茶叶多酚氧化酶及其同工酶的研究进展
红茶加工中多酚氧化酶、过氧化物酶和β-葡萄糖苷酶活性变化
基金项目：湖南省科技重点项目“高茶黄素红茶加工关键技术研究与产品开发”(2012WK2009)；长沙市科技重点项目“茶黄素提取物高效低成本生产关键技术创新与产业化开发”(K1307136-21)；湖南省教育厅科学研究重点项目“茶叶多酚氧化酶同工酶的分离鉴定及其酶促合成茶黄素组分机制研究”(13A034)；湖南省科技厅项目“茶黄素提取物高效低成本生产关键技术创新”(2014NK3055)。
第一作者简介：丰金玉，女，1989年出生，湖南常德人，硕士研究生，主要从事茶叶加工及品质化学研究。
通信地址：410128湖南省长沙市湖南农业大学园艺园林学院，Tel ：0731-********，E-mail ：545437522@ 。
通讯作者：肖文军，男，1969年出生，湖南城步人，教授，博士，主要从事茶及植物功能成分利用研究。
通信地址：410128湖南省长沙市湖南农业大学园艺园林学院，Tel ：0731-********，E-mail ：xiaowenjungong@ 。
收稿日期：2014-03-25，修回日期：2014-04-23。
红茶加工中多酚氧化酶、过氧化物酶和β-葡萄糖苷酶活性变化丰金玉1，刘昆言1，秦昱1，熊硕1，邓燕莉1，龚志华1，肖文军1,2（1湖南农业大学茶学教育部重点实验室，长沙410128；2长沙和润茶业科技有限公司，长沙410128）摘要：以‘桃源大叶茶’1芽2叶为材料，研究多酚氧化酶、过氧化物酶和β-葡萄糖苷酶在工夫红茶加工工艺中的动态变化，分析加工叶水分含量对3种酶酶活性的影响，以期为高香高茶黄素红茶的加工提供参考。
结果表明，随着萎凋时间延长，3种酶酶活性均呈现不同程度的增加，萎凋14h 后，多酚氧化酶酶活性达到鲜叶的2.9倍，过氧化物酶酶活性达到鲜叶的3.5倍，β-葡萄糖苷酶活性达到鲜叶的2.1倍，在揉捻、发酵、干燥工艺中，3种酶活性不同程度地下降。
根据研究结果可推断，β-葡萄糖苷酶对红茶香气品质的影响主要表现在萎凋过程及发酵早期，多酚氧化酶、过氧化物酶对红茶滋味品质的影响主要集中在发酵工艺，可依据萎凋叶中3种酶的活性变化程度及失水情况，确定萎凋适度的标准，依据发酵叶中的多酚氧化酶与过氧化物酶的比值变化情况，确定发酵适度的标准。
茶叶酶研究的方法与进展
福建农林大学学报(自然科学版)第32卷第1期Journal of Fujian A griculture and Fo restry U niversity(N atural Science Editi on)2003年3月茶叶酶研究的方法与进展刘乾刚1,林 智2,蔡建明3(1.福建农林大学园艺学院,福建福州350002;2.福建省茶叶进出口有限责任公司,福建福州350001; 3.安溪县农业与茶果局,福建安溪362400)摘要:对茶叶酶研究方法、动态及成果进行了概述.随着研究技术、思路的拓宽,茶叶酶研究与应用领域已从内源酶扩展到外源酶,从酶的性状表现追踪到遗传特性,从酶活性的环境调控措施深入到化学干预,从自然状态下酶的利用发展到经过加工处理后酶的应用阶段.关键词:茶叶;酶;研究方法;进展中图分类号:S571.1文献标识码:A文章编号:100627817(2002)0420074205M ethods and progress on the research of tea enzy m esL I U Q ian2gang1,L I N Zh i2,CA I J iang2m ing3(1.Co llege of Ho rticulture,Fujian A griculture and Fo restry U niversity,Fuzhou,Fujian350002,Ch ina;2.Fujian T eaI mp.&Exp.Co.,L td.,Fuzhou,Fujian350001,Ch ina;3.A nxi A griculture&T ea2F ruit A dm inistrati on,A nxi,Fujian 362400,Ch ina)Abstract:R esearches on enzym es of tea in ter m s of the m ethods and their app licati ons as w ell as the trends w ere review ed and discussed.R ecently,the m ethods,technical o r ideo logical,have been so m uch developed and extended that the p rogress has been speeding in exp lo rati on and utilizati on of bo th internal and external enzym es,in inquisiti on into the rela2 ti onsh i p s betw een genetic characters and enzym e behavi ours,in chem ical and environm ental regulati on of enzym atic activi2 ties and in extensi on of the utilizati on of enzym es in the natural state to that of specially treated and i m p roved ones.Key words:tea;enzym e;research m ethod;p rogress酶的研究方法一直受到茶叶化学界的关注.酶的基本研究内容包括分子结构、反应类型和动力学特性分析等,与此相关的酶提取纯化、结构分析、活性测定等技术,已经成为酶研究中经常采用的方法.随着这些方法的应用,与茶树代谢、制茶转化及品质有关的重要酶类不断被发现和研究,通过调控酶活性来提高鲜叶质量和制茶品质的栽培与加工措施也日益完善.酶的研究方法也由过去单一的常规分析发展到同功酶、分子标记和酶工艺化学等技术并举的多元化格局.1 茶叶酶研究的基本方法1.1 酶的提取纯化 通过对酶的提取和纯化,去除酶制剂中的杂质或干扰成分,提高目标酶的浓度,从而有利于酶学研究试验条件的控制和结果的分析比较.红茶发酵“红变”曾一度被认为与微生物或细胞色素氧化酶的作用有关[1].但在对相关氧化酶的纯化过程中发现,随着酶纯度的提高,Cu含量提高,而Fe含量逐渐降低;当除去Cu离子或使用铜酶抑制剂时,发酵进程受阻.这项试验表明铜酶与“红变”之间存在着某种内在联系,为最终确立多酚氧化酶在红茶发酵中的地位起到了重要的推动作用[1,2].Roberts[3]将纯化的多酚氧化酶与各种组合的儿茶素底物混和,进行模拟氧化试验,并对氧化产物与红茶茶汤色素的种类和结构进行比较分析,提出了关于红茶发酵机理的经典学说.目前,茶叶生物化学在儿茶素合成途径、茶氨酸代谢、香气成分转化及制茶过程大分子物质水解等相关化学机理的研究方面已取得明显进展[2,4-11].然而,对于其机理(酶系存在与否、反应类型等)的最后阐明还须进行深入的酶学研究,也离不开酶提取纯化技术的运用.收稿日期:2002-04-29作者简介:刘乾刚(1962-),男,讲师,硕士.研究方向:茶叶品质化学,市场推广.1.1.1 酶的提取 茶叶酶的提取主要有丙酮和匀浆2种方法[12].由于茶组织中多酚类含量丰富,在未使用多酚吸附剂之前,茶叶中酶的提取率一直处于较低水平[13].后来发现,如果在茶叶酶提取过程中加入多酚吸附剂,则能有效防止多酚类物质对酶蛋白的凝固沉淀作用,从而降低离心沉淀部分的酶活性,提高上清液中酶的含量[14,15](表1).15000g 离心时未加聚酰胺处理的上清液中多酚氧化酶的活性几乎等于零,但加入聚酰胺之后,其活性则恢复到总活性的26%[14];另外,聚酰胺处理能大幅降低1400g 沉淀部分的酶活性,与不处理比较降幅达71%.Sanderson [15]的结果还表明,多酚吸附剂可明显提高上清液中蛋白质含量.以上试验说明,在茶组织酶的提取过程中,加入适当的多酚吸附剂可以提高酶提取率.此外,茶组织充分破碎或根据酶存在部位进行细胞自溶、采用有机溶剂和表面活性剂处理等都能使酶得到最大限度的释放[16],从而提高酶的提取率. 离心处理是制备“粗酶液”时常采用的一个步骤,主要是为了除去细胞器、细胞组织碎片等体积较小的悬浮物.究竟采用多大离心力,要视试验目的来作选择.通常,供层析(纯化)用的酶提取液应尽量去除其中小颗粒悬浮物,一般采用较大离心力进行离心.如用作可溶性酶活性的测定,则理论上不允许酶供试液中存在任何细胞组织碎片.在一些试验中,离心处理用于分离各种细胞器,这时离心力大小应以细胞器质量为依据,操作程序和时间也是其考虑的重要因素.