。
【思考2】利用DNA不溶于酒精的原理，可以达到将DNA和蛋白质进一步分离目的。
3．（记忆）DNA的耐受性特点：蛋白酶能分解蛋白质而不能分解DNA；在60～80℃时蛋白质变性沉淀而DNA 分子不变性。
洗涤剂能与蛋白质结合瓦解细胞膜而不破坏DNA分子。
4．（记忆）DNA的鉴定原理当鉴定提取出的物质是否是DNA时，需要使用二苯胺（甲基绿）进行鉴定。
重组人胰岛素原料药生产实验报告
重组人胰岛素原料药生产实验报告一、引言胰岛素是一种重要的药物，用于治疗糖尿病等疾病。
重组人胰岛素是指通过基因工程技术生产的胰岛素，与传统的动物源性胰岛素相比，具有更高的纯度和更好的效果。
本报告旨在介绍重组人胰岛素原料药生产实验的过程和结果。
二、实验设计1. 实验目的本实验旨在通过大肠杆菌表达系统生产重组人胰岛素原料药，并对其进行纯化和鉴定。
2. 实验步骤（1）构建表达载体：将人胰岛素基因插入大肠杆菌表达载体pET-28a(+)中。
（2）转化大肠杆菌：将表达载体导入大肠杆菌中，使其能够表达人胰岛素基因。
（3）培养大肠杆菌：在LB培养基中进行培养，使其能够表达出人胰岛素。
（4）收集细菌：将细菌离心收集，并用冷冻离心法裂解细胞获得包含目标蛋白的上清液。
（5）纯化目标蛋白：通过离子交换层析、凝胶过滤层析等方法对上清液进行纯化。
（6）鉴定目标蛋白：通过SDS-PAGE电泳、Western blot等方法对纯化后的目标蛋白进行鉴定。
三、实验结果1. 表达载体构建将人胰岛素基因插入pET-28a(+)表达载体中，经PCR扩增和酶切，得到正确的表达载体。
2. 转化大肠杆菌将表达载体导入大肠杆菌BL21(DE3)中，利用热激法转化。
经PCR检测和测序验证，转化效率较高。
3. 大肠杆菌培养在LB培养基中进行培养，经过16小时的培养后，细菌进入对数生长期。
经过4小时的诱导，大肠杆菌开始表达人胰岛素基因。
4. 目标蛋白纯化通过离子交换层析、凝胶过滤层析等方法对上清液进行纯化。
最终得到了高纯度的重组人胰岛素原料药。
5. 目标蛋白鉴定通过SDS-PAGE电泳、Western blot等方法对纯化后的目标蛋白进行鉴定。
结果表明，纯化后的目标蛋白具有正确的分子量和免疫反应性。
四、实验讨论本实验通过大肠杆菌表达系统成功生产了重组人胰岛素原料药，并对其进行了纯化和鉴定。
其中，表达载体构建和大肠杆菌转化是实验的关键步骤，需要严格控制条件以确保表达效率和转化效率。
重组人胰岛素生产工艺
手术和应激状态：在手术或应激状态下，重组人 胰岛素可以作为葡萄糖代谢调节剂，维持血糖稳 定
重组人胰岛素生产工艺流程
第三章
基因工程菌培养
基因工程菌的选 择与构建
培养基的配制与 灭菌
基因工程菌的培 养条件与过程
培养过程中的注 意事项与质量控 制
基因工程菌发酵
基因工程菌的选择与构建
基因工程菌的培养条件
重组人胰岛素生产工艺中的 关键技术
第四章
基因工程菌的选择和培养条件优化
基因工程菌的选择：选择具有高表达量、稳定性和适应性的工程菌株
培养条件优化：通过控制培养基成分、温度、pH、溶氧等条件，提高工程菌的生长和表 达水平
发酵过程监控：实时监测工程菌的生长和表达情况，及时调整培养条件
分离纯化技术：采用高效液相色谱、凝胶过滤等方法对重组人胰岛素进行分离纯化，确 保产品质量
质量控制和 监管：加强 质量控制和 监管，确保 重组人胰岛 素的安全性 和有效性
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汇报人：
重组人胰岛素的应用
糖尿病治疗：重组人胰岛素是治疗糖尿病的主要 药物之一，可以降低血糖，改善糖尿病症状
胰岛素缺乏症治疗：对于胰岛素分泌不足的糖尿 病患者，重组人胰岛素可以替代体症如 酮症酸中毒和高渗性非酮症性昏迷的治疗 中，重组人胰岛素可以降低血糖，纠正代 谢紊乱
变质。
原材料使用：按 照规定的投料量 和使用方法进行 操作，确保原材 料在生产过程中 得到充分利用， 同时避免浪费和
污染。
生产过程的质量控制
原料质量控制：对原料进行严格筛选和检测，确保符合质量标准 生产过程监控：对生产过程中的关键步骤进行严格监控，确保产品质量 稳定 成品检验：对成品进行严格检验，确保符合质量标准
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1970s----单峰胰岛素和 单组分胰岛素
70年代末----半合成胰岛素
1982年----采用基因重组技术生产的人胰岛素正式上 市。 1998年，成功研制出了中国第一支基因重组人胰岛素 制剂“甘舒霖” 90年代至今----重组人胰岛 素类似物成功研发上市， 包括超短效和长效人胰 岛素类似物。