分离物及其离心条件见表1. 表1 细胞器、细胞碎片的离心沉淀条件 T able 1 Centrifugal separati on fo r cell o rgans and p ieces 沉淀部分离心力时间 m in 文献细胞壁碎片300g -[17]叶绿体600-800g 10[14,17,18]1500g 151400g 5线粒体15000g 60[14]微粒体30000g 30[18]所有颗粒80000g 120[19]1.1.2 酶的纯化 酶的纯化是为了制备高含量高纯度的酶制剂,因使用目的不同,对酶制剂纯度的具体要求也不一样,因而采用的方法也不同,主要有以下几种. 透析法:主要用于去除酶液中的小分子物质,如盐分、辅酶、化学试剂、反应底物和产物等. 超滤法:由于采用了真空、加压或离心等,分离效率较高,可用于较小分子质量酶蛋白的分离,也常用来进行酶液的浓缩处理. 柱层析法:是将一定的载体装填于柱内,按上样、洗脱、洗脱监测和分步收集等程序,对不同酶蛋白进行分离纯化的方法.该方法技术性强、设备专业且性能要求较高,常用于酶蛋白组分的分离和测定.载体类型和型号、洗脱液及洗脱条件都是柱层析技术构成中的基本要素.进行实际操作时,可参阅有关专著[18].T akeo et al [19]对茶叶中的多酚氧化酶进行了提取和纯化,并将该酶分离为3个组分.在其方法应用方面,较早使用了多酚吸附剂(吐温80)和抗氧化剂(异抗坏血酸),这已被后来的许多试验设计所借鉴.其中“粗酶液”的制备是在较大离心力下(15000g )重复进行了3次离心,以去除小颗粒悬浮物,为随后的柱层析作准备.T akeo et al [19]认为,采用80000g 离心是为了确保其上清液中的酶活性全部来自可溶酶,而不含任何细胞碎片上的结构酶.试验同时使用了3种层析柱,G 225柱主要用于多酚氧化酶的纯化,而D EA E 和C M 纤维素离子交换柱则使该酶组分达到进一步分离.1.2 酶分子质量的测定 酶分子质量是酶学研究的一项基本内容.研究酶分子质量需要一定的技术手段,同时其成果又在工作参数选择上为酶的其他分析方法的应用提供了必要的依据.例如,分子筛柱层析方法中,目标酶的分子质量决定了载体孔径(型号)的选择. 研究酶分子质量可采用超速离心法、凝胶过滤法(分子排阻法)和SD S 凝胶电泳法[18,20].到目前为止,已对多种茶叶酶的分子质量进行了测定,其中重要的酶类有多酚氧化酶、过氧化物酶、叶绿素酶、乙醇脱氢酶、核酸酶、苹果酸脱氢酶等[6,21].1.3 酶反应动力学 酶的动力学研究是酶学研究中最基本、最核心的内容.酶的动力学研究的目的是了解一种酶在不同因子影响条件下所表现出来的作用特点和规律,具有普遍的指导意义.研究的因子包括底物、产物、pH 、温度、抑制剂和激活剂等,主要从对酶的结构及其活性的影响入手.1.3.1 底物 主要研究底物浓度、多底物竞争及底物与酶分子之间的亲和力对酶促反应的影响.迄今为・57・第1期刘乾刚等:茶叶酶研究的方法与进展止,已对多种茶叶酶底物的专一性进行了深入研究[6,21].1.3.2 产物 主要研究产物积累对酶活性的反馈抑制作用.有关茶叶方面有少量的研究报道.1.3.3 pH 研究pH 变化对酶活性的影响.有关茶叶方面已有大量报道[6,9,11,21,22],并对多种酶的最适pH 进行了研究[6,21],其部分成果已用于指导生产.1.3.4 温度 研究温度对酶活性的影响.目前,已经确定了多种茶叶酶的最适温度和部分茶叶酶的热变性温度[6,21,23],其成果已应用于红茶发酵和绿茶杀青温度条件的制定[1,23].另外,已在气温和年积温对茶树碳、氮化合物整体代谢水平的影响方面做了大量工作.1.3.5 抑制剂 已对茶叶酶的大量相关试验研究作了总结[6,21].抑制剂的运用也已成为一种酶学方法,在探索茶树代谢和制茶转化机理方面发挥了重要的作用[1,24].1.3.6 激活剂 已确定了多种茶叶酶的辅酶(基)[6,21].近年来,稀土元素广泛应用于茶叶的增产增质[25],但其作用机制尚待探明.1.4 同功酶分析 自1966年T akeo et al [19]报道分离出了茶多酚氧化酶的同功酶以来,过氧化物酶同功酶的研究也取得了明显进展.1986-1990年,许多研究者对红茶、乌龙茶制造过程中多酚氧化酶和过氧化物酶同功酶谱带及活性变化进行了研究[26-28].结果表明,各种同功酶在儿茶素氧化及色素形成中的作用有所不同[26].1992年,鲁成银等[29]对103个茶树种质资源的酯酶同功酶的比较分析结果:茶树进化的途径是大叶种→中叶种→小叶种,并确定了它们之间的亲缘关系.此前,还研究了超氧化物歧化酶、过氧化物酶同功酶谱带数目和总活性与茶树抗寒性的关系[30]等.同功酶分析技术在揭示茶树生物学特性、遗传关系及制茶化学原理等方面显示出越来越重要的作用. 同功酶分析可采用柱层析、薄层层析等方法.但目前以使用凝胶电泳、等电聚焦2种方法较为普遍.1.4.1 凝胶电泳 常以聚丙烯酰胺凝胶作为载体.合适的凝胶浓度、制胶质量、上样操作等是决定分离效果的关键[18].1.4.2 等电聚焦 是在凝胶电泳方法基础上改进而成的[18].它与凝胶电泳的不同之处在于:等电聚焦在凝胶柱内注入了两性电解质,从而使凝胶柱形成了一定的pH 梯度.当带电荷的酶蛋白分子泳动至等电点(pH )区域时,因其净电荷为零而停止泳动.该方法分离效果较好,但要求目标酶蛋白在等电点条件下不产生沉淀或变性.1.5 酶的分布及其活性变化 研究酶的亚细胞定位、组织分布及在物候交替、茶树生长发育和制茶过程中的活性变化.1.5.1 酶的亚细胞定位 迄今,已对植物细胞内光合作用、呼吸代谢、脂肪转化等相关酶系的定位进行了卓有成效的探索,对于进一步阐明生物反应机制及不同代谢途径之间的关系具有重要意义.有关茶树研究中,最早因茶树多酚氧化酶很难被提取而引起了对茶叶酶细胞内定位的关注和讨论[13-15].1947年前后,普遍认为茶的多酚氧化酶是一种结构酶[13].后来的试验则表明该酶大部分是可溶性的,广泛分布于各种细胞器中[31].到目前为止,有关报道主要集中在多酚氧化酶、过氧化物酶、脂质降解酶等少数几种酶的定位方面,其主要目的是为了对这些酶进行有效的利用或控制. 通常,酶的亚细胞定位采用组织化学观测和离心分离检测2种方法.其中,离心分离检测法的应用较为广泛,但仍存在不足[17,31]:其一是离心收集部分的纯度及各部分之间的相互污染问题;其二是细胞器破损带来的基质和碎片损失,即最终收集到的细胞器不能真实反映某种细胞器的整体酶活性问题.对此,有报道提出了离心分离与同功酶分析相结合的酶定位方法,并就该方法的试验结果及应用作了说明和讨论[31].1.5.2 酶的组织分布 酶在茶树根、茎、叶及叶表皮、叶脉、叶梗中的活性分布是制茶原料、制造化学及基础生理生化研究的一项基本内容,其中针对叶片组织的研究尤为重要.在绿茶制造中防止叶梗的红变、红茶制造中促进某些发酵产物的积累、乌龙茶做青中通过“走水”对叶梗和叶脉内酶的利用等实践中,首先涉及到相关的主要酶类,以及这些酶的活性分布与制茶工艺及品质的关系11.5.3 酶的活性变化 目前,已对物候交替、生长发育及制茶过程中茶叶酶的活性变化进行了广泛的研・67・福建农林大学学报(自然科学版)第32卷究[1,2,7,9,11,22-24,26-28,32].2 酶的获取、加工和利用 随着茶饮料加工工业化进程的加快和新产品的不断开发,茶内源酶的含量及自然属性已经不能满足生产上日益增长的各种需求.另外,传统茶加工过程中各种成分转化之间的交互作用和平衡,使其加工工艺不宜针对某一突出问题(如滋味苦涩、茶汤沉淀)或为实现某种成分的超常积累(如茶黄素、萜烯类)而采取“极端”措施.因而,酶的获取、加工及利用的重要性便由此凸显出来.2.1 酶的获取 早在速溶茶的生产中,就采用了单宁酶制剂“转溶”的处理方法,以提高速溶茶的溶解性和消除茶汤的“冷后浑”现象.目前,酶制剂的种类除单宁酶外,还有多酚氧化酶、蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、Β2糖苷酶等多种类型[33];用于酶提取的植物材料也从土豆、果实等发展到今天经过特殊改良和培养的微生物菌群.饮料、食品加工业用酶制剂有严格的卫生要求.增加酶提取率、降低成本及提高酶制剂的稳定性是今后需要重点研究和解决的问题.2.2 酶的加工和利用 酶的加工是指对酶的自然属性(工作状态、酶学性质)进行处理改造或化学修饰.酶的固定化便是其中的一种.据研究[34],Β2葡萄糖苷酶经壳聚糖固定化之后最适温度提高10℃,酶最高活性温度范围加大为40-60℃.在室温下保存3个月,经检测表明,这种固定化酶的活性并无明显下降.另据报道[35],将一定的 图1 酶固定处理方法 F ig .1 M ethods of i m mobilizing enzym es酶固定在膜上可起到茶汤浓缩、转溶和增香的效果.酶固定化的方法较多,总体上可分为3种处理方式(图1).提行酶的化学修饰是一门酶化学工艺学.它的理论基础是酶反应动力学原理,其主要目标为:保持酶结构的完整性;增强酶蛋白空间结构的稳定性;维持和保护酶催化基团的工作状态和微域环境. 经过加工后的酶在耐热、抗酸碱、抵御抑制因子及催化效能等方面都得到了全面的提高和改善.随着酶生产工业的发展,酶的加工技术必将达到新的水平,各种酶制剂(或酶反应器)的应用也会更加普及、有效.参考文献:[1]王汉生.红茶制造生物化学[A ].安徽农学院.茶叶生物化学(第2版)[M ].北京:农业出版社,1988.210-258.[2]李荣林,方辉遂.一个世纪以来茶多酚氧化酶研究的进展[J ].福建茶叶,1997,(4):10-14.[3]ROBER T S E A H .Econom ic i m po rtance of flavono id substances :tea fer m entati on [A ].GE ISS M AN T A .The Che m -istry of Flavono id Co m pounds [M ].New Y ork :Pergam on Press I nc ,1962.649-699.[4]萧伟祥.茶叶中儿茶素的生物合成途径[A ].安徽农学院.茶叶生物化学(第2版)[M ].北京:农业出版社,1988.103-109.[5]SA I JO R ,TA KEO T .Som e p roperties of the initial four enzym es invo lved in sh ik i m ic acid bi o synthesis in tea p lant[J ].Agr i B iol Che m 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leaf po lypheno l oxidase .Purificati on and p roperties of the so lubilized po lypheno loxidase in tea leaves [J ].Agr i B iol Che m ,1966,30(2):155-163.[20]金长振.酶学的理论与实际[M ].北京:北京科学技术出版社,1989.54-60.[21]李名君.茶叶酶类[A ].茶业卷编辑委员会.中国农业百科全书——茶叶卷[M ].北京:农业出版社,1988.126-129.[22]萧伟祥.茶的多酚氧化酶和过氧化物酶的研究进展[J ].茶业通报,1983,(6):3-6.[23]周静舒.绿茶制造中酶的热失活[A ].安徽农学院.茶叶生物化学(第2版)[M ].北京:农业出版社,1988.259-264.[24]孙跃进,黄雨初.红茶萎凋、发酵中的糖酵解、三羧酸循环及其与挥发性成分的形成[J ].茶叶科学,1985,5(2):39-48.[25]钱利生.稀土元素与茶树的高产优质[J ].福建茶叶,1994,(3):18-21.[26]叶庆生.红茶萎凋发酵中多酚氧化酶和过氧化物酶同功酶的活性变化与儿茶素、茶黄素组分的消长[J ].安徽农学院学报,1986,(2):18-29.[27]刘仲华,施兆鹏.红茶制造中多酚氧化酶同功酶谱与活性的变化[J ].茶叶科学,1989,9(2):141-150.[28]郭吉春,张劲松.乌龙茶做青过程生化成分的变化[A ].福建省茶叶学会.闽台茶叶学术讨论会论文集[C ].福州:福建省茶叶学会,1990.97-104.[29]鲁成银,刘维华,李名君.茶种系间的亲缘关系及进化的酯酶同功酶分析[J ].茶叶科学,1992,12(1):15-20.[30]黄建安.茶树保护性酶类与抗寒性的关系[J ].茶叶科学,1990,10(1):35-40.[31]刘乾刚.茶多酚酶细胞内定位及其与红茶色素形成的研究进展[J ].福建茶叶,1988,(3):11-15.[32]刘乾刚,林智,蔡建明.乌龙茶制造与品质形成的化学机理[J ].福建农林大学学报(自然科学版),2002,31(3):347-351.[33]余凌子,赵正惠.酶制剂在茶叶加工中的应用[J 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茶叶多酚氧化酶基因克隆与序列分析
琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 后 ， 切 下 目 的 带 ， 用 OJPC=B $%& 连接、 转化、 鉴定按常规方法’!M) ,@<C6*:Q 试剂盒回收。 进行。
!"#"H
序列分析与同源性比较
根据测序 得 到 的 核
苷酸序列， 用 %,9R 的 .-S;J6B 程序推导目的基因的 氨 基 酸 序 列 T 并 利 用 $%& KUC= 和 %,9R 的 9@CKU 分 析 软件对获得的核苷酸序列和推导氨基酸序列进行序 列比对和聚类分析。
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系统发育进化分析
用 $%&ZUC= 软 件 的 子 软 件 A<7@J76 ， 采 用 “ 9[
对 茶 叶 与 其 它 植 物 克 隆 的 ++. 基 因 ,@:KUC@ A<U\?B ” 。 进行多重比较， 得出如下的进化树（ 图 #）
上述进化树图可以明显分为两大 类 ， 一 类 是 以 甘 蔗 为 代 表 的 ,H 植 物 ， 另 一 类 是 其 它 所 有 的 ,3 植 物。 在 ,3 植物系统内， 又划分为进化程度较低的苔藓 植物和其它高等植物。对于茶叶， 本研究克隆的三个 基因与国际数据库公布的茶叶基因聚为一大类， 其 中 适 制 红 茶 的 英 红 G 号 和 &X(/GGM/ 两 个 茶 树 品 种 先聚为一类后， 再与适制绿茶的福云 ( 号聚为一类，
!
结果与分析
用设计的引物进行 ++. 基因的 +,- 扩增 T +p;() 扩增
反应采用热启动法。+,- 产物经 5"LN 琼脂糖凝胶电 福云 ( 泳检测。结果表明， 南昆山毛叶茶、 英红 G 号、 号均扩增出大小约 !"LVW 的目的条带（ 见 图 !） ， 与预 期大小一致。把回收的目的片段同 1 载体连接、 转 化、 鉴定后把阳性克隆子交由测序公司测序。
茶叶中多酚类物质的抗氧化性研究报告
茶叶中多酚类物质的抗氧化性研究报告茶叶是一种常见的饮料，它含有丰富的多酚类物质。
在过去的几十年里，多酚类物质因其抗氧化性能而受到了广泛的关注和研究。
在本篇报告中，我们将对茶叶中多酚类物质的抗氧化性进行深入研究，并对其可能的应用进行探讨。
一、多酚类物质在茶叶中的含量和组成茶叶中含有丰富的多酚类物质，主要包括儿茶素（Catechin）、黄酮类（Flavonoid）和花色素（Anthocyanin）等。
儿茶素是茶叶中含量最丰富的多酚类物质，其含量在不同种类的茶叶中会有所不同。
绿茶中儿茶素的含量最高，紧随其后的是白茶、乌龙茶和红茶。
二、茶叶中多酚类物质的抗氧化性多酚类物质具有很强的抗氧化性，可以中和自由基，减少氧化反应的发生。
茶叶中的多酚类物质能够清除体内过氧化物、抑制基因突变及脂质过氧化等，进而起到抗氧化的作用。
这一特性使得茶叶被广泛应用于保健品、化妆品和食品等领域。
三、茶叶中多酚类物质的生物利用度尽管茶叶中多酚类物质具有很高的抗氧化性，但其生物利用度却相对较低。
多酚类物质在人体中很难被吸收，且易被胃酸分解。
因此，为了提高茶叶中多酚类物质的生物利用度，可以通过酶法酶解或微生物发酵等方法进行处理。
这样可以改善多酚类物质的生物可利用性，从而提高其抗氧化性能。
四、茶叶中多酚类物质的应用前景茶叶中多酚类物质的抗氧化性使其在保健品、化妆品和食品等方面具有广阔的应用前景。
茶叶中的多酚类物质可以用于制备保健品，具有提高人体免疫力、延缓衰老和抑制肿瘤细胞生长等功效。
在化妆品领域，多酚类物质可以用于抗衰老、美白和抗炎等方面。
此外，多酚类物质还可以作为食品添加剂，用于保鲜、抗氧化和防腐等方面。
总结：茶叶中多酚类物质具有很强的抗氧化性，具有广泛的应用前景。
尽管多酚类物质的生物利用度较低，但可以通过酶解和发酵等方法进行改善。
未来的研究可以进一步探索茶叶中多酚类物质的生物活性和相互作用机制，以及提高其生物利用度的方法。
这将有助于更好地利用茶叶中的多酚类物质，并开发出更多的应用产品，从而促进茶叶产业的发展。
酶工程技术在茶叶方面的应用研究进展
酶工程技术在茶叶方面的应用研究进展一、本文概述茶叶，作为中华民族的传统饮品，承载着深厚的历史文化底蕴，同时也是世界范围内广泛消费的饮料。
茶叶的品质与口感，深受其生产过程中各种酶的影响。
随着生物技术的飞速发展，酶工程技术在茶叶生产中的应用逐渐显现出其独特的优势。