1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相 同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不 同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。 动物来源的胰岛素（28种）
2、半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换 成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。 半合成来源的胰岛素（5种）
起效时间
常规皮下Ins: 30-90min 生理Ins： 0-20min
达峰时间
1.5-2.5h 30-45min
峰持续时间
2-4h 2-3h
作用消除时间
6-8h 3-4h
Lispro （赖脯胰岛素 ，Humalog ® ）是第一个用于临 床的速效胰岛素类似物,由美国礼来公司研制生产，将人胰 岛素的B28与B29位的氨基酸对换。。 Aspart（门冬胰岛素，Novolog ® ）由丹麦诺和诺德公 司研制生产，结构与人胰岛素的区别在于用天冬氨酸取 代了B链28位上的脯氨酸。 APIDRA （赖谷胰岛素，Apidra ® ）安万特公司研制， 以赖氨酸和谷氨酸分别取代了人胰岛素B3位的天冬氨酸 和B29位的赖氨酸。
眼部给药：INS主要通过眼结膜和鼻泪管黏膜吸收进 入体循环两达到降糖效果。一般眼内容量少，INS作 用时间短，生物利用度低．因此人们致力于研究能延 长INS作用时间的滴眼剂，并选择刺激性小的滴眼剂。
鼻腔给药黏膜内血管丰富．黏膜上蛋白酶含量也比胃肠道中 少，减少了INS被酶破坏失活。提高了药物的生物利用度。许 多药物动力学研究表明，鼻黏膜吸收INS的机制与体内内源性 的INS释放极为相似，为鼻腔INS给药提供了理论依据。鼻腔 给药需要加入吸收促进剂才能增加吸收效果
※AB链合成：分别表达AB链，化学方法连接 ※逆转录法：表达胰岛素原，酶切得到重组人胰岛素
重组DNA技术制造人胰岛素
1. AB链合成法：以人工合成的人胰岛素A链和 B链基因分别与半乳糖苷酶基因连接，形成融 和基因，分别在大肠杆菌中表达A链和B链， 然后再通过化学氧化作用，通过二硫键连接 起来。————已被淘汰
2. 深圳科兴
苏泌啉-- 常规重组人胰岛素注射液 苏泌啉恩-- 低精蛋白重组人胰岛素注射液
3. 徐州万邦
万邦林-- 常规重组人胰岛素注射液 万苏林—猪胰岛素制剂
其他（持有药品注册证）
---南京新天生物化学制药有限公司、华西医科大学制药厂、上海第一生化 制药厂、武汉生化制药厂 等
生产企业
SANOFI AVENTIS US PFIZER LILLY LILLY LILLY LILLY LILLY
药品名称
LANTUS LEVEMIR MIXTARD HUMAN 70/30 NOVOLIN 70/30 NOVOLIN L NOVOLIN N NOVOLIN R
生产企业
SANOFI AVENTIS US Novo Nordisk BAYER PHARMS Novo Nordisk NOVO NORDISK INC NOVO NORDISK INC NOVO NORDISK INC
------胰岛素B链29位赖氨酸侧链通过酰基化连接一个N-16-烷基 酸的14碳游离脂肪酸
●该游离脂肪酸能与白蛋白结合，延缓与胰岛素受体结合，从而延长其半衰
期。
glargine （Lantus®） 安万特公司研制
Insulin Detemir （Levemir ® ） 诺和诺德公司研制
胰岛素肺部吸入制剂--------Exubera
口服给药、局部给药……
人胰岛素分类 • 传统中长效胰岛素 • 长效人胰岛素类似物 • 速效人胰岛素类似物
• 非注射胰岛素
速效胰岛素
特点： • 起效快，皮下注射后15分钟起效。 • 达峰快，注射后15分钟起效，30～60分钟达到药效高峰。 • 药效维持时间短，大约在3小时左右（2～4小时）。 药代动力学特点与进餐后人体内源性胰岛素分泌十分相似， 能够很好地控制当餐后血糖而且不容易发生低血糖。
长效胰岛素-人胰岛素类似物
1. 甘精胰岛素（ glargine ）： 商品名Lantus® ------甘氨酸替代胰岛素A链21位门冬氨酸、并在B链末端 增加两个精氨酸。使胰岛素结合更多带正电的氨基酸 残基，改变等电点，使等电点由5.4上升至中性。这样， 胰岛素类似物在酸性条件下可溶，在生理的近中性条 件下结晶。 2. Insulin Detemir：商品名Levemir ®
人胰岛素原
B30 A8 B28 B28 A21
;A10 ;B29
;B30
;B31 ;B32
猪胰岛素 牛胰岛素 赖脯人胰岛素（礼来公司、速效Ins） 门冬胰岛素 （诺和诺德公司、速效Ins ） 甘精胰岛素 (安万特公司、长效Ins)
3D Structure of Insulin