本文旨在综述近年来酶工程技术在茶叶方面的应用研究进展，以期为茶叶产业的科技创新和品质提升提供理论支持和实践指导。
本文将首先回顾酶工程技术在茶叶加工过程中的应用，包括茶叶发酵、杀青、揉捻等环节，分析酶对茶叶品质的影响及其作用机制。
随后，将重点介绍酶工程技术在茶叶功能成分提取和转化方面的研究进展，如茶多酚、儿茶素等关键成分的酶法提取和改性技术。
本文还将探讨酶工程技术在茶叶深加工产品开发中的应用，如茶饮料、茶食品等。
对酶工程技术在茶叶领域的应用前景进行展望，以期为未来茶叶产业的发展提供新的思路和方法。
通过本文的综述，我们期望能够为茶叶产业的科研工作者和从业人员提供酶工程技术在茶叶方面的应用研究进展的全面认识，为推动茶叶产业的科技创新和品质提升贡献力量。
二、酶工程技术在茶叶加工中的应用酶工程技术在茶叶加工中的应用，已经取得了显著的研究成果。
这些技术不仅优化了茶叶的生产过程，提高了茶叶的品质，还丰富了茶叶的种类和口感。
在茶叶的初制过程中，酶工程技术被广泛应用于提高茶叶的发酵程度。
通过调控茶叶中的酶活性，可以有效地控制茶叶的发酵速度和程度，从而得到不同风味和品质的茶叶产品。
例如，通过利用特定的酶制剂，可以促进茶叶中的多酚类物质氧化，加速茶叶的发酵过程，使茶叶呈现出独特的香气和口感。
酶工程技术还在茶叶的精制过程中发挥着重要作用。
在茶叶的精制过程中，酶可以用于改善茶叶的色泽、提高茶叶的香气和滋味。
例如，通过利用某些酶制剂处理茶叶，可以有效地降解茶叶中的色素物质，使茶叶的色泽更加鲜亮；同时，这些酶制剂还可以促进茶叶中香气物质的形成，使茶叶的香气更加浓郁。
除了上述应用外，酶工程技术还在茶叶的深加工中发挥着重要作用。
多酚氧化酶的研究现状
多酚氧化酶的研究现状多酚氧化酶的研究现状论文关键词：多酚氧化酶(PPO);催化机理;生理功能一、多酚氧化酶PPO的结构特性二、PPO的催化机理三、PPO的生理功能PPO作为一种氧化还原酶还在光合作用中发挥作用。
如调节叶绿体中有害的光氧化反应速度，参与其中电子传递;PPO还可促进伤口的愈合，也可增加植物对病原体的抗性。
如烟草对炭疽病、黄瓜对黑星病、苹果对轮纹病、棉苗对枯萎病菌、水稻对白叶枯病菌和细菌性条斑病以及番茄对小昆虫的抗性等。
PPO的`作用方式有：1.如番茄的具腺毛状体中含有大量PPO，PPO具有存在于表皮中、活化态和可溶性的特性，在毛状体介导的抗病过程中起作用[12]。
4.如番茄中PPO克隆的反义表达可对基因家族的各成员进行负调节，对病原体产生超敏感性(感受性过敏)[14]。
四、PPO活性影响因素随着诱导剂特性的不同，PPO的分子特性如分子量、等电点等都有所改变。
生长培养基的成分也可部分地控制PPO酶产量，例如：硫酸铵抑制PPO形成，而谷氨酸促进PPO形成。
在植物组织中激活剂可打破PPO的潜伏状态。
在蚕豆中PPO可被游离脂肪酸酸化激活，菠菜类囊体中分离出来的PPO可被亚麻酸激活。
这表明PPO的天然激活剂确实存在。
同样PPO的天然抑制剂也存在，例如菠菜叶中的草酸盐，茶叶中的橡黄素、白花青素等。
矿物质营养例如钙或磷的缺乏可导致PPO活性的降低;硼缺乏对单子叶植物无影响，但可导致双子叶植物中PPO活性的增加。
植物正常新陈代谢受到干扰也会导致PPO活性的改变：例如贮存时通风不好或生长时水分不够均可引起PPO水平的升高。
铜是PPO的组成部分，铜缺失时苜蓿叶片不能表现出PPO酶活性，即使后来再补充铜也不行，这说明全酶只能在发育的早期形成。
钟瑾等[16]用自制壳聚糖与戊二醛交联对PPO固定化进行了初步探讨，表明当戊二醛浓度为2%时，酶活力最高，并提出在确定给酶量时，要兼顾酶活和回收率二者的影响以达到最佳。
酶工程技术在茶叶方面的应用研究进展
2021年2月Feb.2021第41卷第2期Vol.41,No.2热带农业科学CHINESE JOURNAL OF TROPICAL AGRICULTURE酶工程技术在茶叶方面的应用研究进展武珊珊1)丁其欢1)周雪芳2)马占霞1)杨雪梅1)邵宛芳1)苏建美1)(1滇西应用技术大学普洱茶学院云南省普洱市665000;2云南省绿色食品发展中心云南省昆明市650000)摘要综述近年来不同酶工程技术，如酶的化学修饰、固定化酶技术、生物酶传感器等在茶叶中天然酶的获取、各类茶的初加工、茶叶的深加工及茶叶检测等方面的国内外应用研究成果，并对酶工程技术在茶叶方面的应用发展前景进行展望。
关键词酶工程技术；茶叶初加工；茶叶深加工；茶叶检测；茶叶保鲜中图分类号S188+.3文献标识码ADOI ：10.12008/j.issn.1009-2196.2021.02.019Application of Enzymes in Tea PreparationWU Shanshan 1)DING Qihuan 1)ZHOU Xuefang 2)MA Zhanxia 1)YANG Xuemei 1)SHAO Wanfang 1)SU Jianmei 1)(1College of Tea,West Yunnan University of Applied Sciences,Pu'er,Yunnan 665000,China;2Yunnan Green Food Development Center,Kunming,Yunnan 650000,China)Abstract The recent researches in application of enzymes in preparation of teas,such as tea natural enzyme extraction,tea preliminary processing and deep processing and tea detection were reviewed,based on which an outlook for application of enzymes in tea preparation in the future is put forward.Keywords enzyme ;tea preliminary processing ;tea deep processing ;tea detection ;preservation of tea酶工程是于1971年第一届国际酶工程会议上首次命名的一项技术，即将酶学基本原理与化学工程技术及基因工程有机结合形成的新型应用技术，是基因工程、蛋白质工程、细胞工程、发酵工程以外的现代五大生物工程技术之一，主要研究酶的生产纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰与改造等，在工农业、医药卫生等领域广泛应用。
酶工程在茶饮料中的应用及研究进展
苹果中提取的酶制剂直接加工成速溶茶的制造工 艺，并取得了专利[24]。日本人竹元万寿美曾用简单 经济的方法制造富含茶黄素类的发酵茶饮料，并 获得了专利[25]。此外，多酚氧化酶还可用于茶饮料 生产过程中异味的去除、独特风味物质的形成、 解决浑浊现象等方面[26]。 1.4 β-葡萄糖苷酶
β-葡萄糖苷酶（Beta-Glucosidase，EC3.2.1.21） 又称 β-D-葡萄糖苷水解酶，它能水解结合于末端 非还原性的 β-D-葡萄糖键，同时释放出 β-D-葡 萄糖和相应的配基。香气形成机理研究结果表明， 内源糖苷酶对茶叶花香形成起着很重要的作用 。 [27] 比如茶叶中具有百合花香或玉兰花香味的芳樟醇、 具有玫瑰香气的香叶醇等，这些芳香物质的形成 是由糖苷类水解酶的作用而产生的。Su E. Z.等人对 固定化 β-葡萄糖苷酶在茶饮料的增香效果中得出 经固定化 β-葡萄糖苷酶处理的不同茶饮料，绿茶、 乌 龙 茶 和 红 茶 的 香 精 油 总 量 分 别 增 加 20.69% 、 10.30%、6.79%[28]。李平等人将黑曲霉 β-葡萄糖苷 酶应用于果汁、茶汁、果酒等食品的增香，显示 出较好的增香效果[29]。吕连梅用固定化的 β-葡萄糖 苷酶处理 5 种茶汤，其香气释放总量、醇系香气 总量都有不同程度的提高[30]。β-葡萄糖苷酶不仅对 茶叶增香有显著的效益、在果汁风味的改良和果 酒增香中也有广泛的应用[31]。 1.5 其他酶制剂
还有一些酶类物质可以应用在茶饮料的生产 加工中，葡萄糖氧化酶可作为护色酶应用于茶饮 料生产中，溶菌酶防止茶饮料因微生物污染而引 起的变质，用蛋白酶可降低浑浊度等。宁井铭等 对绿茶饮料护色技术的研究时指出加入一定量的 葡萄糖氧化酶，消耗以部分的游离氧，从而减小 的游离氧，可以使茶汤中茶多酚、维生素、芳香 成分等对氧敏感的物质变得稳定，因而起到了护 色作用[32]。茶饮料中的沉淀除了茶内含成分的作用 之外，也有可能是由细菌等微生物污染而引起的， 加入溶菌酶则可以起到溶菌防腐的作用[33]。茶汤中 添加蛋白酶可分解蛋白质，防止蛋白质的沉降， 提高茶饮料的澄清度[34]。
茶叶多酚氧化酶同工酶热稳定性分析
茶叶多酚氧化酶同工酶热稳定性分析作者：陈盛虎徐小云伍梦瑶黄莹捷姚燕妮黄友谊来源：《湖北农业科学》2017年第01期摘要：对分离纯化得到的龙井43多酚氧化酶同工酶在30～50 ℃下的热稳定性进行了分析，发现多酚氧化酶同工酶PPOⅡ、PPOⅢ在30 ℃时的热稳定性最高，随温度的升高其热稳定性下降；多酚氧化酶粗酶的热稳定在40 ℃时最高，并整体高于多酚氧化酶同工酶的热稳定性。
试验结果给茶叶生产中维持适当的温度来控制多酚氧化酶的活性提供了依据。
关键词：茶叶；多酚氧化酶；同工酶；酶活力；热稳定性中图分类号：S571.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）01-0095-04DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2017.01.024Thermal Stability Analysis on Polyphenol Oxidase Isozymes from Camellia sinensisCHEN Sheng-hu， XU Xiao-yun， WU Meng-yao， HUANG Ying-jie， YAO Yan-ni，HUANG You-yi（Ministry of Education Key Laboratory of Horticultural Plant Biology/Horticulture and Forestry Science College， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）Abstract：The thermal stabilities of the polyphenol oxidase isozymes purified from Camellia sinensis cv. Longjing No. 43 were analyzed at 30～50 ℃，the results showed that the activities of two polyphenol oxidase isozymes PPOII and PPOIII were the highest under 30 ℃，and decreased with the increasing of temperature. The thermal stability of crude polyphenol oxidase was the highest under 40 ℃， and the overall thermal stability was higher than those of polyphenol oxidase isozymes. The experiment results provide a basis for maintaining appropriate temperature to control the activity of polyphenol oxidase in tea production.Key words：Camellia sinensis； polyphenol oxidase； isozyme； enzyme activity； thermal stability多酚氧化酶（Polyphenol oxidase， PPO， EC 1.10.3.1）在茶叶生理代谢及产品加工中具有重要作用。
多酚氧化酶的性质及其在茶叶加工中的研究进展
多酚氧化酶（Polyphenol oxidase ，PPO ）广泛存在于植物、动物、真菌体内，属于氧化还原酶，在广义上根据催化底物酚羟基数量的不同，可分为三大类[1]：单酚氧化酶（酪氨酸酶，EC 1.14.18.1）、双酚氧化酶（儿茶酚氧化酶，EC 1.10.3.1）和漆酶（EC 1.10.3.2）。
植物中的PPO 主要是儿茶酚氧化酶，能够在有氧条件下催化多酚类物质生成对应的醌类。
PPO 在茶叶加工中具有重要作用，通过不同加工工序或工艺抑制或提升PPO 活性，可制备出风味迥异的各类茶。
本文对多酚氧化酶的性质及其在茶叶加工中的研究现状进行了综述，展望其未来的研究方向，以期为深入研究和应用多酚氧化酶提供参考。
多酚氧化酶的性质及其在茶叶加工中的研究进展邹纯，尹军峰*中国农业科学院茶叶研究所，浙江杭州310008摘要：多酚氧化酶是茶叶加工中一类重要的氧化还原酶。
文章归纳了多酚氧化酶的结构性质和酶学性质，重点阐述了其在红茶、绿茶、乌龙茶和黑茶加工中的研究现状，并展望了其未来的研究方向，以期为深入研究和应用多酚氧化酶提供参考。
关键词：多酚氧化酶；茶叶加工；结构性质；酶学性质；应用基金项目：国家自然科学基金青年基金（32002094）、中国农业科学院茶叶研究所基本科研业务费项目（1610212018014）。
作者简介：邹纯，男，助理研究员，主要从事茶深加工与多元化利用研究。
*通讯作者，E-mail ：*****************。
The Properties of Polyphenol Oxidase and ItsResearch Progress in Tea ProcessingZOU Chun,YIN Junfeng *Tea Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou 310008,ChinaAbstract:Polyphenol oxidase is an important oxidoreductase in tea processing.This paper summarized the structural and enzymatic properties of polyphenol oxidase,emphasized its research status in the processing of black tea,green tea,oolong tea and dark tea,and prospected its future research directions,in order to provide a reference for in-depth research and application of polyphenol oxidase.Keywords:polyphenol oxidase,tea processing,structural properties,enzymatic properties,application一、PPO 的结构与性质1.PPO 的结构（1）蛋白结构植物PPO 通常先以无活性的前体形式存在，其典型结构主要分为3个部分：N-末端转移肽、中间铜离子结合区、C-末端疏水区（图1）[2]。
多酚氧化酶的研究进展【文献综述】
文献综述生物工程多酚氧化酶的研究进展摘要：多酚氧化酶广泛存在于各类果蔬植物中，其活性调控对于果蔬加工、保藏及茶叶初加工过程具有重要的作用。
着重归纳了多酚氧化酶的催化活性及其影响因素，结合果蔬抑褐保鲜及茶叶加工的应用实例进行了分类综述，并指出了多酚氧化酶在未来生物技术中的价值空间。
关键词：多酚氧化酶；酶活；抑制剂；褐变；保鲜多酚氧化酶（polyphenol oxidase）是一类广泛存在于植物体内的能催化多酚类氧化成醌类的含铜质体金属酶。
由于多酚氧化酶的酶促褐变与果蔬加工、茶叶品质、组培成功等密切相关，人们很早就开始对它进行深入细致的研究。
本文就多酚氧化酶类型、在植物体内的分布以及多酚氧化酶活性与环境因子间关系的研究进展做一概述。
因此，通过多酚氧化酶学性质研究，为果蔬加工过程控制褐变提供了相对广阔的工业化技术和理想方法。
1 多酚氧化酶简介多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，PPO；氧化还原酶；EC 1.10.3.1），是一类氧化还原酶，其由铜离子辅基和主酶两部分组成，铜离子辅基不可透析。
多酚氧化酶首先由Yoghid在1883年在日本漆树研究过程中发现，1938年KeilinD和MannG在对蘑菇的研究中实现了蘑菇多酚氧化酶的提取和纯化，并将其命名为Polyphenol Oxidase[1]。
由于其与食品加工和蔬菜保鲜与贮藏运输有着密切的关系，之后多酚氧化酶一直是研究的热点，尤其是在其生化、生理学性质方面取得了较大的进展。
多酚氧化酶在有氧条件下能选择性催化酚类羟基化，把其氧化成醌，这一特性使得多酚氧化酶在工业、食品和环境保护等行业得到了广泛的应用，如利用多酚氧化酶来催化氧化儿茶素形成茶黄素及茶饮料中独特的风味物质，烟草中利用其来形成独特的品质，利用固定化多酚氧化酶去除工业污水中的多酚类有毒物质等等。