胰岛素二聚体（dimer）
胰岛素的功能 • 稳定性 • Ins在弱酸性水溶液中或混悬在中性缓冲液中较稳 定 • 还原剂及多种重金属使Ins失活 • 紫外线、光氧化、超声波会引起Ins变性。 胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯一 同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。 药理作用 治疗糖尿病、消耗性疾病。
重组胰岛素的研究历史
●辉瑞、万安特以及Nektar ●于2006.1.27被FDA批准
共同研发
●一种作用快的胰岛素干粉吸入剂 ●适用于餐前给药，其胰岛素吸收具有
速效化的特征
胰岛素制备工艺
以动物胰脏为原料提取胰岛素
----酸醇提取法
半合成胰岛素 ----以猪胰岛素为原料，酶修饰后得到人胰岛素 重组DNA技术生产人胰岛素
发酵菌种 摇瓶种子培养 种子罐培养 生产罐发酵 离心除去菌体
微小胰岛素原溶液
超滤、离子交换吸附沉淀
胰岛素粗品
纯化的胰岛素原
胰酶和羧肽酶处理
离子交换色谱、分子筛色谱、二步反相色谱 重结晶、胰岛素纯品
酵母系统生产重组胰岛素
优点： 二硫键的结构与位置正确，不需要复性加工处理 缺点： 表达低，发酵时间长 表达载体结构基因组成：信号肽、前肽序列、MCS 和微小胰岛素原。 前肽序列引导目的蛋白通过正确的分泌途径至胞外。
重组人胰岛素的研究历史 和生产工艺
——BY: 王腾 时佳 孙玉新 玛依努尔
据世界卫生组织统计，2011年全球糖尿 病患者2.8亿，在中国，已突破9200万人， 发病率达10%，同时由于老龄化等因素，国 内还有9000多万的潜在糖尿病患者。加之 中国糖尿病患者整体治疗率不足三成，且 人均胰岛素使用量偏低，仅为美国糖尿病 患者人均使用量的0.8%，所以中国胰岛素 市场潜力巨大。
基因重组人胰岛素研 制成功
基因重组人胰 岛素实验
中国胰岛素市场状况
放眼全球，胰岛素作为最重要的糖尿病治疗药物， 在过去5年中取得了14%的复合增长率，2010年已达到 145亿美元的销售额。但胰岛素市场高度集中于三巨头 诺和诺德、礼来和赛诺菲安万特，三家公司占全球胰岛 素90%以上的市场份额。
目前临床使用的胰岛素来源
NOVO NORDISK INC
NOVO NORDISK INC NOVO NORDISK INC NOVO NORDISK INC NOVO NORDISK INC LILLY
胰岛素给药方式的发展
一种新的注射给药方式:NIS泵
通过一条与人体相连的软管向体内持续输注胰 岛素的装置。它模拟人体健康胰腺分泌胰岛素的 生理模式。俗称“人工胰腺”。
重组人胰岛素
胰岛素定义： 胰岛素是由胰岛β 细胞受内源性或外源性物质如 葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种 蛋白质激素。
胰岛素结构： 胰岛素由A、B两个肽链组成。A链有11种21个氨基 酸，B链有15种30个氨基酸，共26种51个氨基酸组成。 其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四个半胱 氨酸中的巯基形成两个二硫键，使A、B两链连接起来。 此外A链中A6(Cys)与A11(Cys)之间也存在一个二硫键。
HUMULIN 70/30
HUMULIN 70/30 PEN HUMULIN BR HUMULIN L HUMULIN N HUMULIN R HUMULIN R PEN
LILLY
LILLY LILLY LILLY LILLY LILLY LILLY
NOVOLIN R（Purified）
NOVOLOG NOVOLOG MIX 70/30 VELOSULIN BR VELOSULIN BR HUMAN HUMULIN U
胰岛素六聚体（hexamer ）
Ins的性质
1. Mw：5700 左右 pI：5.3～5.35 2. 溶解度 Ins 在 pH4.5~6.5 范围内几乎不溶于水，在乙醚中不溶，在 90％以上乙 醇或 80％以上丙酮中难溶。易溶于稀酸或稀碱 溶液，在 80％以下乙醇中也可溶解。 3. 在溶液中的状态 胰岛素的锌盐在 pH2 呈二聚体，随 pH 升高，聚合作用增强 在 pH4～7 时，聚合成不溶解状态的沉淀 pH>9 时解聚并失活 4. 稳定性 Ins 在弱酸性水溶液中或混悬在中性缓冲液中较稳定 还原剂及多种重金属使 Ins 失活 紫外线、光氧化、超声波会引起 Ins 变性。
维持血液中INS水平 缩短控制高血糖的时间 减少低血糖发生， 减轻病人多次皮下注射INS的痛苦 INS泵是强化治疗的最佳手段
口服给药：由于采用了包裹的方法来保护胰岛素制 剂，口胰岛素在胃及小肠内不被破坏，在大肠内分 解、释放出来，通过肠黏膜进行吸收。