此外，多酚氧化酶广泛存在于自然界，来源广泛，可以从植物、动物和微生物体内分离得到。
2 多酚氧化酶的分类多酚氧化酶在植物界乃至动物界分布广泛，由于其检测方便，是被最早研究的几类酶之一[2]。
多酚氧化酶酶学特性研究及其应用进展
１ ４ ｐ 值 ． Ｈ
性形式是含铜 的酶单体的寡聚体 ， 因此含 ｃ 的化 ｕ 合物对源于小麦等的 Ｐ Ｏ也有激活效应 ＿ 。 Ｐ 】
此外 ， 金属 离 子能 以不 同的 方式 与底 物 、 的 活 酶 性 产 物和 酶本 身产 生 极 强 的亲 和力 ， 而 导致 酶 活 从 性 的改变 。Ｃ ｎ 和 Ｎ 能 对 酶 活性 产 生抑 制 作 用 ， ａ ａ
致 ， 试 范 围体 系 ｐ 接 近 中性 时 ，Ｐ 受 Ｈ Ｐ Ｏ催 化 活 性 间存在 一定 相关 性 ¨ 。
最 强 。不 同真菌果 实 中 Ｐ Ｏ的活 性变 化均 与 ｐ 之 Ｐ Ｈ １ ５ 储 放 条件 ．
嘉等 ＿研究了香菇 Ｐ Ｏ基于不 同底物 的 Ｋ ６ Ｐ ｍ值 ， 其
１ 影响酶活 的主导 因素
１ １ 来 源 ．
不 同来源的 Ｐ Ｏ对于专一性底物 的亲和力存 Ｐ 在很大差别 ， 部分原 因在于同空间因子相关的酶蛋
状态下 ， 细胞 内多酚氧化酶与细胞器内膜结合 ， 活性 很低 ， 但遭遇外界逆境时，Ｐ Ｐ Ｏ可以增加植物体对病 原体的抗 性…。然而 当组 织完整性破坏 或膜受到
多酚氧化酶的研究现状2
多酚氧化酶的研究现状(2) 多酚氧化酶的研究现状六、PPO的分离纯化PPO通常以不溶状态存在，为使其以可溶形式从完整细胞或组织结构中释放出来，并保持其活性和稳定性，通常要进行充分的细胞破碎，释放出细胞的内含物，经匀浆提取后可得粗酶制剂。
为了减少对细胞活动的影响，需尽量去模拟细胞体内的环境，如适宜的pH(5.6)、温度(37℃)等。
如茶叶中存在大量的多酚类物质，因此在该酶的分离提纯过程中要加入多酚吸附剂，如聚乙烯基吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)等以清除多酚。
多酚氧化酶的分离提纯方法有冷丙酮法和匀浆法二种方法。
须海荣 [23]研究指出：冷丙酮法效果较差，酶活较低，可能跟丙酮引起酶蛋白不可逆变性有关，但其操作相对而言较为方便。
随着酶提取技术的发展，匀浆法逐步得以完善，首先它在酶的提取过程中能最大限度地保留酶的活性，其次能去除多酚氧化酶提取中的一些杂蛋白以及过氧化物酶等一些酶蛋白的影响。
再采取硫酸铵分级沉淀，凝胶色谱等技术，以达到纯化目的。
七、应用前景调节PPO表达是未来研究热点，一方面因为受伤或衰老会导致黑色素的形成，负调节PPO能大量提高作物的质量;另一方面PPO的过度表达能减少害虫对作物的侵害，或通过影响植物蛋白形成抗营养机制，或在毛状体渗出液中通过它启动聚合作用捕获昆虫。
因此负调节PPO表达或调节PPO使其过度表达在生产及应用方面都具有很好的前景及重要的实际意义。
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植物和真菌多酚氧化酶的分子生物学研究进展
植物和真菌多酚氧化酶的分子生物学研究进展摘要多酚氧化酶（PPO）是细胞内酶促褐化反应的主要催化酶类，同时PPO 催化的反应还可应用于多巴药物的生产、含酚污水的净化等方面。
现在已经从多种植物和真菌中分离和克隆了PPO及其基因。
阐述了多酚氧化酶的结构与功能特点，总结了目前已克隆的植物和真菌多酚氧化酶基因，分析其表达特性，并介绍了转基因方面的研究现状。
关键词多酚氧化酶；酪氨酸酶；酶促褐化；基因克隆多酚氧化酶（polyphenol oxidase，简称PPO）是一类普遍存在于植物、动物、真菌和细菌中的金属蛋白酶。
PPO功能包括甲酚酶（Cresolase，EC.1.14.18.1，将单酚氧化为二酚）、二酚氧化酶/儿茶酚氧化酶（catecholase，EC.1.10.3.1，将二酚氧化为醌）。
现在大部分文献将具有二酚氧化酶功能的酶统称为多酚氧化酶，不管是否具有单酚氧化酶的功能[1]。
真菌中研究较多的是酪氨酸酶（tyrosinase）和漆酶（laccase）。
PPO在生物体酶促褐变、体内色素合成的过程中起关键的作用，尤其在果蔬酶促褐变过程中起重要作用。
因此，对PPO及其基因的研究具有巨大的理论和应用价值。
PPO在植物体细胞中定位于类囊体中，而其催化底物位于液泡，所以只有在亚细胞结构遭到破坏时，褐化反应才迅速发生。
近年来，对PPO的研究主要集中在其分布、特性、功能、酶活抑制等方面，对PPO基因的染色体定位、克隆、表达分析及基因转化的研究也屡见报道。
目前已在甘蔗、马铃薯、西红柿、苹果、梨、葡萄、杨树、杏、茶树等植物中克隆了PPO基因。
真菌中最早研究的是双孢蘑菇（Agaricus bisporus）PPO及其基因[2]，近年来在白腐菌Pycnoporus sanguineus、Pycnoporus cinnabarirus等菌种中分离了酪氨酸酶，克隆了酪氨酸酶基因，并对其外源表达做了系统研究[3]。
多酚氧化酶的开发应用是一个具有广阔市场前景的领域。
红茶加工中主要酶类及其活性的研究
其活性与茶黄素的含 量关 年， 我国红茶产量达１ ５ ． ６ ４ 万吨， 增产达１ ８ ． １ ％… 。 红 参与茶黄素的形成过程， 其同工酶的活性 变化与茶黄素的组分消长 茶 的特异品质得益于加工中内含成分发 生的一系列 系密切， 变化， 其加工过程可分为萎凋、 揉捻 （ 揉切） 、 发酵 有密切关系。 多酚氢化酶同工酶中的Ｐ Ｐ ０ １ 、 Ｐ Ｐ ０ ３ 及
பைடு நூலகம்
多， 以氧化还原酶类和水解酶类为主， 还有转移酶、
途 径红茶 ） ｌ ｎ Ｔ中参与色素形成， 尤其参与形成茶红
茶褐 素等物质。 在 发酵 中， 过氧化物 酶的活性 裂合酶、 异构 酶和连 接酶等 。 氧化还原酶 类包括 素、
常成为发酵后期的主要酶， 多酚氧化酶、 过氧化物酶、 超氧化物歧化酶、 醇脱氢 下降较 多酚氧化酶慢， 酶、 脂肪氧合酶等， 水解酶包括／ ３ － 葡萄糖苷酶、 纤维 对红茶品质有重要作用。
、 ｝ 尔 荣
茶的萎调和发酵工序中， 淀粉酶可把淀粉水解成可溶性糖， 降低 淀粉含 量， 产生 的可溶性糖 类物质， 可增加茶汤的甜 度， 对提高红茶的香气、 汤色和滋昧具有一定的影响。 淀粉
／ ］ １ １ １ ８ ． ４ ％一 ４ ７ ． ３ ％， 品 质化 学 鉴评分 增 ／ ］ ｔ ￣ ５ ． ５ ５ － － 『 ． １ ２ 分 】 。 １ ． ７果 胶 酶
Ｐ ０ ５ ， 可能是催化 儿茶索类氧化聚合形成有色产物 和干燥等过程。 发酵是形成红茶的关键工序， 发酵 Ｐ
然而低 分 子量 的Ｐ Ｐ Ｏ ６ 、 Ｐ Ｐ ０ ７ 在揉 捻 中发生的酶促氧化， 使茶叶 中酶与多酚类底物充分 的 主要 酶 蛋 白，
不参与多酚类的氧化 。 作用， 生成茶色素等物质， 使滋味醇厚甜爽。 酶在其 以后完全消失，
多酚氧化酶酶学特性研究及其应用进展
多酚氧化酶酶学特性研究及其应用进展孔俊豪;孙庆磊;涂云飞;陈小强;高玉萍;杨秀芳【摘要】多酚氧化酶广泛存在于各类果蔬植物中,其活性调控对于果蔬加工、保藏及茶叶初加工过程具有重要的作用.着重归纳了多酚氧化酶的催化活性及其影响因素,结合果蔬抑褐保鲜及茶叶加工的应用实例进行了分类综述,并指出了多酚氧化酶在未来生物技术中的价值空间.【期刊名称】《中国野生植物资源》【年(卷),期】2011(030)004【总页数】5页(P13-17)【关键词】多酚氧化酶;酶活;褐变;保鲜;茶叶加工【作者】孔俊豪;孙庆磊;涂云飞;陈小强;高玉萍;杨秀芳【作者单位】中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院,浙江杭州310016;中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院,浙江杭州310016;中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院,浙江杭州310016;中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院,浙江杭州310016;中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院,浙江杭州310016;中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院,浙江杭州310016【正文语种】中文【中图分类】Q554+.1多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase，以下简述为PPO)是核基因编码的铜金属酶，广泛存在于植物体的各类器官或组织中，如花器官、分生组织、叶片、块茎、根中，在伞菌目子实体内含量也较丰富。
在正常状态下，细胞内多酚氧化酶与细胞器内膜结合，活性很低，但遭遇外界逆境时，PPO可以增加植物体对病原体的抗性［1］。
然而当组织完整性破坏或膜受到伤害后，潜在的PPO大量被激活，质体内的多酚类物质在PPO作用下氧化成醌，植物组织的褐变随之发生。
此外，在茶叶加工中，可依据不同的加工工序来协同调控PPO活性从而制成品质与滋味迥异的不同茶类［2］。
1 影响酶活的主导因素1.1 来源不同来源的PPO对于专一性底物的亲和力存在很大差别，部分原因在于同空间因子相关的酶蛋白质结构上的差异。
吴进菊等［3］对多种植物和真菌中PPO的催化活性进行了比较，结果表明，茄子＞双孢蘑菇＞苹果＞梨＞山药＞马铃薯＞芋艿＞香蕉＞莴苣(比酶活)。
多酚氧化酶的制备和性质研究
多酚氧化酶的制备与性质研究10级生物工程（2）第二组1002012025姜文能 1002012022鲍仕伟 1002012011杜敏 1002012002张强 1002012039肖辉摘要：多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）是自然界中分布极广的一种金属蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性。
关键字：多酚氧化酶系统、提取、性质研究多酚氧化酶的简介多酚氧化酶是一种蛋白体，在茶树生命活动和茶叶加工过程中参与一系列由酶促活动而引起的化学变化，故又被称为生物催化剂。
茶叶中的酶较为复杂，种类很多，包括氧化还原酶、水解酶、裂解酶、磷酸化酶、移换酶和同工异构酶等几大类。
酶蛋白具有一般蛋白质的特性，在高温或低温条件下有易变性失活的特点。
各类酶均有其活性的最适温度范围，一般在30C～50℃范围内酶活性最强。
酶若失活、变性，则就丧失了催化能力。
酶的催化作用具有专一性，如多酚氧化酶，只能使茶多酚物质氧化，聚合成茶多酚的氧化产物茶黄素、茶红素和茶褐素等；蛋白酶只能促使蛋白质分解为氨基酸。
茶叶加工就是利用酶具有的这种特性，用技术手段钝化或激发酶的活性，使其沿着茶类所需的要求发生酶促反应而获得各类茶特有的色香味。
如绿茶加工过程中的杀青就是利用高温钝化酶的活性，在短时间内制止由酶引起的一系列化学变化，形成绿叶绿汤的品质特点。
红茶加工过程中的发酵就是激化酶的活性，促使茶多酚物质在多酚氧化酶的催化下发生氧化聚合反应，生成茶黄素、茶红素等氧化产物，形成红茶红叶红汤的品质特点。
多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌。
在广义上，多酚氧化酶可分为三大类：单酚单氧化酶(酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.14.18.1)、双酚氧化酶(儿茶酚氧化酶catechol oxidse,EC.1.10.3.2)和漆酶(laccase,EC.1.10.3.1)。
六堡茶多酚氧化酶及其产生菌对茶叶品质的应用
六堡茶多酚氧化酶及其产生菌对茶叶品质的应用六堡茶是以梧州大叶毛茶为原料,按特定的初制和精制工艺进行加工,具有“六堡香”及红、浓、陈、醇等独特品质特征的黑茶。
发酵(渥堆)是六堡茶品质形成的关键,在高温、高湿度的条件下,微生物生长繁殖,以茶叶为底物发生如催化氧化茶多酚的系列反应。
目前,关于六堡茶多酚氧化酶及渥堆微生物的研究很少,本文将茶叶多酚氧化酶、茶叶理化成分变化及微生物数量联系起来,深入理解渥堆时期六堡茶品质形成的过程;从六堡茶发酵样品中分离纯化得到多酚氧化酶同工酶,对其酶学特性进行研究,为后续酶促合成茶色素优化反应体系建立、酶固定化等领域提供理论指导;除此之外,从六堡茶渥堆样品中分离鉴定出的产多酚氧化酶嗜热菌,被应用于茶叶固体发酵模拟实验,对比无菌、传统及单菌株发酵对茶叶成分的转化效果,进一步说明了六堡茶渥堆时期色、香、味等品质成分形成的机理。
本研究得到的实验结果如下:1、水浸出物是茶汤的主要呈味、呈色物质,它的含量与多酚氧化酶酶活高度正相关(r=0.8776)。
渥堆时期茶叶茶多酚含量从16.6%降至8.2%,随着后期多酚氧化酶酶活升高,茶多酚下降速度加快,而游离氨基酸从40.1mg/g下降至9.9mg/g。
在六堡茶渥堆过程中,茶黄素和茶红素均呈现下降趋势,分别从0.12%下降至0.05%和从5.24%下降至0.74%,茶褐素从2.53%上升至5.77%,分析出现这种变化的原因是多酚氧化酶酶活升高,催化了茶黄素、茶红素的进一步氧化。
另外,六堡茶渥堆过程中的多酚氧化酶酶活与霉菌的数量同样呈高度正相关(r=0.9192)。
多酚氧化酶酶活总体呈上升趋势,但渥堆前毛茶的多酚氧化酶经过杀青工艺已经钝化或失活,推测新的多酚氧化酶可能是由微生物产生。
综上,多酚氧化酶对六堡茶品质形成起着重要作用。
2、对六堡茶多酚氧化酶的提取进行优化,然后将渥堆前后两种茶样的粗酶液进行硫酸铵分级沉淀、选择合适的盐析饱和度、浓缩、经凝胶过滤层析将制得的样品进行SDS-PAGE分析。
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中，通过不同程度地抑制或利用酶活，可加工成品 质与滋味迥异的不同茶类，尤其是在红茶加工过程 中能够催化氧化茶多酚类物质形成茶色素，以及酶 促偶联氧化香气前体物，从而对红茶的色、香、味等 品质作用显著［２＿３］。本文从ＰＰＯ结构分类、同工酶、分 离纯化方法、ＰＰＯ与茶叶品质关系及酶促合成茶黄 素等方面综述茶叶ＰＰＯ及其同工酶研究进展，以期
ｏｆ
Ｔｅａ
ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ，
Ｈｕｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈｃｚ＿４１０１２８） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ
４多酚氧化酶与茶叶品质关系
尤其对提高红茶品质和减轻夏、秋季绿茶的苦涩味 具有特殊作用，被认为是一项投资少、效益高的制 茶新技术。Ｍｉｙｕｋｉｋｉｌ２０＿｜在红茶发酵时添加１％或揉捻 时添加０．００１％的微生物ＰＰＯ，结果缩短了红茶发酵 时间，茶黄素、茶红素含量明显提高，茶汤色泽和香
气明显改善。谭振初［２ｌ将茶幼果的ＰＰＯ酶液应用于
ｓｏｕｒｃｅ，ｅｔｃ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｔｅａ，Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ Ｏｘｉｄａｓｅ，Ｔｈｅａｆｌａｖｉｎｓ，Ｔｅａ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｉｓｏｚｙｍｅ
多酚氧化酶（Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ Ｏｘｉｄａｓｅ，简称ＰＰＯ）是自 然界广泛存在的一种氧化还原酶，由铜离子辅基和 主酶组成，它能够有效的催化多酚类及其衍生物氧 化形成相应的醌类。在茶叶加工、果蔬酶促褐变、食 品医药、环境保护等方面具有重要研究价值和应用 前景［１］。茶叶中多酚氧化酶（邻苯二酚：０：氧化还原 酶，ＥＣ．１．１０．３．１）及其同工酶不仅对茶树生理代谢、
３多酚氧化酶结构
叶绿素、ｖ。等热敏陛品质成分，从而形成绿茶的“绿
汤绿叶”特征。近年来随着微波、超高压、干热风、远
红外辅助等技术用于绿茶杀青，对ＰＰＯ活性进行柔
性钝化，更有利于茶叶理化成分的保留和优良品质
的形成旧。在红茶加工中，萎凋、发酵工序在ＰＰＯ作
用下，利用自身系列酶促氧化反应，将儿茶素类物 质催化氧化形成茶色素类物质。在青茶加工中，ＰＰＯ 酶促氧化多酚类直接引起邻醌的偶联氧化作用，以 多酚类和相关色素形成作为“发酵”特征的化学反
ａｓ
ｏｘｉｄａｓｅ（ＰＰＯ）ｉｓ
ｅｎｚｙｎｌｅ
ｏｎｅ
ｏｆ ｔｈｅ
ｎｌｏｓｔ
ｉｍｐｏｒｔａｎｔ
ｏｘｉｄａｔｉｏｎ—ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｎｌｅ ｉｎ ｔｈｅ
ｔｅａ
ｔｒｅｅ
ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ－ａｎｄ
ｃｕｒｒｅｎｔ
ｔｅａ
ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，
ｔｈｅ ｋｅｙ
ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ
ｅｎｚｙｍａｔｉｃ
ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅａｆｌａｖｉｎｓ
得了电泳纯制品，酶比活力为５００７５．４３Ｕ／ｒａｇ，纯化 倍数达到５９７．９９，回收率０．４８％。Ｊｉｎｓｅｎ Ｘｕｌ２５１采用丙 酮粉法提取板栗ＰＰＯ粗酶，经６０％硫酸铵沉淀、透
万方数据
第２期
滕杰等：茶叶多酚氧化酶及其同工酶的研究进展 茶叶多酚氧化酶对茶叶品质形成至关重要，关 系到茶叶适制性，一般ＰＰＯ含量高、活性强的茶叶 适制红茶，反之适制绿茶。在绿茶加工中，通过高温 杀青破坏酶活性，使成品茶保留较多的茶多酚类、
环境条件、提取方法及ＰＡＧＥ电泳技术有关。王坤 波［９］发现不同来源的ＰＰＯ同工酶在酶带数目、Ｒｆ值 及分子量均有差异，梨的同工酶有１１条，茶叶２ 条，蘑菇５条，苹果４条，漆酶１条。ＰＰＯ的同工酶 酶谱中，一般存在７、８条，多的可达１０条，少的仅 有１、２条。通过ＰＰＯ同工酶可探讨茶树的起源、品 种的早期鉴定、酶促合成茶黄素组分、茶叶加工中 同工酶变化与品质的相互关系等［６１。大多数茶叶 ＰＰＯ同工酶能催化绿原酸氧化，对表没食子儿茶素 没食子酸酯、邻苯二酚氧化尤为显著［７１。刘仲华ＩＳ］从 茶鲜叶中分离出六条同工酶，按照迁移率由小到大 排列依次命名为ＰＰＯ。～ＰＰＯ。，其中ＰＰＯ：、ＰＰＯ。、ＰＰＯ。 对多酚类敏感性较强，其他则相对较弱，酶促氧化 儿茶素各同工酶所起作用也有所差异。ＰＰＯ同工酶 与茶树新梢的发育、代谢也有联系，并能反映新梢 各部位的生理代谢差异与芽叶老化程度。通过茶树 抗逆性与新梢中酶系统多态性之间的关系研究认 为，多酚氧化酶在相对含水量５０％和１１０％时，比 ７０％和９０％时多出现一条新的同工酶，由此推测出 现这种变化可能与茶树的抗旱、抗湿性有关［１０］。
万方数据
１２
第４１卷
酶粉活性尚可、体积小和便于贮存，可直接应用。缓 冲液匀浆液提取活性得率较高，但酶液本身活性较 高，不利于酶的应用，尚需进行浓缩、提纯才能达到 应用要求。另证实丙酮粉法与匀浆法相结合的方法 提取效果更佳。
５．２分离纯化
果、漆酶、蘑菇。在不同品种梨中，丰水梨ＰＰＯ酶活 性最高，合成茶黄素的能力最强。并发现它存在６ 个同工酶，各同工酶比整个酶复合体对底物的专一 性更强，对各种儿茶素或简单酚类的催化氧化速率 不同。因此，获取廉价高效的不同ＰＰＯ酶源用于酶 促合成茶黄素及其组分的制备将会受到更多关注。
ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ．Ｔｈｅ
ｐｒｏｇｒｅｓｓ
ｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｏｆ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ，ｔｅａ ｑｕａｌｉｔｙ－ｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＰＰＯ，ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＰＯ ｅｎｚｙｎｆｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅａｆｌａｖｉｎｓ ａｎｄ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ
ｏｎ
Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ Ｏｘｉｄａｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ Ｓｈｕｏ，ＱＩＮ Ｙｕ，ｕＵ
Ｉｓｏｚｙｍｅ ｏｆ Ｔｅａ
Ｗｅｎ－ｊｕｎ８
ｒＩＥＮＧ Ｊｉｅ，ＦＥＮＧ Ｊｉｎ—ｙｕ，ＸＩＯＮＧ （Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｋｕｎ—ｙａｎ，ＧＯＮＧ Ｚｈｉ—ｈｕａ，ＸＩＡＯ
ＰＰＯ酶促合成茶黄素条件优化 多酚氧化酶酶促反应条件一般受温度、ｐＨ值、
时间、儿茶素组成及浓度、溶氧、酶浓度等因素影 响。在不同体系酶促反应条件下，优化最适反应体 系参数对于获取不同茶黄素组分切实可行。Ｈｉｌｔｏｎｌ３０Ｊ 研究鲜叶中Ｌ—ＥＧＣＧ和Ｌ—ＥＣＧ在一定量的基础 上，Ｌ—ＥＧＣ的含量与ＴＦ的生产量成高度相关，在制 茶中若能增加Ｌ—ＥＧＣ等非酯型儿茶素含量，将使 ＴＦｓ生成量增加，这不仅说明底物浓度对ＴＦｓ总量 的影响，而且也表明了儿茶素单体问不同比例对茶
应被控制在鲜叶局部和一定的变化范围内进行，形
成青茶“绿叶红镶边”特征。在黑茶加工中，湖南农 业大学［１８．１９］发现ＰＰＯ活性由高到无又到活性呈现的 变化规律，通过系统研究加工过程中的ＰＰＯ同工酶 酶带，表明后出现的ＰＰＯ来源于渥堆工艺中微生物 代谢活动分泌的胞外酶，而正是这种胞外酶的作用 铸就了黑茶特有品质。在黄茶和白茶加工中，ＰＰＯ 不同程度的参与催化反应，从而形成各自品质特征。 随着现代生物技术的发展，外源生物酶的添加 技术在茶叶领域中得到良好运用。大量研究表明采
黄素总量也有极大的影响。以儿茶素混合物Ｃ
ｆＥＧＣ＞２００ ｍｇ／ｇ，ＥＧＣＧ＞２００ ｍｇ／ｇ，儿茶素总量＞
Ｓ－２００、羟基磷灰石和
ＦＰＬＣ进行分离纯化，纯化倍数达到３１４，得率 ０．２３％。梁建荣［２ａｊ对甘薯叶采用匀浆法提取ＰＰＯ粗 酶，经硫酸铵分级沉淀、ＤＥＡＥ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ离子交换
层析和Ｓｕｐｅｒｄｅｘ一２００凝胶过滤层析等纯化步骤，获
红碎茶加工，不仅提高红茶茶黄素含量，改善其鲜 强度，而且还为茶果的综合利用开辟了新途径。叶 飞［２２］利用砂梨中多酚氧化酶促进夏秋红茶发酵，使 红茶中苦涩味物质显著减少，同时甜醇类物质显著 增加，降低了５．１提取方法 无论是ＰＰＯ酶分子生物学还是酶工程技术研 究，都要从相应酶源中提取出粗酶液，并进行多级 分离纯化，获得目标纯酶，提取方法一般有丙酮粉 法、匀浆法和匀浆浸提法。综合比较发现丙酮粉法 对ＰＰＯ酶提取活性损失较大，活性得率较低，但其
病害及机械损伤起重要作用，而且在茶叶加工过程
为茶树品种适制性评价、茶黄素及其组分高效制备 以及ＰＰＯ同工酶酶源筛选与利用提供科学依据。
１
多酚氧化酶的分类
多酚氧化酶是由核基因编码，在细胞质中合 成，通过特定的方式转运至质体内而成为具活性的 形式，具有底物专一性。根据多酚氧化酶催化底物 的不同分为问酪氨酸酶（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ，ＥＣ １．１４．１８．１）、儿 茶酚酶（Ｃａｔｅｃｈｏｌａｓｅ，ＥＣ １．１０．３．１）、漆酶Ｌａｅｃａｓｅ，ＥＣ １．１０．３．２）、酚酶（Ｐｈｅｎｏｌａｓｅ）、绿原酸酶ｆＣｈｌｏｒｏｇｅｎｉｅａｅｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ）等。根据底物中酚羟基数目和位置差异又可 分为单酚氧化酶和双酚氧化酶，双酚氧化酶包含的 对苯二酚氧化酶和邻苯二酚氧化酶统称为多酚氧 化酶圈。
ＰＰＯ ｉｓｏｚｙｍｅ ｗｅｒｅ
ｒｅｖｉｅｗｅｄ．Ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｂａｓｉｃ ｆｏｒ
ｔｅａ
ｔｒｅｅ
ｃｕｈｉｖａｒ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅａｆｌａｖｉｎｓ
ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ａｎｄ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ＰＰＯ ｉｓｏｚｙｍｅ ｅｎｚｙｎｌｅ
第４１卷第２期 ２０１４年６月
茶叶通讯
ＴＥＡ ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮ
Ｖ０１．４１．ＮＯ．２ Ｊｕｎｅ，２０１４
茶叶多酚氧化酶及其同工酶的研究进展
滕杰丰金玉熊硕秦昱刘昆言龚志华
肖文军＋ （湖南农业大学园艺园林学院，茶学教育部重点实验室・长沙・４１０１２８）
摘要：多酚氧化酶（ＰＰＯ）是茶树生理与茶叶加工中的一类重要氧化还原酶，也是茶黄素及其组分酶促合成中的关键酶。从 ＰＰＯ结构分类、同工酶、ＰＰＯ与茶叶品质关系、ＰＰＯ分离纯化及酶促合成茶黄素等方面进行综述，以期为茶树品种适制性评价、 茶黄素及其组分高效制备以及ＰＰＯ同工酶酶源筛选与利用提供科学依据。 关键词：茶叶；多酚氧化酶；茶黄素；分离纯化；同工酶